EPS8L1基因在抑制卵巢癌治疗中的应用的制作方法

本发明涉及肿瘤生物治疗
技术领域：
，具体涉及eps8l1基因在抑制卵巢癌治疗中的应用。
背景技术：
：卵巢癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一，其发病率在妇科恶性肿瘤中排名第三，但死亡率却位居妇科肿瘤之首，其中85-90％为上皮性卵巢癌。究其原因是上皮性卵巢癌的高转移倾向和治疗过程中化疗耐药所导致的复发。约70％的卵巢癌患者在就诊时已是晚期，又有70％的患者在治疗后复发，需要再次手术和化疗。因此，卵巢癌严重危害着女性的健康，治疗过程中沉重的经济负担使很多家庭因病致贫。转移是上皮性卵巢癌最重要的生物学特征，也是导致患者死亡的主要原因。有文献报道，根据国际妇产科协会(figo)分期，ⅰ期的卵巢癌患者五年生存率可达90％左右，ⅱ期患者仍有60-80％的五年生存率，但是发生转移的ⅲ和ⅳ期患者，五年生存率锐减为2-35％。因此，临床分期一直被认为是影响上皮性卵巢癌预后的最重要因素之一。肿瘤播散、转移的范围越广、临床分期越晚、患者的生存率越低。上皮性卵巢癌的转移除了以腹腔种植为主的转移外，还有经脉管系统的转移，前者可刺激产生腹水，是上皮性卵巢癌发生转移的特征。肿瘤转移是一个多步骤的癌细胞与宿主细胞间相互作用的连续过程。细胞的上皮-间质转化(epithelial–mesenchymaltransitions，emt)、迁移是肿瘤转移的基础，涉及肌动蛋白细胞骨架重组的复杂过程。细胞迁移由几个循环往复的步骤组成，即头部伪足形成和延伸、新粘附位点的建立、胞体的收缩及尾部的退缩，细胞通过不断重复这个过程，逐渐向前移动。对这一过程精确调控的分子机制非常复杂，涉及细胞内多条信号转导通路，包括多种癌基因的活化和抑癌基因的失活。研究较多的癌基因有ras、myc、src、egfr、erbb2、ctnnb1等，研究较多的抑癌基因有p53、pl6、p21、pten、runx3、mdm2、fhit等。但在临床实践中，这些分子标记物在预测卵巢癌转移方面的作用仍然十分有限。因此，如果能发现及研究卵巢癌细胞发生转移的关键分子及相关机制，不但能为寻找预测卵巢癌患者发生转移风险的生物标记物提供科学依据，更有望为已经发生转移的患者提供可能的干预靶点，以阻断肿瘤的浸润转移、控制腹水生成，提高生存质量，延长生存时间，改善上皮性卵巢癌患者的预后。利用二代测序技术对31例上皮性卵巢癌患者的肿瘤和正常卵巢组织进行转录组测序(rna-seq)，通过生物信息学分析rna-seq数据，发现了4908个差异基因(foldchange＞2，p＜0.05)，建立了一个云南地区上皮性卵巢癌差异rna数据库。其中表皮生长因子受体通路底物8相关蛋白1(epidermalgrowthfactorreceptorpathwaysubstrate8-relatedprotein1,eps8l1)在上皮性卵巢癌组织中较正常卵巢组织上调了20.266倍，且该基因在两组样本(癌vs正常组织)中的表达一致性较高，通过文献检索和数据库比对，我们推测eps8l1可能与肿瘤的转移和侵袭有关，目前国内外尚无eps8l1基因在卵巢癌中的相关报道。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了eps8l1基因在抑制卵巢癌治疗中的应用。具体技术方案为：eps8l1基因，其特征在于，所述eps8l1基因的shrna序列如seqidno:1，seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:7。优选的，所述eps8l1基因在抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭和转移中的应用。优选的，所述eps8l1基因敲低后，上皮性卵巢癌细胞对紫杉醇、阿霉素、顺铂、卡铂ic50值降低，敏感性增强。有益效果：运用基因编辑技术构建了eps8l1过表达和敲低质粒，经慢病毒转染上皮性卵巢癌细胞株es-2，初步探索了eps8l1基因过表达/敲低后对es-2细胞功能的影响，eps8l1基因敲低后，es-2细胞的增殖能力下降，细胞生长平台期提前；eps8l1基因过表达后，细胞的迁移能力增强。