用于制备治疗牙齿损伤的组合物的方法与流程

发明领域本申请是申请日为2013年8月14日，申请号为201380043210.2，发明名称为“用于制备治疗牙齿损伤的组合物的方法”的发明专利的分案申请。本发明涉及一种用于制备治疗牙齿损伤的组合物的方法，所述组合物包含能够在一定ph经历自组装的肽。本发明的组合物非常适用于医疗领域，特别用于使牙齿损伤例如表层下龋齿损伤再矿化。发明背景至今，牙齿再矿化主要通过钙和磷酸盐离子递送到牙齿损伤部位或腔而实现。钙和磷酸盐离子通常包含在牙膏中，牙膏也包含例如磨料、氟化物、表面活性剂和其它再矿化剂。钙和磷酸盐离子可以各种结晶形式使用，例如作为羟基磷灰石基材料，或者作为无定形磷酸钙，例如，在一些recaldent基材料中。更近来已描述一种牙齿再矿化的替代方法，该方法基于合理设计的自组装短肽。wo2004/007532公开了能够形成三维骨架，从而促进新生磷酸钙成核的肽。这些人工肽在一维中组装成β-片层条状组装体。肽组装体可响应化学或物理触发剂从流体转变成向列相、较硬的凝胶态。肽设计成响应一定ph、离子强度和/或温度条件按以下分级次序形成组装体：条、带、原纤和纤维。aggeli等(2003,j.am.chem.soc.125,9619-9628)分析ph作为肽β-片层自组装的触发剂。在本领域已描述几种其它自组装肽。例如，wo2010/041636a1描述一种包含人工肽的生物可吸附肽组织闭塞剂，所述人工肽具有8-200个氨基酸残基，且亲水氨基酸和疏水氨基酸交替键合，其在生理ph自组装成β-结构。在wo2008/113030a2中也公开了与胞外基质相互作用的具有交替疏水和亲水残基或延伸的自组装肽。wo2010/103887a1公开了包含特定一级序列的碱性、疏水和酸性氨基酸的自组装肽，和其具有高强度的肽凝胶。另一个申请wo2007/000979a1描述具有极性氨基酸和非极性氨基酸的自组装肽。肽能够形成一种β-片层结构，其中非极性氨基酸残基以组装形式排列在该结构的一侧上。在us6,548,630中描述两亲性自组装肽，所述两亲性自组装肽用作用于生物材料应用的稳定宏观膜，例如慢扩散药物递送。ep2327428a2涉及一种用于修复损伤组织(例如，心肌梗塞后的组织)的药物组合物，其包含彼此互补的自组装肽纳米纤维和至少一种细胞。用自组装肽递送生物活性剂在现有技术也已描述，例如，描述于us2008/199431a1和wo2009/026729a1。wo2006/073889a2涉及一种组合物，其中人pdgf直接结合到肽，肽组装成缓慢体内释放pdgf的凝胶。wo2006/047315a2提出用生物素/链霉抗生物素连接使治疗剂连接到自组装肽。kirkham等涉及促进牙釉质再矿化的自组装肽骨架(2007,dent.res.86(5),426-430)。可从上面看到，已描述若干自组装肽，其可在牙齿再矿化中用作模板或骨架，用于磷酸钙原位成核。然而，在牙齿再矿化中可能遇到的一个具体问题是，对于肽的组装形式，表层下损伤部位可能难以接近。一旦这些肽已形成条、带、原纤或纤维，组装体的大小就使得不再可能以达到显著效果必需的量在牙齿表面上在超矿化板中通过小孔扩散进入表层下损伤部位。因此，为了有效治疗表层下损伤，自组装肽需要以单体形式处于牙齿损伤外，以使得能够扩散进入表层下损伤部位，并且需要一旦在牙齿损伤部位内，就转变成原纤形式。如果肽在损伤部位外组装，就不能促进在损伤部位内再矿化，因为形成的三维结构太太，以致于不能扩散通过孔。现有技术已描述若干药物输送装置。例如，已公开用于直接施用药物的具有密封布置的流体输送装置(例如，wo2011/058545a1，wo2011/104711a1)。然而，这些药物输送装置均未消除在牙齿损伤部位外组装的问题。