一种衣壳蛋白组装抑制剂的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种衣壳蛋白抑制剂在制备抗艾滋病药物中的应用。

背景技术：

人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)是艾滋病(acquiredimmunodeficiencysyndrome,aids)的病原体。hiv主要有2种亚型：hiv-1和hiv-2，后者具有更高的毒力和传染性，导致了全球大多数国家的hiv感染。艾滋病是全球最为致命的传染性疾病之一，目前仍无法治愈。30年来，经美国fda批准上市的抗hiv-1药物多达30余种，这些药物的联用(亦被称为高效抗逆转录病毒疗法)更是使得艾滋患者的死亡率大幅下降，寿命得到了极大延长，艾滋病甚至已经被“驯服”成一种慢性传染性疾病。然而，由于存在患者依从性差、药物副作用大和耐药性病毒株等诸多问题，使得艾滋病治疗的效果大打折扣。因此，寻找具有优良特点(比如毒副作用小、便于给药和耐药基因屏障高)的新一代抗hiv-1药物显得非常必要。

hiv-1为逆转录病毒，将rna和重要的病毒蛋白包裹于衣壳中是该类病毒的重要特征。衣壳由衣壳蛋白(capsidprotein,ca)组装而成。近年来，人们逐渐认识到hiv-1衣壳在病毒复制过程中并非是一个“小角色”，而是一个重要的“多面手”：参与病毒的逆转录；病毒基因组的核输入及整合；防止固有免疫效应器的激活[campbellem,hopetj.hiv-1capsid：themultifacetedkeyplayerinhiv-1infection.natrevmicrobiol,2015,13(8):471-483.]。病毒衣壳的组装和稳定性均会影响hiv-1病毒分子的自我复制和感染性，因此，衣壳蛋白成为潜在的药物作用靶点。目前，已经有研究报道了若干靶向ca蛋白的抑制剂，只有gileadsciences宣布他们开发的ca蛋白抑制剂gs-ca1进入了临床一期试验[hilditchl，towersgj.amodelforcofactoruseduringhiv-1reversetranscriptionandnuclearentry.curropinvirol,2014,4:32-36.]。尽管没有一种ca蛋白抑制剂被批准用于临床，但是这些已经发现的ca抑制剂却有力的证明了ca蛋白是开发抗病毒药物的有效靶点。此外，与hiv-1病毒的其它蛋白相比，ca蛋白序列相对保守。通过构建单点氨基酸残基突变库发现，70％的ca残基在发生突变后，会导致病毒丧失感染性，ca蛋白表现出极度的遗传脆弱性(geneticfragility)[perrierm,bertinem,lehingratq,etal.prevalenceofgagmutationsassociatedwithinvitroresistancetocapsidinhibitorgs-ca1inhiv-1antiretroviral-naivepatients.jantimicrobchemother,2017,72(10):2954-2955.]。ca的遗传脆弱性能在一定程度上降低耐药性的出现，也提示我们在寻找ca抑制剂的时候，应重点关注ca蛋白遗传脆弱性最为严重的位点。综上所述，ca蛋白是一个理想的药物作用靶点，寻找hiv衣壳蛋白抑制剂，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种衣壳蛋白抑制剂在制备抗艾滋病药物中的应用。本发明的技术方案如下：

一种衣壳蛋白组装抑制剂的应用，具体为，在制备抗艾滋病药物中的应用，所述抑制剂为式ⅰ化合物(tx-1918)或其药学上可接受的盐：

优选地，所述艾滋病为感染1型人免疫缺陷病毒所导致的获得性免疫缺陷综合征。

进一步地，所述抗艾滋病药物为人类免疫缺陷病毒衣壳蛋白组装抑制剂。

进一步地，所述抗艾滋病药物为式ⅰ化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的载体制成的药物。

优选地，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂。

进一步地，所述药学上可接受的盐为式ⅰ化合物与无机酸或有机酸形成的酸加成盐。

优选地，所述无机酸为盐酸、磷酸或硫酸中的一种或多种；所述有机酸为醋酸、马来酸、枸橼酸、苯磺酸、甲基苯磺酸、富马酸或酒石酸中的一种或多种。

本发明的有益效果：

本发明首选测定了化合物tx-1918抑制剂阻断衣壳蛋白c端(ca-ctd)与多肽cai之间相互作用的活性，确定了化合物tx-1918阻断该相互作用的半数抑制浓度(ic50)；其次衣壳蛋白体外组装实验表明，该化合物tx-1918能明显抑制衣壳蛋白的体外组装。最后，还测定了抑制剂化合物tx-1918对hiv-1病毒复制的影响，结果表明该抑制剂具有抑制hiv-1病毒复制的能力，并且明显抑制p24蛋白的产生，可以作为新的抗艾滋病药物进行开发。

附图说明

图1为实施例1中化合物tx-1918对ca-ctd与cai相互作用的抑制活性测定曲线图。

图2为实施例2中化合物tx-1918对hiv-1衣壳蛋白体外组装的活性测定曲线图。

图3为实施例4中化合物tx-1918抑制p24蛋白表达的westernblotting测定结果图。

具体实施方式

下面将结合附图及其具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：化合物tx-1918抑制ca-ctd与cai相互作用实验