eps8l1基因敲低后，卵巢癌细胞对紫杉醇、阿霉素、顺铂、卡铂ic50值降低，敏感性增强，eps8l1基因敲低后，es-2细胞对紫杉醇、阿霉素、顺铂ic50值降低，敏感性增强；eps8l1基因敲低后，es-2细胞对卡铂ic50值降低，敏感性增强。实现eps8l1基因在抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭和转移，提高患者的生存率。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为eps8l1基因敲低后对es-2细胞功能的影响；图2为eps8l1基因过表达后对es-2细胞功能的影响；图3为eps8l1基因敲低后对紫杉醇、阿霉素、顺铂敏感性的影响；图4为eps8l1基因敲低后对卡铂敏感性的影响。具体实施方式下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1一、沉默eps8l1体系的建立，利用rnai干扰技术沉默eps8l1基因的具体方法如下：感染预实验1、确认合适的感染条件，按照不同培养基条件将实验分为4组：a组：常规培养基，观察常规培养基条件下病毒对细胞的感染效果；b组：常规培养基+polybrene组，观察polybrene是否可以提升感染效果；c组：eni.s.组，观察用eni.s.替代常规培养基时病毒对细胞的感染效果；d组：eni.s.+polybrene组，观察polybrene和eni.s.条件下病毒对细胞感染效果；control组：监控实验过程中细胞生长是否正常。day1:接种细胞用完全培养基制备2ml密度为3～5×104个/ml的细胞悬液，取100μl/孔加入96孔板中，共15个孔，其中3个孔作为control组，继续培养。day2：感染用eni.s.将慢病毒一次稀释成1×108tu/ml,1×107tu/ml,1×106tu/ml,各50μl。用eni.s.将polybrene稀释成50μg/ml,共200μl，标记为p(e)；用常规培养基将polybrene稀释成50μg/ml,共200μl，标记为p(m)吸掉各孔中上清液，按照表1加入相应体积的溶液，混匀，继续培养。感染12h换回常规培养基，过程中观察细胞形态，保持细胞正常生长。day3～4：继续培养中途可根据细胞的生长状况进行换液，保持细胞活性。day5：感染效果确认感染约72h，荧光表达丰度较高时，用显微镜观察。感染效率80％左右，且细胞生长良好的组所对应的感染条件和moi即可以作为后续感染实验的依据。表1为感染预实验实验分组和感染条件；表1感染正式实验day1:接种细胞用完全培养基制备密度为3～5×104个/ml的细胞悬液，并根据表2接种相应的细胞数到培养板中。day2:感染1.按照预实验结果，并参考表2中的体积更换相应培养基。如需添加polybrene，请保持终浓度5μg/ml，表2为接种和病毒感染时感染体积；2.根据表3加入相应的病毒，或按公式计算：病毒体积＝(moi×细胞数目)/病毒滴度，表3为1×108tu/ml病毒感染细胞所用的病毒量参考；3.按照预实验感染后换液时间，更换为常规培养基，继续培养；day3～4：继续培养；中途可对细胞换液，保持细胞活性；day5：观察感染效率；表2底面积接种面积换液体积96孔板0.3cm2100μl100μl48孔板0.6cm2200μl200μl24孔板2cm2500μl500μl12孔板4cm21ml500μl6孔板10cm22ml1mlt25孔板25cm25ml2.5ml表3沉默eps8l1体系的验证一、qrt-pcr检测mrna的表达1.1细胞总rna提取①(贴壁细胞)取对数生长期细胞(或者密度约80-90％时)，pbs清洗2-3遍，1ml胰酶消化完全后，取2倍体积完全培养基终止消化，移入15ml离心管，800rpm离心5min，弃上清，加入1mlpbs置于冰上，拿出细胞间；超净台上用pbs混悬细胞，移入1.5mlep管中，1000rpm离心5min，弃上清；(可重复一次)(悬浮细胞)取对数生长期细胞(或者密度约80-90％时)，移入15ml离心管，800rpm离心5min，弃上清，加入1mlpbs置于冰上，拿出细胞间；超净台上用pbs混悬细胞，移入1.5mlep管中，1000rpm离心5min，弃上清；重复一次；②加1mltrizol，充分吹打混匀，冰上放置10min使其充分裂解，以利于核蛋白复合物完全分离(也可放入-80℃冻存40分钟后取出，冻融过程有助于充分裂解细胞，分离蛋白和rna)。