发明详述本发明提供一种用于使自组装肽靶向递送到牙齿损伤部位的方法，所述方法能够使所述肽以单体形式保持在损伤部位外，从而促进扩散进入表层下损伤部位。在表层下损伤部位内，肽转变成自组装原纤状态。也提供了用于使自组装肽靶向递送到牙齿损伤部位的组合物。具体地讲，在第一个方面，本发明提供用于制备适用于治疗牙齿损伤(例如，龋齿损伤)的组合物的方法，所述方法包括a)提供包含肽的溶液，所述肽在低于7.5的ph开始经历自组装，其中所述溶液具有高于肽开始经历自组装ph0.1至0.5个ph单位的ph；b)加入使溶液ph提高到8.0或更高的化合物，所述化合物具有足够挥发性，以在冻干期间去除；c)将溶液冻干；并且d)任选使冻干物溶于水溶液，以得到具有高于肽开始经历自组装ph0.1至0.5个ph单位的ph的溶液，所述溶液包含其单体状态的肽。本发明尤其基于以下认识：使用挥发性且在冻干期间蒸发的碱性化合物(例如，氨)帮助控制自组装肽的组装。具体地讲，通过在冻干期间碱性化合物蒸发使ph从碱性向更酸性条件转变，可提供一种冻干物，所述冻干物在重新悬浮于水时提供具有接近肽开始经历自组装ph的ph的主要单体肽的均匀溶液。在这种溶液施用于牙齿表面时，单体肽扩散进入要实现再矿化的牙齿损伤部位。在牙齿损伤部位，由于形成口腔微生物群落的乳酸菌连续产生乳酸，ph一般在5.0和6.5之间或更低。由于在本发明重构溶液中的缓冲剂在牙齿损伤部位变得稀释，单体肽的ph诱导组装在损伤部位内开始，从而形成多聚体组装体，多聚体组装体可作为骨架用于随后磷酸钙沉积。即使具有高于肽开始经历自组装ph的ph的新鲜肽溶液最初只包含低百分比的自组装多聚体，溶液储存和暴露于空气也可由于生成碳酸氢盐和随后溶液酸化而产生组装体。根据本发明的方法，通过使含肽溶液的ph提高到8.0或更高而实现肽的有效单体化。优选通过使溶液的ph提高到高于肽开始经历自组装ph至少0.5个单位的ph，实现肽的单体化。例如，使用在本文称为seqidno:1或seqidno:2的肽时，在8.0或更高的ph实现单体化，因为这些肽的自组装在ph7.5开始。在此高ph，溶液中多于95%、优选多于96%、多于97%、多于98%、多于99%且最优选100%的肽不组装，即，为单体。在溶液冻干，随后在水或另一种具有中性或接近中性ph的含水介质中重构后，肽保持单体形式。以此方式，本发明允许单体肽靶向递送到牙齿损伤部位，随后所述肽在牙齿损伤部位内自组装，其中后一步骤在牙齿损伤部位由ph引发，而没有任何使用者(例如，牙医)干预。本发明的方法和组合物特别有利，因为避免了在牙齿损伤部位外由于肽自组装所致的显著量肽损失。同时，本发明的方法和组合物促成在损伤体(lesionbody)内的必需浓度，使得能够自组装。本发明的方法提供非常适用于治疗哺乳动物(更优选人)的牙齿损伤(例如，龋齿损伤)的组合物。另外，本发明的方法提供非常适用于牙腔矿化的组合物。具体地讲，本发明的方法和组合物可用于用互连肽网络填充牙齿损伤部位和/或牙腔，互连肽通过存在于例如唾液的钙和磷酸盐离子的沉积而促进损伤再矿化。本文所用龋齿“损伤”为一般由牙表膜中存在的细菌生成酸引起的牙齿或牙齿表面中的表层下损伤或表层下微损伤。本文所用牙“腔”是指牙齿表面中的孔洞。细菌，特别是链球菌、乳酸杆菌属和放线菌属的细菌，由源自食物的碳水化合物发酵而产生酸。在发酵时生成的酸使硬牙组织(即，牙釉质、牙本质和牙骨质)去矿化。牙损伤和牙腔也可以是物理创伤的结果。如果不治疗，龋齿损伤或牙腔可引起包含血管和神经的髓室感染，这可最终导致牙缺失。通常，损伤或牙腔可存在于任何牙齿上，例如，在门齿(dentesincisivi)、犬齿(dentescanini)、前臼齿(dentespraemolares)和/或臼齿(dentesmolares)上。同样，损伤或牙腔可影响任何牙齿表面，即在唇面、近中面、颊面、颚面、邻接面和/或远中面。