贝尼地平在制备预防和/或治疗布尼亚病毒感染性疾病药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药领域，具体而言，涉及一种贝尼地平在制备预防和/或治疗布尼亚病毒感染性疾病药物中的应用。

背景技术：

贝尼地平(benidipine)是(±)-2,6,-二甲基-4-(3-硝基苯基)-1,4-二氢-3,5-吡啶二甲酸，3-(1-苯甲基-3-哌啶基)酯-5-甲酯，该药由协和发酵工业株式会社(kyowahakko)于1981年成功研制，并在1991年获得美国食品与药物监督管理局(foodanddrugadministration，fda)批准正式进入临床使用。数十年来，贝尼地平在治疗原发性高血压等方面效果良好。贝尼地平的结构式如下：

布尼亚病毒(bunyavirus)是具球形、有包膜和分节段负链rna的1目病毒，自然感染见于许多脊椎动物和节肢动物(蚊、蜱、白蛉等)，对人感染可引起的主要症状包括发热、肌肉酸痛、淋巴结肿大、胃肠道不适、神经系统症状、血小板和白细胞减少、出血热及脑炎等，有蚊媒、蜱媒、白蛉媒3种传播类型。

sftsv(severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus)全称发热伴血小板减少综合征病毒，是一种新发布尼亚病毒。sftsv感染引起的主要症状包括发热、出血、胃肠道不适、肌肉酸痛、淋巴结肿大及血小板和白细胞减少等；该病毒主要经蜱虫携带和传播，蜱虫叮咬是引起人类感染的重要原因，sftsv可感染近乎全年龄段人群，尤其对老年人群威胁较大，有较高的致死率。

hrtv(heartlandvirus)是一种新兴蜱传白蛉病毒属病毒，感染者临床表现包括发热、疲劳、头痛、恶心、腹泻和肌痛；实验室检查可见白细胞减少、血小板减少及肝酶升高。

gtv(guertuvirus，古尔图病毒)为从中国新疆草原革蜱上首次分离和鉴定出的一种新型蜱传白蛉病毒，基因组测序和进化分析显示古尔图病毒与sftsv和hrtv相近，与sftsv和hrtv同样具有致病性。

目前，对于病毒性疾病的预防和治疗主要依靠疫苗和药物，对于布尼亚病毒感染性疾病尚无获批进入临床使用的疫苗产品和特效药物。目前针对布尼亚病毒感染的治疗方法也相当有限，主要治疗手段为对症支持治疗和广谱抗病毒疗法，其疗效有限，个体差异较大，且难以推广。因此，相关抗病毒药物和疫苗的研发将是攻克该病毒的关键着力方向。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种贝尼地平和/或其可药用衍生物在制备预防和/或治疗布尼亚病毒感染性疾病的药物中的应用，为布尼亚病毒感染性疾病的治疗和预防提供方向。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

贝尼地平和/或其可药用衍生物在制备预防和/或治疗布尼亚病毒感染性疾病的药物中的应用。

进一步地，所述布尼亚病毒包括sftsv、gtv或hrtv中的至少一种。

进一步地，贝尼地平是可药用盐的形式。

进一步地，贝尼地平是可药用酸加成盐的形式。

进一步地，贝尼地平是可药用盐酸盐的形式。

进一步地，药物剂型包括胶囊剂、片剂、微囊制剂、颗粒剂或丸剂。

进一步地，药物剂型为片剂。

进一步地，药物还包括药学上可接受的辅料。

进一步地，辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着色剂中的至少一种。

进一步地，辅料包括填充剂、崩解剂和粘合剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

发明人首次发现贝尼地平和其可药用衍生物可用于预防或治疗布尼亚病毒引起的感染性疾病。该发现令人惊讶，因为无法预测已知用于治疗心血管疾病的化合物能够预防或治疗布尼亚病毒感染性疾病。试验结果表明，贝尼地平对于布尼亚病毒具有较强的抗病毒活性，可以显著减少布尼亚病毒感染小鼠的死亡率和体重变化，在细胞和动物水平均表现出较强的抗病毒效果，具有明显的技术效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中benidipine的细胞毒性检测结果；