注意：样品体积不应超过trizol体积的10％；③按1mltrizol加200ul氯仿，振荡混匀，冰上放置15min,不要用涡旋振荡器，以免将mrna振断。④4℃12000g离心15min,离心后混合物分三层：下层红色苯酚-氯仿层，中间白色蛋白质层，上层无色水样层。用移液枪转上层水相400ul于另一干净1.5mlep管中。注意：不要吸取中间层物质，否则会出现蛋白质污染。⑤加等体积异丙醇400ul,轻轻颠倒混匀，冰上放置10min。如果没有明显沉淀，可以-20℃过夜。⑥4℃12000g离心10min弃上清，管底白色沉淀即为总rna。⑦按1mltrizol加入1ml75％乙醇(枪头切勿触及沉淀)，悬浮沉淀，轻轻颠倒洗涤，将残留的盐洗净。4℃7500g离心5min，小心弃去乙醇。重复乙醇洗一次。注意：一定让沉淀浮起来，然后放1-2min，让酒精充分接触沉淀，充分溶解有机试剂，然后再离心。⑧室温干燥5-10min，使乙醇挥发，但不能让rna沉淀完全干燥，那样会降低它的可溶性。25uldepc处理过的超纯水溶解rna样品，50℃孵育10min可促进rna溶解。待rna沉淀完全溶解后，-80℃保存。2.2检测rna纯度及定量用紫外分光光度仪测定提取的rna在260nm与280nm波长处吸光度的比值(a260/a280)，判断rna样品的纯度，a260/a280值在1.7-2.0之间视为抽提的rna样品的纯度很高。原理在于：核酸在紫外光260nm波长时有一吸收峰，而蛋白质的吸收峰在280nm，a260/a280与1.7-2.0相比，如果偏小表明有蛋白质，苯酚污染，如果偏大，说明有异硫氰酸胍残存。按1od260相当于40ug/ml来计算待测样品中总rna的量，以下为计算样品中rna浓度的公式：rna浓度(ug/ml)＝od260值×40×稀释倍数。测定rna浓度后立即进行琼脂糖凝胶电泳，剩余样品-80℃保存备用。2.3逆转录合成第一链cdna2.3.1模板rna准备(1)trizol法提总rna(2)去除基因组dna(3)rna完整性鉴定(4)rna量：0.1ng—5ug总rna或1ng—500ngpoly(a)mrna用于合成cdna。2.3.2逆转录合成第一链cdna步骤2.3.2.1建立20μl的反应体系可以用于逆转录1ng-5μg总rna。在冰上配置如下反应液：混合物在65℃加热5min后，迅速置于冰上冷却。短暂离心后，加入以下成分：2.3.2.2.轻轻吹打混匀并短暂离心；2.3.2.4.置于42℃孵育60min；2.3.2.5.70℃加热5min终止反应。2.3.2.6逆转录产物cdna保存至-20℃冰箱。2.3.3准备pcr反应体系1、根据反应体积准备适当量的试剂标准模式下，每个引物的量通常在150-400nm。如果使用stepone或者steponeplusreal-timepcr系统，每个引物量应≤200nm。快速模式(384-wellplate)下，在推荐范围内提高引物浓度(e.g.400nm)。如果使用stepone或者steponeplusreal-timepcr系统，每个引物量可用300-400nm。2、充分混匀各个组分，然后短暂离心，收集管壁液体并去除气泡。3、将每个反应适当的体积移入各个孔内。4、盖上盖子，短暂离心，收集管壁液体并去除气泡。注意：反应体系建立后可在室温下最长放置的72h再进行pcr反应，但要注意避光。2.3.4运行pcr反应在pcr仪上进行热循环，运行之前认真阅读仪器的使用手则，有助于根据实验条件设置程序。1、将反应板放入仪器。2、根据下面表中引物的熔炼温度设置默认的热循环条件：*anneal退火温度根据引物的熔点tm来设置3、设置仪器执行默认的解离步骤。注意：如果反应体系置于避光处，溶解曲线在pcr完成后72小时仍然可以绘制；如果是暴露于阳光，不超过24小时仍可绘制。4、根据反应体系设置适当的反应体积。5、运行程序。2.3.5分析结果本实验采用△△ct相对定量法检测目的基因的转录变化。在应用△△ct法进行定量之前，做可行性试验来验证目的基因与内参扩增效率基本相等，以homoactb(β-actin)为内参，进行一系列荧光rq-pcr反应，反应体系及反应条件如上所述。