在本发明方法的第一步骤，提供包含一种或多种自组装肽的溶液。选择用于本发明方法的自组装肽，使得其环境ph一下降低于某一ph(例如，低于ph7.5)，其就经历自组装。本发明的自组装肽开始经历自组装的ph低于7.5，优选低于7.2，更优选低于7.0。例如，自组装肽p11-4(seqidno:1)和末端修饰p11-4(seqidno:2)开始经历自组装的ph为约7.5。这意味在ph下降低于7.5时，自组装肽开始自组装至显著程度。本文所用肽的“自组装”是指肽与它们自身种类的其它肽(或具有相似结构的肽)通过非共价相互作用自发和可逆地组织成多聚组装体。引起生成多聚组装体的非共价相互作用包括范德华、π-堆积、氢键、肽的氨基酸主链和/或氨基酸侧链之间的极性和离子相互作用。本文所用自组装肽开始经历自组装的ph是指这样的ph，在低于该ph时观察到溶液中肽显著程度的自组装，这意味着存在于溶液中的肽的至少约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约99%或甚至约100%被组装。在一个优选的实施方案中，存在于溶液中的肽的至少约25%在低于肽开始经历自组装的ph下组装。优选在引发自组装的ph，例如对于p11-4和经修饰p11-4约ph7.5，仅约20%或更少的肽在多聚体状态，优选仅约15%或更少，更优选10%或更少，甚至更优选5%或更少。因此，在本发明的意义上，其中肽“主要”以单体形式存在的溶液为其中仅约20%或更少的肽在多聚体状态的溶液，优选仅约15%或更少，更优选10%或更少，甚至更优选5%、4%、3%、2%、1%或更少。相比之下，低于引发自组装的ph，例如对于p11-4(seqidno:1)和经修饰p11-4(seqidno:2)ph7.5，观察到溶液中肽的显著程度自组装，这意味着存在于溶液中的肽的至少约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约99%或甚至约100%被组装，即多聚体。用于本发明方法的自组装肽优选组装成β-折叠片。在β-折叠片中，通过不同多肽链中残基之间或折叠多肽不同区段中残基之间的一系列氢键产生片状结构。一般β-折叠片中的相邻多肽链是反向平行的，这意味着它们以相反方向延伸。然而，相邻链也可平行延伸。如果数个多肽链参与片形成，则片为刚性壁状结构。多个折叠片提供必需的韧度和刚性。可用于本发明方法的肽设计成在自组装时形成稳定的二级结构。优选用于本发明方法的肽形成在厚度中包含单一分子β-折叠结构的长“β-条”。在组装期间肽形成复合结构，例如螺旋形条(单分子厚度)、扭带(twistedribbon)(双条)、原纤(扭带组)和纤维(缠绕原纤)。随着减小ph，可形成螺旋形条、扭带、原纤和最后纤维。可用于本发明方法的自组装肽的大小没有明确限制。本发明的肽可具有允许以ph依赖性方式自组装的任何长度。优选肽具有约4-200个氨基酸大小，更优选6-100个氨基酸，8-50个氨基酸，10-30个氨基酸或11-20个氨基酸。甚至更优选自组装肽具有约27个氨基酸、24个氨基酸、21个氨基酸、15个氨基酸或11个氨基酸长度。在一个特别优选的实施方案中，自组装肽具有11个氨基酸长度。自组装肽可通过一般在肽合成领域已知的任何适合方法制备。例如，可通过重组方法制备具有大于50个氨基酸长度的肽。在一个实施方案中，自组装肽作为融合肽制备。本文所用融合肽是指包含目的自组装肽的第一氨基酸序列以n端或c端连接到第二氨基酸序列的融合物。第二氨基酸序列可以为亲和标签，即，融合到自组装肽5'或3'末端且对另一种化合物显示增加的亲和性从而允许纯化融合肽的氨基酸序列。优选在纯化后从目的自组装肽去除标签序列，例如，通过在自组装肽和亲和标签之间提供蛋白水解切割。