雷公藤内酯酮治疗肥胖和脂肪肝的用途的制作方法

本发明涉及药物领域，特别涉及雷公藤内酯酮治疗肥胖和脂肪肝的用途。

背景技术：

肥胖是一种在全世界增加的流行疾病，已经成为全球性的健康问题，无论是发展中国家还是发达国家，无论成人还是儿童，肥胖症的发病率都急剧增高。近年来，脂肪肝的人也越来越多。肥胖和脂肪肝成为多种代谢疾病的潜在危险因素，从而导致心脑血管疾病和癌症等的发病率增高，及死亡率升高。目前，全球儿童超重率已达10％，肥胖率已达2％-3％。在美国，儿童肥胖率与过去50年相比已经大大提高了3倍多，在中国，2010年中国慢病检测数据显示，全国18岁及以上居民超重率达30.6％，肥胖率达12％。肥胖症是糖尿病、冠心病、脑卒中和多种癌症及心脑血管疾病的高风险因素。因此，必须采取有效的措施控制肥胖及其综合症的流行和发展。以提高人民的身体素质。肥胖症的治疗较困难，目前国内外尚无公认的有效药物。虽然多种药物被用于研究治疗肥胖症如西布曲明和二甲双胍，但奥利司它是目前唯一批准的长期使用的抗肥胖药物，因此，迫切需要开发新的抗肥胖药物来抵抗由肥胖引起的代谢性疾病。

脂肪肝是一种多种原因引起的肝脏脂肪代谢功能紊乱的疾病，主要是脂类物质的动态平衡失调，导致肝脏细胞脂肪累积过多的一种病理状态。近年来，随着人们生活习惯和饮食结构的改变，以及临床诊疗技术的发展和应用，脂肪肝的检出率越来越多，发病率不断增加。脂肪肝是多种慢性肝脏疾病的早期阶段，如不及早干预治疗，脂肪肝会逐步发展为炎症细胞浸润、坏死，进而纤维化，可能引起肝细胞癌变，因此，对脂肪肝的防治不容忽视。脂肪肝的治疗主要以祛除病因及诱因和调整饮食为主，药物仅起到辅助治疗的作用，因此目前尚缺乏理想的治疗脂肪肝药物。

雷公藤内酯酮(triptonide，tn)是从中草药中提取出的一种单体，纯度达98％以上。已有研究报道它具有雄性抗生育、抗白血病及抗恶性肿瘤的作用，但它是否具有抗肥胖的作用在国内外至今尚未报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供雷公藤内酯酮及其在制备治疗或预防肥胖和脂肪肝的药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了雷公藤内酯酮在制备降低动物体重的药物中的应用。

本发明还提供了雷公藤内酯酮在制备抑制脂肪生成的药物中的应用。

本发明还提供了雷公藤内酯酮在制备抑制脂肪堆积的药物中的应用。

本发明还提供了根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述脂肪为皮下脂肪、生殖器脂肪、肝脏脂肪或棕色脂肪。

本发明还提供了雷公藤内酯酮在制备降低肝脏系数的药物中的应用。

本发明还提供了雷公藤内酯酮在制备降低动物血液中alt、ast、ldl和/或cho1的药物中的应用。

本发明还提供了雷公藤内酯酮在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。

本发明还提供了雷公藤内酯酮在制备预防和/或治疗肥胖的药物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述雷公藤内酯酮的服用剂量为5mg/kg动物体重/d。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物包括雷公藤内酯酮或其药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料；所述辅料包括崩解剂、润滑剂、乳化剂、粘合剂。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物的剂型包括胶囊、微囊、片剂、颗粒剂、分散粉末、注射剂、脂质体、口服液、静脉注射液、肌肉注射液或可直接应用于肿瘤的药物剂型。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物的给药方式包括口服、直肠给药、鼻腔给药、局部给药、口腔给药、舌下给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌肉、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药。

icr小鼠经过喂养饲料8周后，给予雷公藤内酯酮进行治疗，持续12周。正常组小鼠反应灵敏，毛发光洁，精神状态良好。高脂膳食模型组小鼠，饲喂高脂饲料后，毛发粗糙油腻，精神状态不佳。雷公藤内酯酮灌胃高脂膳食小鼠后，小鼠毛发明显改善，动作自如，精神状态好转。如图1a-1b所示，不给药的高脂饲料组小鼠体重增长很快，而雷公藤内酯酮治疗后能够有效地抑制小鼠体重的生长，并且治疗一个月后有显著性差异(p<0.01)，表明雷公藤内酯酮治疗后能显著降低高脂饲料小鼠的体重。