上述反应结束，可由软件分析扩增曲线和产物熔解曲线，根据目的基因和内参基因的ct值，采用相对定量的方法计算目的基因的相对表达量，计算公式为：f＝2-△△ct，δct目的基因＝ct目的基因－ct同一样本内参基因；δδct目的基因＝实验组δct目的基因－δct对照组目的基因，用2-△△ct所计算的相对表达量表示待测样本中目的基因的转录量相对对照样本中目的基因转录量的倍数。采用microsoftexcel2007软件计算实验组目的基因相对于对照组目的基因的变化倍数。二、westernblot检测目标蛋白的表达1、实验方法1.1细胞总蛋白提取①取对数生长期肿瘤细胞，常规消化制成单细胞悬液。②14,000×g，离心5min，收集细胞，并用预冷pbs洗涤细胞，14000×g，离心5min，重复2次；最后一次将细胞移入1.5mlep管中。③将细胞置冰浴，小瓶细胞(25cm2)每管中加入80μlripa/pmsf裂解,大瓶细胞(75cm2)每管中加入100μlripa/pmsf裂解液，冰上孵育约30min，间断震荡5-6次，使细胞充分裂解。④将细胞裂解液放至-80℃冰箱保存备用(至少过夜)。⑤冰上解冻细胞裂解液，超声破碎仪进一步破碎细胞，20％功率，5s/20s，15次，4℃14000×g，离心30min。⑥收集上清液，测定蛋白浓度。1.2样品制备1.2.1bca试剂的配制试剂一应用液的配制：取试剂一粉针1支与试剂一稀释液1瓶混匀，溶解完全后4℃待用。工作液的配制：试剂一应用液：试剂二＝50：1的比例配制，混匀后待用。终止液应用液的配制：去终止剂储备液(试剂三)用三蒸水5倍稀释后备用，4℃冷藏。1.2.2按下表配制待测样品(按说明书各用量均×0.4)漩涡混匀，静置5分钟，波长562nm，光径0.5cm，三蒸水调零，用酶联免疫检测仪通过比色皿测定各管吸光度值。计算公式：总蛋白浓度(ug/ml)＝(测定od值-空白od值)/(标准od值-空白od值)×标准品浓度(563ug/ul)×样品测定前稀释倍数样品制备时将总蛋白浓度的单位换算为ug/ul。1.2.3样品制备一般上样质量为20～50μg/孔；上样体积为5～20μl/孔；配置样品时将样品质量和体积都固定(例：设定质量为30μg/孔，体积以最低浓度作比，loadingbuffer(6×)占1/6体积；蛋白体积＝30μg/测定浓度，所得体积不足的，用ripa/pbs补足)样品配置完毕后95度变性15分钟；变性完毕后上样(或4度冰箱保存一周，长期保存置于-20℃/-80℃)。2.sds-page电泳和westernblot分析2.1实验准备①洗涤剂清洗玻璃板，用双蒸水冲洗一遍后，用75％乙醇喷洒玻璃板和上样梳，60°烤箱烘干备用。②配制1×tris-甘氨酸电泳缓冲液：3.03gtris，18.8g甘氨酸，1gsds，三蒸水定容至1l，可以提前配置常温保存。③配制10％过硫酸铵(aps)：0.1g过硫酸铵，加三蒸水至1ml。4℃保存一周，-20℃长期保存。④配制膜转移缓冲液：甘氨酸14.26g，tris3.03g，200ml甲醇(20％)，ph8.3，定容至1l。可先配制成10x(不加甲醇)溶液保存，电泳时加入甲醇，注意一定要预冷。(如目的蛋白分子量大于80kda，则加入终浓度为0.1％的sds)2.2配胶(李记ezproteinanykdpage蛋白电泳试剂盒)①取2个小烧杯，第一个小烧杯中加入浓缩胶a液1ml+浓缩胶b液1ml；另一个烧杯中加入分离胶a液2.5ml+分离胶b液2.5ml；②在5ml分离胶中加入10％aps50ul，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡；③在凝胶模具中灌入混匀的分离胶，液面距玻璃板顶端1.5cm；④在2ml浓缩胶中加入10％aps20ul，轻轻搅拌使其混匀后直接灌入分离胶上层(不需要等待分离胶凝固)；⑤将梳子插入分离胶，静置10-15分钟，等待凝胶聚合。2.3电泳①将胶板放入电泳槽，根据胶的数量，加入相应体积的1x电泳缓冲液，小心拔出梳子；②取已经变性好的各受试组蛋白样品，向上样孔中顺序加入各组样品10ul/孔；两侧分别用4μl/8μl的预染marker封边。