在一个实施方案中，自组装肽如kyleetal.,2010,biomaterials31,9395-9405中公开制备。较小的自组装肽通常通过化学合成制备。例如，肽可通过固相或液相方法化学合成。溶液相化学合成肽的方案已有描述(参见，例如anderssonetal.,biopolymers55:227-250,2000)。对于固相合成，可使用merrifield(j.am.chem.soc.,1964,85,2149-2154)所述的技术。在此方法中，使生长的肽锚着在不溶性树脂上，并通过过滤或洗涤步骤去除未反应可溶性试剂，而没有操作性损失。固相肽合成可容易用自动装置进行。用于本发明方法的肽可包含任何天然、蛋白原氨基酸。另外，肽也可包含不常见的非蛋白原氨基酸，例如肉碱、γ-氨基丁酸(gaba)、羟基脯氨酸、硒代甲硫氨酸、羟丁赖氨酸(hypusine)、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、鸟氨酸(orn,o)、瓜氨酸、β-丙氨酸(3-氨基丙酸)等。通过翻译后修饰或者在肽化学合成期间直接掺入，可使非蛋白原氨基酸掺入到肽中。用于本发明方法的自组装肽优选包含包括–cooh基团的氨基酸侧链。具有–cooh的氨基酸侧链在高于其名义pk值的ph值去质子化。例如，在其侧链包含–cooh基团的氨基酸，例如天冬氨酸(asp,d)和谷氨酸(glu,e)，基本上在高于中性(即在ph7)的ph去质子化，因为它们显示低pka(asp:3.71;glu:4.15)。在本发明的自组装肽中，包含–cooh基团的氨基酸侧链特异位于肽链中，以控制相邻肽之间的静电相互作用，即，以便在–cooh基团去质子化为–coo-并且要支配肽之间键中缔合自由能时通过静电相互作用排斥相邻、相同的自组装肽。使ph降低低于某一阈值，即肽开始经历自组装所在的ph，例如，对于p11-4(seqidno:1)和经修饰p11-4(seqidno:2)约ph7.5，导致在本发明的自组装肽中–cooh基团质子化，这减小肽之间的排斥静电相互作用，并允许肽自组装。用于本发明方法的自组装肽优选包含式x1-x2-x1-x2-x1的序列，其中x1为具有酸性侧链的氨基酸，x2为具有疏水侧链的氨基酸，选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(seqidno:3)。在一个更优选的实施方案中，用于本发明方法的自组装肽包含序列glu-x2-glu-x2-glu，其中x2为具有疏水侧链的氨基酸，选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(seqidno:4)；或asp-x2-asp-x2-asp，其中x2为具有疏水侧链的氨基酸，选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(seqidno:5)。在另一个优选的实施方案中，用于本发明方法的自组装肽包含序列gln-gln-arg-phe-glu-trp-glu-phe-glu-gln-gln(p11-4,seqidno:1)或与其具有至少80%序列同一性的序列或由其组成。更优选用于本发明方法的肽为如seqidno:2中所示的经修饰p11-4或与其具有至少80%序列同一性的序列。对于本文中称为p11-4的肽，通过ph控制从单体转换到组装多聚体形式。如果ph低于ph7.5，则肽组装。如果ph较高，则肽的状态为单体。与seqidno:1或2具有至少80%或更大序列同一性的肽序列优选在相当于seqidno:1或2的氨基酸5、7和9的位置包括谷氨酸或天冬氨酸。具体地讲，与seqidno:1具有至少80%或更大序列同一性的肽序列优选在相当于seqidno:1的氨基酸5、7和9的位置包括谷氨酸。