衡量动物肥胖程度，不能单单依靠于体重的变化，还要依据于其体内脂肪的含量。因此我们还观察了雷公藤内酯酮治疗后对高脂饲料小鼠生殖器脂肪(g-wat)、皮下脂肪(i-wat)和棕色脂肪(bat)重量的影响。如图2a-2e所示，高脂饲料组(hfd-tn)小鼠的生殖器脂肪、皮下脂肪和棕色脂肪的重量显著高于正常饲料组(nd)小鼠(p<0.01)，而且雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠的生殖器脂肪、皮下脂肪和棕色脂肪的重量显著低于高脂饲料组小鼠(p<0.01)，表明雷公藤内酯酮治疗后能显著抑制肥胖的形成。

脏器指数可以反应动物的生理状态。长期的高脂膳食会导致机体出现应激反应，肝脏脂质堆积等现象的出现导致肝肿大。如图3a所示，高脂饲料使得小鼠肝脏显著增大(p<0.01)，而雷公藤内酯酮灌胃治疗高脂饲料小鼠后，其肝脏系数显著降低(p<0.01)。同时，三组小鼠的心脏系数、肺脏系数、脾脏系数和肾脏系数均无明显变化(图3b)。

此外，采用全自动血液生化分析仪测定了雷公藤内酯酮对肥胖模型小鼠血液指标的影响，结果如图4a-4c所示。高脂饲料使得小鼠血液谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl)和胆固醇(cho1)均明显升高(p<0.01)，而雷公藤内酯酮灌胃治疗高脂饲料小鼠后，其alt、ast、ldl和cho1均显著降低(p<0.01)。

对生殖器脂肪、皮下脂肪和肝脏组织进行了he染色。结果如图5a-5b所示，高脂饲料使得小鼠脂肪组织的脂肪滴堆积明显增多，而雷公藤内酯酮灌胃治疗高脂饲料小鼠后，其脂肪组织的脂肪堆积显著降低。对肝脏组织的he染色结果也显示出了和脂肪组织he染色类似的结果(图6)。以上结果表明雷公藤内酯酮治疗后能显著抑制肥胖模型小鼠的脂肪生成。

对肝脏组织进行了油红染色。结果如图7a-7b所示，高脂饲料使得小鼠肝脏组织的脂肪滴堆积明显增多，而雷公藤内酯酮灌胃治疗高脂饲料小鼠后，其肝脏组织的脂肪堆积显著降低。以上结果表明雷公藤内酯酮治疗后能显著抑制肥胖模型小鼠肝脏的脂肪堆积。

对肝脏组织进行了masson染色。结果如图8所示，高脂饲料使得小鼠肝脏组织的胶原纤维沉积明显增多，而雷公藤内酯酮灌胃治疗高脂饲料小鼠后，其肝脏组织的胶原纤维沉积显著降低。以上结果表明雷公藤内酯酮治疗后能显著抑制肥胖模型小鼠肝脏组织的胶原纤维沉积。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示雷公藤内酯酮对高脂饮食小鼠体重的影响；

其中图1a示对高脂饲料组(hfd-tn)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠进行拍照；

图1b示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠体重变化进行分析；

图2示雷公藤内酯酮对高脂饮食小鼠生殖器脂肪、皮下脂肪和棕色脂肪的影响；

其中，图2a示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠生殖器脂肪进行拍照；

图2b示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠皮下脂肪进行拍照；

图2c示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠棕色脂肪进行拍照；

图2d示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠生殖器脂肪(g-wat)、皮下脂肪(i-wat)重量进行分析；**示p<0.01；