③电泳300v恒压下电泳30分钟，可见溴酚蓝到达分离胶底部约0.5cm处终止电泳；2.4转膜①剪膜：电泳快结束时准备pvdf膜(6cm×8cm)，保证膜面积比所要切得胶大，确保转膜成功；②活化：pvdf膜用甲醇浸泡活化约1min后，和滤纸一起放入预冷的转移缓冲液中浸泡15min；③切胶：电泳结束后，将压缩胶和溴酚蓝以下部分切除；④转膜：湿转法：剪2张比膜略小的滤纸，放入转移液浸泡后，按转移装置：负极板--海绵垫--滤纸2张--胶--pvdf膜--滤纸2张--海绵垫--转移装置正极板的顺序放好各层，并用玻璃棒赶走气泡，将此装置放入转移槽里，让负极板靠近负极，正极板靠近正极，4℃350ma100v下电泳120min；(转膜时间＝蛋白分子量)转膜结束，发现预染marker条带已转染到膜上，胶上没有残留的条带。将膜放入tbst中，准备进入下一步，注意不能让膜干燥。2.5封闭①配制10％脱脂奶粉：3g脱脂奶粉加入30mltbst中，震荡混匀，摇床震摇30分钟，每张膜15ml；②将膜放入塑封袋，10％脱脂奶粉封闭，室温中摇床振摇2h。2.6孵育一抗①封闭结束后，把塑封袋剪开，倒掉封闭液；根据蛋白分子量，对应marker条带，将pvdf膜裁成不同条带放入相应漂洗盒；②tbst洗膜3次，每次5min；③结合一抗，摇床振摇，4℃过夜；2.7孵育二抗①tbst洗膜4次，每次8min；②结合二抗，室温摇床振荡2h；2.8显影①tbst洗膜4次，每次8min；②将ecl发光液a液和b液按1:1的比例配比(避光保存)一张膜可配500ul，充分混合，将pvdf膜铺展在用ecl发光液润湿的发光成像系统载物台上，转入fce化学发光成像系统中进行曝光处理，并观察拍照，使用软件imagej对结果进行灰度分析。实施例2二、检测eps8l1基因沉默上皮性卵巢癌细胞的侵袭和转移能力：实验方法(1)mtt法检测细胞增殖能力：将处于对数生长期的卵巢癌亲本细胞株，卵巢癌eps8l1敲除组和eps8l1过表达组分别加入1ml含有0.25％edta的胰蛋白酶消化液消化细胞，收集于离心管中，以800rpm离心5min。倒去上清液，加入适量完全培养基后吹打混匀，制备单细胞悬液计算数量及活率。以2×104个/ml的细胞密度接种于96孔板，37℃、5％co2培养箱中连续孵育24/48/72/96/120/148/172小时后，每孔加入20μlmtt溶液,继续孵育4h后终止培养，弃去上清液，每孔加入100μldmso，，使mtt蓝紫色结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪于570/630nm处检测各孔的吸光值(od值).以培养时间为横轴，吸光值为纵轴，检测细胞倍增时间，并绘制生长曲线图。(2)实时无标记细胞分析仪检测细胞迁移能力：取对数生长期eps8l1不同表达程度的各组卵巢癌细胞，细胞计数后调整细胞密度，以5×104/ml接种迁移板上层孔板中，下层加入无细胞完全培养基，拼接迁移板后，放入细胞分析仪检测卡位，放置5％co2培养箱内进行160小时的持续检测。(3)eps8l1基因敲低后对es-2细胞药物敏感性的影响。以mtt法检测化疗药物(紫杉醇、阿霉素、顺铂、卡铂)对细胞增殖的影响。取处于对数生长期的细胞，常规消化制成单细胞悬液并计数，调整为5×104/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板，90μl/孔，37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养24h待细胞贴壁后，加入等比受试浓度的化疗药物。药物受试浓度设置为0.01，0.1，1，10，100μg/ml，每个浓度设6个平行复孔，10μl/孔。阴性对照为等体积溶媒对照。加药后继续置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱培养48h和72h后，每孔加入mtt(5mg/ml)20μl，继续培养4h后吸取上清液，注意不要将甲臜结晶吸掉，之后每孔加入100μldmso熔解还原产物甲臜，用酶标仪在570nm、630nm双波长下测定各孔的od值。实验结果1.运用基因编辑技术构建了eps8l1过表达和敲低质粒，经慢病毒转染上皮性卵巢癌细胞株es-2，初步探索了eps8l1基因过表达/敲低后对es-2细胞功能的影响。(1)细胞增殖能力的变化图1，eps8l1基因过表达/敲低后对es-2细胞功能的影响。