一种大血藤总酚提取物的制备方法及应用与流程

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种大血藤总酚提取物的制备方法及应用。

背景技术：

类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)是一种以侵犯关节滑膜为主要特征、引起对称性骨关节破坏。滑膜炎的特点为血管增生并血管翳形成，侵蚀、破坏关节，骨关节破坏是类风湿关节炎患者关节功能受损、致残的关键，最后导致关节强直、畸形、功能丧失的多系统性自身免疫性疾病。

在正常骨代谢周期中，体内成骨细胞和破骨细胞的相互制约、相互协调维持着骨形成和骨吸收的动态平衡，从而调节骨内环境的稳定和正常的骨代谢，当这种动态平衡失调，出现骨吸收大于骨形成，就会发生骨质丢失。ra患者骨破坏的发生主要由于骨重建平衡的破坏导致，在ra患者的骨破坏中，大多认为无论局灶性还是系统性骨破坏与破骨细胞形成、分化及其功能增强密切相关，在ra发病早期的骨组织关节腔及其周围组织中可以观察到破骨细胞的存在。

大血藤(sargentodoxaecaulis)为木通科植物大血藤sargentodoxacuneate(oliv.)rehd.etwils.的干燥藤茎，具有清热解毒、活血、祛风止痛的作用，是中医和少数民族(苗族、瑶族、侗族等)治疗风湿痹痛、跌打损伤的常用藤类药之一。大血藤含有酚类、有机酸、木脂素、黄酮、鞣质、三萜皂苷等化学成分。现代药理研究表明其具有抗菌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抑制血小板聚集、增加冠脉血流量等作用。酚类成分在大血藤属植物中分布广泛、含量较髙，是大血藤属植物的特征成分类型之一，大血藤总酚酸可通过改善脑组织能量代谢、保护脑组织免受炎症因子的损伤、增加神经细胞营养因子保护神经元、减少脑梗死面积等作用，减少脑缺血再灌注损伤，发挥脑组织保护作用。

然而，未见大血藤总酚在治疗类风湿关节炎骨破坏方面的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种大血藤总酚提取物的制备方法及应用。该制备方法流程简单，易于重复和操作，成本低，效率高。

并发现大血藤总酚提取物在制备治疗类风湿关节炎骨破坏的药物中的应用。

本发明是这样实现的：

本发明提提供了一种大血藤总酚提取物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提取：取大血藤，用50-80％乙醇回流提取(料液比1:5-1:10kg/l)提取3-4次，每次3h，抽滤合并滤液，减压浓缩蒸干，将所得浸膏溶于水中(质量比1:5-1:7)，依次用等体积乙酸乙酯萃取3-4次，减压浓缩干燥得乙酸乙酯部位浸膏；

(2)分离纯化：将步骤(1)所得乙酸乙酯部位浸膏加适量甲醇溶剂使其溶解用硅胶柱层析进行分离(柱样比1:15-1:20)，洗脱液经薄层色谱法检测收集合并相似部分减压浓缩得到样品；

(3)富集纯化：将步骤(2)所得样品经大孔吸附树脂进行干法吸附，吸附完毕后上样，用蒸馏水洗涤弃水洗液，加入25-35％乙醇对所述树脂柱进行洗脱，冷冻干燥即得大血藤总酚，所述洗脱流速为2-3bv/h。

步骤(2)中，所述洗脱剂体积比为二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝4:3:1-1:1:1。

步骤(3)中，所述大孔吸附树脂选用sp825、hz818、xad16n、hp20或ab-8中一种或几种。

大血藤总酚提取物在制备治疗类风湿关节炎骨破坏的药物中的应用。

大血藤总酚提取物作为有效部位。(唯一感觉太片面了，请李老师对应前面整体修改)

为了明确大血藤总酚提取物对类风湿关节炎骨破坏的作用，发明人进行了如下实验：

采用原代分离兔骨髓间充质细胞经1α，25-(oh)2vitd3诱导法获得破骨细胞，以抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)阳性细胞数和骨吸收陷窝面积为指标，研究大血藤总酚对破骨细胞形成及骨吸收活性的影响。结果表明，大血藤总酚可抑制破骨细胞形成和骨吸收活性。

采用卵巢切除结合牛ii型胶原蛋白诱导建立肾虚cia大鼠模型，结果表明，大血藤总酚各剂量组均可抑制肾虚cia大鼠血清中trap、il-1、il-6、il-17、tnf-α水平，并促进血清中雌二醇(e2)水平，且高剂量组能明显减轻肾虚cia大鼠关节骨破坏程度和病理损伤。

本发明对大血藤总酚提取物的制备方法进行优化，采用色谱分离技术获得大血藤总酚，其制备方法流程简单，易于重复和操作，成本低，效率高，所获得的产物中大血藤总酚含量为60-70％；此外，发明人还发现了大血藤总酚对破骨细胞形成及骨吸收的作用，体外细胞试验表明大血藤总酚可抑制破骨细胞形成及其骨吸收活性；体内动物试验表明大血藤总酚可抑制肾虚cia大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶及炎性因子水平，并在一定程度上减轻关节骨破坏程度和病理损伤。说明大血藤总酚提取物能用于制备治疗类风湿性关节炎骨破坏的药物。