图2e示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠棕色脂肪(bat)重量进行分析；**示p<0.01；

图3示雷公藤内酯酮对高脂饮食小鼠器官系数的影响；

图3a示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠的肝脏系数进行分析；**示p<0.01；

图3b示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠的心脏、肺脏、肾脏和脾脏系数进行分析；

图4示雷公藤内酯酮对高脂饮食小鼠血液指标的影响；

图4a示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠的血液alt、ast进行分析；**示p<0.01；

图4b示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠的血液ldl水平进行分析；**示p<0.01；

图4c示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠的血液cho1水平进行分析；**示p<0.01；

图5示雷公藤内酯酮对高脂饮食小鼠脂肪组织结构的影响；

图5a示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠生殖器脂肪进行he染色分析(200×)；

图5b示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠皮下脂肪进行he染色分析(200×)；

图6示雷公藤内酯酮对高脂饮食小鼠肝脏组织结构的影响；

对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠肝脏组织进行he染色分析(200×)；

图7示雷公藤内酯酮对高脂饮食小鼠肝脏组织脂肪沉积的影响；

图7a示对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠肝脏组织进行油红染色分析(200×)；

图7b示对油红染色结果进行半定量分析；

图8示雷公藤内酯酮对高脂饮食小鼠肝脏组织胶原沉积的影响；

对高脂饲料组(hfd-tn)、正常饲料组(nd)和雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠肝脏组织进行masson染色分析(200×)。

具体实施方式

本发明公开了雷公藤内酯酮的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所要解决的技术问题在于提供雷公藤内酯酮在制备预防和/或治疗肥胖和脂肪肝的药物中的应用。

本发明人研究了雷公藤内酯酮在高脂饮食肥胖小鼠中的作用，证实雷公藤内酯酮治疗后能显著地降低高脂饮食肥胖小鼠的体重、脂肪堆积、肝脏脂肪生成和肝脏系数，降低高脂饮食肥胖小鼠血液中的alt、ast、ldl和cho1含量。这表明雷公藤内酯酮对肥胖具有治疗作用。

本发明提供的应用中，治疗肥胖和脂肪肝的药物制剂由有效量的雷公藤内酯酮或其药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料组成。本领域技术人员可将所述公藤内酯酮或其药学上可接受的盐直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如崩解剂、润滑剂、乳化剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成常用剂型，包括但不限于胶囊、微囊、片剂、颗粒剂、分散粉末、注射剂、脂质体、口服液、静脉注射液、肌肉注射液或可直接应用于肿瘤的药物剂型。

本发明所述药用制剂中可以含有0.05wt％～90wt％的雷公藤内酯酮或其药学上可接受的盐，更常见含有在一些实施例中，约15wt％～60wt％的pnkp抑制剂或其药学上可接受的盐。

本发明所述药物制剂可以通过以下方式中的适合方式给药：口服、直肠给药、鼻腔给药、局部给药、口腔给药、舌下给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌肉、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选腹膜内或肌注用药方式。

本发明所述治疗肥胖和脂肪肝的制剂的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病程严重程度以及诊治医师的主观判断。本领域的技术人员根据上述因素可以容易地决定使用剂量和使用方法。

本发明提供的雷公藤内酯酮的应用中所用原料、辅料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1雷公藤内酯酮治疗给药对肥胖小鼠的减肥效果

(一)实验材料

(1)实验动物：

品系：icr小鼠，雌雄各半；

来源：苏州大学医学院实验动物中心；

合格证：实验动物生产许可证号：xcyk(苏)2002-0008，实验动物使用许可证号：syxk(苏)2002-0037；

体重：18-22g；

每组动物数：8只。

(2)小鼠饲料配方：麦芽糊精(12％)，蔗糖(18％)，胆固醇(2％)，进口猪油(21％)，酪蛋白(21％)，全脂奶粉(5％)，苜蓿草粉(3％)，玉米淀粉(8.5％)，l-胱氨酸(0.5％)，植物油(3％)，预混料(6％)。