eps8l1基因敲低后，es-2细胞的增殖能力下降，细胞生长平台期提前；(2)细胞迁移能力改变图2，beps8l1基因过表达后，细胞的迁移能力增强。2.eps8l1基因敲低后，对es-2细胞药物敏感性的影响。图3，eps8l1基因敲低后，es-2细胞对紫杉醇、阿霉素、顺铂ic50值降低，敏感性增强图4，eps8l1基因敲低后，es-2细胞对卡铂ic50值降低，敏感性增强。序列表<110>昆明医科大学<120>eps8l1基因在抑制卵巢癌治疗中的应用<130>2018<160>14<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>58<212>dna<213>artificialsequence<400>1ccgggacccagttgagaaacagctactcgagtagctgtttctcaactgggtctttttg58<210>2<211>58<212>dna<213>artificialsequence<400>2aattcaaaaagacccagttgagaaacagctactcgagtagctgtttctcaactgggtc58<210>3<211>58<212>dna<213>artificialsequence<400>3ccgggaggtggaaatggaggtcattctcgagaatgacctccatttccacctctttttg58<210>4<211>58<212>dna<213>artificialsequence<400>4aattcaaaaagaggtggaaatggaggtcattctcgagaatgacctccatttccacctc58<210>5<211>58<212>dna<213>artificialsequence<400>5ccgggacgacgtagagagctttgtactcgagtacaaagctctctacgtcgtctttttg58<210>6<211>58<212>dna<213>artificialsequence<400>6aattcaaaaagacgacgtagagagctttgtactcgagtacaaagctctctacgtcgtc58<210>7<211>58<212>dna<213>artificialsequence<400>7ccgggcctctgcagatgattgtgaactcgagttcacaatcatctgcagaggctttttg58<210>8<211>58<212>dna<213>artificialsequence<400>8aattcaaaaagcctctgcagatgattgtgaactcgagttcacaatcatctgcagaggc58<210>9<211>58<212>dna<213>artificialsequence<400>9ccggcctgtgtaattatgacttccactcgagtggaagtcataattacacaggtttttg58<210>10<211>58<212>dna<213>artificialsequence<400>10aattcaaaaacctgtgtaattatgacttccactcgagtggaagtcataattacacagg58<210>11<211>59<212>dna<213>artificialsequence<400>11ccgggtcctggatgacagtcgtaagctcgagcttacgactgtcatccaggacttttttg59<210>12<211>58<212>dna<213>artificialsequence<400>12aattcaaaaagtcctggatgacagtcgtaagctcgagcttacgactgtcatccaggac58<210>13<211>59<212>dna<213>artificialsequence<400>13ccggacgtgctgcagaagatcaagtctcgagacttgatcttctgcagcacgtttttttg59<210>14<211>59<212>dna<213>artificialsequence<400>14aattcaaaaaacgtgctgcagaagatcaagtctcgagacttgatcttctgcagcacgtt59当前第1页12