附图说明

附图1：破骨细胞trap染色；

附图2：各组对骨吸收陷窝的影响；

附图3：骨陷窝甲苯胺蓝染色；

附图4：各组对大鼠血清中trap、炎性因子及e2的影响；

附图5：大鼠关节骨破坏程度；

图5中，去卵巢+胶原蛋白组：踝关节构成骨骨质缩小，骨质边缘密度增高，其内见多发小片坏死低密度灶，骨质明显虫蚀样破坏，临近部分骨质疏松，关节面模糊不清，关节间隙狭窄，部分关节融合强直。

大血藤总酚高剂量组：踝关节构成骨骨质部分微小局部骨质破坏，关节面边缘增生硬化，关节间隙清晰，未见狭窄。

附图6：大鼠关节组织滑膜、关节软骨病理变化；

图6中，去卵巢+胶原蛋白组：明显见关节软骨重度侵蚀，软骨细胞严重减少，排列紊乱，软骨关节腔内可见脱落、坏死的软骨碎片；骨组织表现为严重侵蚀；滑膜下层见大量的炎性细胞浸润，包括淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞，其中有的见不同程度单核细胞浸润。

大血藤总酚高总剂量组：关节软骨结构完整，骨层结构清晰；关节软骨表层出现损伤，表面粗糙不整，细胞数量减少；骨组织结构清晰完整；滑膜细胞下层出现严重纤维增生，其他未见明显病理学改变。

具体实施方式

本发明通过下面的实施例予以进一步说明，但实施例并不限定本发明的范围。

实施例1：大孔吸附树脂对大血藤静态吸附及解吸性能考察

分别称取sp825、xad16n、hp20、ab-8、hz818大孔吸附树脂，加入大血藤提取物，于恒温振荡培养箱中25℃振摇吸附12h，离心取上清液，定容后用蒸馏水洗涤，抽干蒸馏水，加入90％乙醇，于恒温振荡培养箱中25℃振摇解析12h，离心吸取上清液，采用高效液相法测定(-)-表儿茶素含量并以此衡量总酚浓度，最佳树脂类型通过吸附/解吸能力来确定。

表1静态吸附/解析能力

实施例2：大血藤总酚的制备

称取大血藤，用60％乙醇回流提取(料液比1:5)，提取3次，每次3h，抽滤，合并滤液。减压浓缩蒸干，得浸膏。将所得浸膏溶于水中(质量比1:5)，分别用等体积乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩干燥得乙酸乙酯部位浸膏。将所得浸膏加适量甲醇溶剂使其溶解并吸附于硅胶上，用石油醚湿法装柱(柱样比1:15)，样品干法上柱，柱体用二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝2:3:1进行等梯度洗脱，减压浓缩蒸干得样品。所得样品上样于sp825大孔吸附树脂，上样流速2bv/h，径高比为1:5，吸附时间为30min，吸附完全后，用蒸馏水洗至洗脱液至无色，然后用30％乙醇水进行洗脱，洗脱流速为2bv/h，收集乙醇洗脱液，蒸干，冷冻干燥得大血藤总酚，含量为67.31％。

实施例3：大血藤总酚对破骨细胞形成及骨吸收的作用

剥离出生48h以内乳兔股骨和胫骨，浸泡于含10％胎牛血清的α-mem完全培养基中，纵向剪开后轻轻刮下骨髓细胞，涡旋后用200目细胞筛过筛，获得原代骨髓细胞。将细胞浓度调整至2×10⁶个/ml后接种于48孔培养板(或提前放置骨磨片)。于5％co2、37℃饱和湿度条件下培养，24h后用适量pbs轻洗，更换为含1α,25-(oh)2vitd3的含药培养基，培养至第8天后进行trap阳性细胞计数，计算骨吸收陷窝面积。结果表明，大血藤总酚可抑制破骨细胞的形成及骨吸收活性。

表2大血藤总酚对trap阳性细胞数的影响(n＝3)

与阴性对照比较，^**p<0.01

实施例4：大血藤总酚对肾虚cia大鼠的作用

取雌性sd大鼠，麻醉后以右腹外侧区为手术区，离尾部脊柱右侧平行于背部正中线向下做纵行切口约2-3cm，依次剪开外皮层、脂肪层、内皮层，在输卵管部位做两个结扎，将卵巢摘除，假手术组只去除卵巢周围部分脂肪组织，由内皮层依次到外皮层缝合。去卵巢后第28天注射胶原蛋白免疫，在初次免疫后第7天激发免疫。免疫后第15天，选出关节炎指数评分大于1的大鼠灌胃给药，连续灌胃28天。结果表明，大血藤总酚各剂量组均可抑制肾虚cia大鼠血清中trap、il-1、il-6、il-17、tnf-α水平，并促进血清中e2水平，且高剂量组能明显减轻肾虚cia大鼠关节骨破坏程度和病理损伤。