实验原理：当n端带有gst标签的ca-ctd(记作gst-ca-ctd)和生物素化的多肽cai在溶液中相互作用时(空间距离小于10nm)，streptavidin-xl665受体微珠、anti-gst-cryptate供体微珠也会相应靠近，从而发生共振能量转移(fret)现象。供体磁珠荧光分子的激发将诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。当抑制剂分子阻断in分子间的二聚化作用时，fret现象减弱。因此，fret信号的强弱可以反映抑制剂分子对两个蛋白相互作用抑制作用的强弱。

实验试剂的准备：在原核体系中，可溶性表达纯化n端融合谷胱甘肽s转移酶(glutathiones-transferase)的衣壳蛋白c端(ca-ctd)。合成无修饰的多肽cai以及生物素标记的多肽cai(bio-cai)。用于htrf实验的试剂：铕标记的谷胱甘肽s转移酶单克隆抗体微珠(eu³⁺cryptateconjugatedmousemonoclonalantibodyanti-glutathiones-transferase)和链霉亲和素标记的xl665微珠(xl665-conjugatedstreptavidin-xl665)，均购买自法国浠思公司(cisbioassays)。

实验步骤：反应在384孔板中进行，将以下成分加入板孔中：30nmgst-ca-ctd、60nmin-his6、化合物tx-1918(即式ⅰ化合物)、反应buffer，混匀。室温，200rpm，反应2h。将0.45nm的eu³⁺cryptateconjugatedmousemonoclonalantibodyanti-glutathiones-transferase和10nm的xl665-conjugatedstreptavidin-xl665加入板孔，室温反应1h。使用珀金埃尔默仪器有限公司(perkinelmerlifesciences)的多功能酶标仪envision2102multilabelreader，以320nm为激发光，读取665nm和615nm处的发射光，测试数据是根据两束不同波长光的信号比计算得到：(signal665nm/signal620nm)*10000。

实验结果：如图1所示，化合物tx-1918的起始浓度为50μm，倍比稀释至0.024μm，进行抑制ca-ctd与多肽cai相互作用的活性检测，结果表明化合物tx-1918的半抑制浓度ic50为3.91μm，说明化合物tx-1918对ca-ctd与多肽cai的相互作用有较强的抑制作用。

实施例2：化合物tx-1918对hiv-1衣壳蛋白体外组装的活性测定实验

实验原理：在体外，当盐离子浓度(nacl)大于1mol/l，并且衣壳蛋白浓度大于1mg/ml，衣壳蛋白会在ph＝8.0的磷酸盐缓冲液中自发组装。此时连续检测样品在350纳米处的吸收光，可以得到一条吸光度曲线。

实验步骤：ca的浓度为50μm，按照ca:tx1918分别为1:0.5，1:0.25，1:0.1的质量比混合ca与tx1918，然后加入终浓度为2m的nacl溶液引发ca组装。同时设置不加化合物tx-1918，只加磷酸盐缓冲液的阴性对照组；设置不加化合物tx-1918，只加2mnacl溶液的阳性对照组；设置只加dmso的空白对照组。

实验结果：如图2所示，随着化合物tx-1918浓度的增大，其抑制ca组装的作用越来越强，说明该化合物在体外能够有效抑制ca的组装。

实施例3：化合物tx-1918的细胞毒性及抑制hiv活病活性测定实验

实验步骤：将mt-4细胞50μl/孔接种到含有100μl/孔梯度倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后加入50μl的hiv-1iiib稀释上清，1300tcid50/孔，设3个重复孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔，azt(抗艾滋药物)为阳性药物对照。37℃，5％co2培养3天，收集细胞，采用elisa的方法测定p24蛋白含量(p24蛋白即为hiv-1衣壳蛋白，可以作为衡量病毒粒子数量的指标)。简单的说就是利用双抗夹心法测定每个孔内p24蛋白产生的量，计算小分子抑制hiv-1病毒p24蛋白产生的ic50值。

实验结果：如表1所示，化合物对于正常细胞的cc50值为23.65μm，抑制病毒复制的ec50值为3.16μm，说明化合物tx-1918能够明显抑制病毒的复制，而对正常细胞的毒性很小。

表1

实施例4：化合物tx1918影响ca蛋白表达的测定实验

实验步骤：将mt-4细胞按50μl/孔接种到含有100μl/孔梯度倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后加入50μl的hiv-1iiib稀释上清，1300tcid50/孔。设3个重复孔。同时设置不含药物只含dmso的正常细胞对照孔，idv为阳性药物对照。37℃，5％co2培养3天，收集细胞。裂解细胞，进行westernblotting实验。使用辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗p24蛋白单克隆抗体及其底物tmb显色，曝光，拍照。

实验结果：如图3所示，随着化合物tx-1918浓度的增加，p24蛋白的表达受到明显抑制，说明hiv-1病毒的复制受到小分子的明显抑制。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。