(3)受试药物：雷公藤内酯酮用生理盐水稀释成所需浓度。

(二)实验方法

icr小鼠24只，体重18-22g。随机分为三组，每组8只(雌雄各为4只)：高脂饲料组(hfd-tn)、高脂饲料+雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)和普通饲料喂养组(nd)。hfd-tn组和hfd+tn组给予高脂饲料饮食，nd组给予正常饲料饮食。喂养8周后，hfd+tn组灌胃给药(5mg/kg/d)雷公藤内酯酮，hfd-tn组和nd组灌胃给予生理盐水。持续给予12周，每周称体重两次并记录。实验结束后，4％水合氯醛麻醉小鼠，采集小鼠血液，离心后得到血浆，采用全自动生化分析仪测定小鼠血液相关指标的变化。断颈处死后，取出肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾脏、生殖器脂肪、皮下脂肪和棕色脂肪，称重后用10％福尔马林溶液进行固定。采用spss11.5统计软件进行统计学分析。组间比较采用独立样本t检验。

(三)实验结果

icr小鼠经过喂养饲料8周后，给予雷公藤内酯酮进行治疗，持续12周。正常组小鼠反应灵敏，毛发光洁，精神状态良好。高脂膳食模型组小鼠，饲喂高脂饲料后，毛发粗糙油腻，精神状态不佳。雷公藤内酯酮灌胃高脂膳食小鼠后，小鼠毛发明显改善，动作自如，精神状态好转。如图1和表1所示，不给药的高脂饲料组小鼠体重增长很快，而雷公藤内酯酮治疗后能够有效地抑制小鼠体重的生长，并且治疗后有显著性差异(p<0.01)，表明雷公藤内酯酮治疗后能显著降低高脂饲料小鼠的体重。

衡量动物肥胖程度，不能单单依靠于体重的变化，还要依据于其体内脂肪的含量。因此我们还观察了雷公藤内酯酮治疗后对高脂饲料小鼠生殖器脂肪(g-wat)、皮下脂肪(i-wat)和棕色脂肪(bat)重量的影响。如图2a-2c和表2所示，高脂饲料组(hfd-tn)小鼠的生殖器脂肪、皮下脂肪和棕色脂肪的重量显著高于正常饲料组(nd)小鼠(p<0.01)，而且雷公藤内酯酮治疗组(hfd+tn)小鼠的生殖器脂肪、皮下脂肪和棕色脂肪的重量显著低于高脂饲料组小鼠(p<0.01)，表明雷公藤内酯酮治疗后能显著抑制肥胖的形成。

脏器指数可以反应动物的生理状态。长期的高脂膳食会导致机体出现应激反应，肝脏脂质堆积等现象的出现导致肝肿大。如表3所示，高脂饲料使得小鼠肝脏显著增大(p<0.01)，而雷公藤内酯酮灌胃治疗高脂饲料小鼠后，其肝脏系数显著降低(p<0.01)。同时，三组小鼠的心脏系数、肺脏系数、脾脏系数和肾脏系数均无明显变化(表3)。

此外，采用全自动血液生化分析仪测定了雷公藤内酯酮对肥胖模型小鼠血液指标的影响，结果如表4所示。高脂饲料使得小鼠血液谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl)和胆固醇(cho1)均明显升高(p<0.01)，而雷公藤内酯酮灌胃治疗高脂饲料小鼠后，其alt、ast、ldl和cho1均显著降低(p<0.01)。