图2为实施例2中不同浓度benidipine的抗病毒活性检测结果；

图3为实施例2中benidipine对sftsv复制的影响结果；

图4为实施例3中benidipine对gtv和hrtv复制的影响结果；

图5为实施例4中benidipine对sftsv感染人源化小鼠的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

发明人首次发现贝尼地平和其可药用衍生物可用于预防或治疗布尼亚病毒引起的感染性疾病。该发现令人惊讶，因为无法预测已知用于治疗心血管疾病的化合物能够预防或治疗布尼亚病毒感染性疾病。

因此，根据本发明，提供了贝尼地平和/或其可药用衍生物在制备预防和/或治疗布尼亚病毒感染性疾病的药物中的应用。

试验结果表明，贝尼地平对于布尼亚病毒具有较强的抗病毒活性，可以显著减少布尼亚病毒感染小鼠的死亡率和体重变化，在细胞和动物水平均表现出较强的抗病毒效果，具有明显的技术效果，较好的应用前景。

需要说明是的，贝尼地平的可药用衍生物包括其可药用盐，例如可以但不限为无机酸盐、有机酸盐或金属盐。其中，无机酸盐例如可以但不限为盐酸、硫酸或磷酸的盐；有机酸盐例如可以但不限为柠檬酸或苹果酸的盐；金属盐例如可以但不限为钙盐、钾盐或钠盐。

可以理解的是，一方面，可以使用以贝尼地平和/或其可药用衍生物为活性成分的药物来预防布尼亚病毒感染引发疾病的可能，例如处于高危暴露环境例如农业、林牧等生产生活的人群，可以使用以贝尼地平或其可药用衍生物为活性成分的药物来预防蜱虫等叮咬导致的布尼亚病毒感染引发疾病；另一方面，可以使用以贝尼地平和/或其可药用衍生物为活性成分的药物来治疗布尼亚病毒感染引发疾病的可能，例如如果待治疗患者确诊为布尼亚病毒感染时，可以使用以贝尼地平或其可药用衍生物为活性成分的药物进行治疗。此外，贝尼地平和/或其药用衍生物可以抑制布尼亚病毒侵染细胞，所以在治疗布尼亚病毒侵染细胞的同时，可以防止布尼亚病毒对正常细胞的侵染。

在本发明一些优选的实施方式中，布尼亚病毒包括sftsv、gtv或hrtv中的至少一种。

在本发明一些优选的实施方式中，贝尼地平的可药用衍生物包括可药用盐的形式，特别是酸加成盐，例如盐酸盐。所用贝尼地平或其可药用衍生物可以但不限于为市售。

在本发明一些优选的实施方式中，药物剂型包括胶囊剂、片剂、微囊制剂、颗粒剂或丸剂。

在本发明一些优选的实施方式中，药物剂型为片剂，每一片中活性成分贝尼地平或其可药用衍生物的重量没有限定，可以是临床上的常用剂量范围，优选为2-8mg/片。

在本发明一些优选的实施方式中，药物还包括药学上可接受的辅料。辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着色剂中的至少一种。根据药物剂型的需要选择不同的辅料。例如，填充剂、崩解剂和粘合剂制备片剂；填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂制备颗粒剂；崩解剂和着色剂制备胶囊剂。

在优选地实施方式中，辅料包括填充剂、崩解剂和粘合剂。

对于药学上可接受的填充剂并没有任何限制，可以是本领域常用的填充剂。在本发明一个优选地实施方式中，填充剂为乳糖。

对于药学上可接受的崩解剂并没有任何限制，可以是本领域常用的崩解剂。在本发明一个优选地实施方式中，崩解剂为低取代羟丙基纤维素。

对于药学上可接受的粘合剂并没有任何限制，可以是本领域常用的粘合剂。在本发明一个优选地实施方式中，粘合剂为羟丙甲纤维素溶液。

在本发明中，可以理解的是，以贝尼地平为先导化合物进行进一步结构优化，用于制备预防和/或治疗布尼亚病毒感染性疾病药物也属于本发明想要保护的范围。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