表1雷公藤内酯酮对高脂饮食小鼠体重的影响

与对照组相比，^##p<0.01；与高脂饲料对照组相比，**p<0.01

表2雷公藤内酯酮对高脂饮食小鼠生殖器脂肪、皮下脂肪和棕色脂肪重量的

影响

与对照组相比，^##p<0.01；与高脂饲料对照组相比，**p<0.01

表3雷公藤内酯酮对高脂饮食小鼠器官系数的影响

与对照组相比，^##p<0.01；与高脂饲料对照组相比，**p<0.01

表4雷公藤内酯酮对高脂饮食小鼠血液生化指标的影响

与对照组相比，^##p<0.01；与高脂饲料对照组相比，**p<0.01

实施例2雷公藤内酯酮抑制肥胖模型小鼠脂肪堆积

(一)实验材料

小鼠脂肪和肝脏组织来自实施例1；苏木素-伊红染色试剂盒购自南京建成生物有限公司。

(二)实验方法

将固定后的组织进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明1h，然后以石蜡置换出组织中的二甲苯，使组织变硬，55℃浸蜡过夜。把浸过蜡的组织块埋置与新鲜的石蜡中，制成蜡块，浸蜡温度为66℃，石蜡凝结后立即冷却凝固，-20℃凝固，充分凝固后取出蜡块。将包埋好的组织固定在石蜡切片机上切片。脱蜡前，将组织切片在室温中放置于60℃恒温箱中烘烤30min，组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min，无水乙醇中浸泡5min，95％乙醇中浸泡5min，85％乙醇中浸泡5min，75％乙醇中浸泡5min，自来水冲洗，最后蒸馏水冲洗，3min×2次。苏木青染色液染色5-10分钟。浸自来水中冲洗多余的染色液，约10分钟。蒸馏水再洗涤一遍(数秒钟)。95％乙醇5秒。伊红染色液染色30秒后脱水、透明、封片。

(三)实验结果

为了验证雷公藤内酯酮对肥胖模型小鼠肥胖的抑制作用，对生殖器脂肪、皮下脂肪和肝脏组织进行了he染色。结果如图3a-3b所示，高脂饲料使得小鼠脂肪组织的脂肪滴堆积明显增多，而雷公藤内酯酮灌胃治疗高脂饲料小鼠后，其脂肪组织的脂肪堆积显著降低。对肝脏组织的he染色结果也显示出了和脂肪组织he染色类似的结果(图4)。以上结果表明雷公藤内酯酮治疗后能显著抑制肥胖模型小鼠的脂肪生成。

实施例3油红染色实验

(一)实验材料

小鼠脂肪和肝脏组织来自实施例1；油红染色试剂盒购自南京建成生物有限公司。

(二)实验方法

取出冰冻切片，室温回温，蒸馏水洗掉包埋剂；60％异丙醇浸洗2min,提前润洗，便于油红o染色；油红o工作液染色2-5min，60％异丙醇调色，需要在显微镜的辅助下完成，调出合适的颜色；调色结束后，立即水洗；苏木素复染1min，流水反蓝，显微镜下观察；水性封片剂封片；尽快用正置显微镜拍照，统计油红o染色结果。

(三)实验结果

为了验证雷公藤内酯酮对肥胖模型小鼠肝脏脂肪堆积的抑制作用，对肝脏组织进行了油红染色。结果如图5所示，高脂饲料使得小鼠肝脏组织的脂肪滴堆积明显增多，而雷公藤内酯酮灌胃治疗高脂饲料小鼠后，其肝脏组织的脂肪堆积显著降低。以上结果表明雷公藤内酯酮治疗后能显著抑制肥胖模型小鼠肝脏的脂肪生成。

实施例4masson染色实验

(一)实验材料

小鼠脂肪和肝脏组织来自实施例1；油红染色试剂盒购自南京建成生物有限公司。

(二)实验方法

取出冰冻切片，室温回温，蒸馏水洗掉包埋剂；60％异丙醇浸洗2min,提前润洗，便于油红o染色；油红o工作液染色2-5min，60％异丙醇调色，需要在显微镜的辅助下完成，调出合适的颜色；调色结束后，立即水洗；苏木素复染1min，流水反蓝，显微镜下观察；水性封片剂封片；尽快用正置显微镜拍照，统计油红o染色结果。

(三)实验结果

为了验证雷公藤内酯酮对肥胖模型小鼠肝脏脂肪堆积的抑制作用，对肝脏组织进行了masson染色。结果如图6所示，高脂饲料使得小鼠肝脏组织的胶原纤维沉积明显增多，而雷公藤内酯酮灌胃治疗高脂饲料小鼠后，其肝脏组织的胶原纤维沉积显著降低。以上结果表明雷公藤内酯酮治疗后能显著抑制肥胖模型小鼠肝脏组织的胶原纤维沉积。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。