以下实施例中使用的方法如无特别说明，均为常规方法；以下实施例中使用的耗材和试剂，如无特别说明均为市场购得。

化合物贝尼地平benidipine的合成路径已有文献报道(fischer，jnos；ganellin，c.robin(2006).analogue-baseddrugdiscovery.johnwiley&sons.p.465.isbn9783527607495.)。实施例中的数据分析采用graphpad软件进行统计分析，药物为贝尼地平盐酸盐。

实施例1

目标化合物benidipine的细胞毒性检测

在vero细胞中，对benidipine的细胞毒性进行检测。vero细胞按1×10⁴细胞/孔接种于96孔板细胞培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养12-16h，分别用10μm，20μm，30μm，40μm，50μm，60μm，70μm，80μm，90和100μm的benidipine进行处理，每组三个复孔，对照组加相同量的二甲基亚砜(dmso)。药物作用24h后用mtt染色，检测od492nm，分析细胞存活率，经测试如图1所示，benidipine的cc50为96.92μm。后续实施例中，benidipine的使用浓度为10μm，处于安全无毒性范围内。

实施例2

目标化合物benidipine对sftsv的抗病毒活性检测

vero细胞按2×10⁵细胞/孔接种于24孔板细胞培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养12-16h，使用浓度为1μm，5μm，10μm，20μm和40μm的benidipine进行处理，阴性对照加入同体积dmso。孵育1h后，用sftsv感染，37℃孵育1h后，更换培养基为2％fbs的dmem培养基，16h后，通过滴度检测benidipine抑制病毒复制的效果，结果如图2所示，在不同浓度条件下，化合物benidipine对sftsv的复制均有显著抑制作用。进一步对benidipine抑制sftsv的ic50进行检测，结果如图3中sftsv的抑制曲线所示，benidipine显著抑制sftsv的活性，经计算其ic50为1.412μm。

实施例3

目标化合物benidipine对其他布尼亚病毒复制的影响

vero细胞按2×10⁵细胞/孔接种于24孔板细胞培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养12-16h，使用浓度为1μm，5μm，10μm，20μm和40μm的benidipine进行处理，阴性对照加入同体积dmso。孵育1h后，分别用同属于白蛉病毒属的古尔图病毒(gtv)和heartland病毒(hrtv)感染，37℃孵育1h后，更换培养基为2％fbs的dmem培养基，16h后，通过实时荧光定量pcr(qpcr)方法检测benidipine抑制病毒复制的效果，如图4所示(其中，图a为benidipine对gtv复制的影响，图b为benidipine对hrtv复制的影响)，在不同浓度条件下，化合物benidipine对古尔图病毒和heartland病毒的复制均有显著抑制作用。

实施例4

目标化合物benidipine对sftsv感染人源化小鼠的影响

nod.cg-prkdcem1idmoil2rgem2idmo小鼠(nod-prkdcnullil2rγnull，)被用于人源化小鼠构建，全程饲养于spf环境，在移植改造前2天，小鼠经腹膜内注射白消安(20mg/kg)处理。随后，纯化自人脐血，纯度达90％以上的cd34⁺细胞通过尾静脉注射移植到小鼠体内，获得人源化小鼠模型。人源化小鼠被分为2组：(1)sftsv+vehicle组(n＝7),(2)sftsv+benidipinehydrochloride组(n＝6)。小鼠感染采用腹腔注射法，接毒量为200μl，mock组为等体积dmem培养基。灌胃给药，benidipine的剂量为15mg/kg/d，每天两次，共计10天。整个实验流程严格遵守动物保护和使用委员会操作指南所规定的美国国立卫生研究院的指导方针。小鼠每日监测指标包括：弓背、立毛、活动力、应激反应、体重、体温等。结果如图5所示，与对照组的57.1％相比，给药组小鼠死亡率显著降低至16.7％。提示benidipine可以在小鼠水平显著抑制sftsv的复制，从而显著提高感染小鼠的存活率。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。