优选其余氨基酸位置为具有疏水侧链的氨基酸，选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。优选其余氨基酸位置不是具有碱性侧链的氨基酸，即大约中性ph的带正电荷的氨基酸。在一个实施方案中，本发明的肽包含通过1、2或3个氨基酸置换而不同于seqidno:1和2中所示序列的序列或由其组成。一般seqidno:1和2肽序列内的各氨基酸残基可由另一个残基取代，只要得到的肽仍能够在低于7.5的ph值经历自组装。优选取代为保守取代，即，由作为功能等价物的相似极性氨基酸取代一个或多个氨基酸残基。优选用作取代基的氨基酸残基选自与要被取代的氨基酸残基相同的氨基酸组。例如，疏水残基可用另一种疏水残基取代，或者极性残基可用具有相同电荷的另一种极性残基取代。可用于保守取代的功能同源氨基酸包括例如非极性氨基酸，例如甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。不带电荷的极性氨基酸的实例包括丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸。带电荷极性(碱性)氨基酸的实例包括组氨酸、精氨酸和赖氨酸。带电荷极性(酸性)氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。另外，本发明的肽可在结构上在一个或多个氨基酸位置修饰，例如，通过引入一个或多个修饰氨基酸。根据本发明，这些修饰氨基酸可以为已通过例如生物素酰化、磷酸化、糖基化、乙酰化、支化和/或环化改变的氨基酸。另外，本发明的肽可另外或供选包含其它修饰，例如末端封端基团、甲酰基-、γ-羧基谷氨酸羟基-、甲基-、磷酰基-、吡咯烷酮羧酸-和/或硫酸酯-基团。在一个优选的实施方案中，本发明的肽可在其n-端乙酰化，和/或在其c-端酰胺化，例如利用nh2-基团。一个特别优选的实施方案是n-端乙酰化和利用nh2-基团使c-端酰胺化的肽p11-4，如以下序列ch3co-qqrfewefeqq-nh2(seqidno:2)和图1中所示。本领域的技术人员已知，肽浓度可影响肽的组装，即，特别高的肽浓度可提前引发组装。另外，极低肽浓度可阻止本发明的肽组装，即，甚至在牙齿损伤部位和口腔中存在的低ph条件。因此，在步骤a)溶液中的肽浓度应在0.1至100mg/ml之间、0.5至50mg/ml之间、1至40mg/ml之间、1至30mg/ml之间或1至20mg/ml之间或1至10mg/ml之间。在一个特别优选的实施方案中，在步骤a)溶液中的肽浓度在1至10mg/ml之间。在更优选的实施方案中，在步骤a)溶液中的肽浓度为约2mg/ml。包含一种或多种自组装肽的以上方法步骤a)中提到的溶液具有高于肽开始经历自组装ph0.1至1.5、优选0.1至1.0、0.1至0.5、0.2至0.4、更优选约0.3个单位的ph，这意味着含肽溶液的ph略高于引发所述肽单体溶液组装的ph。在一个优选的实施方案中，步骤a)中提到的溶液具有高于肽开始经历自组装ph0.3个ph单位的ph。在一个特别优选的实施方案中，溶液包含肽p11-4(seqidno:1)或经修饰p11-4，如seqidno:2中所示，并且溶液在以上方法的步骤a)中具有约ph7.8或更高。溶液优选为水溶液。然而，溶液也可包含一定量的其它溶剂，例如有机或无机溶剂，即醇、醚、酮。一旦已通过ph初始升高相互分离，将步骤a)中溶液保持在高于如上所述肽开始经历自组装ph的ph对自组装肽保持其单体形式是最佳的。此ph略高于肽开始自组装的ph。步骤a)的溶液优选包含一种或多种缓冲剂，用于使步骤a)溶液的ph保持在所需范围。在一个优选的实施方案中，步骤a)的溶液缓冲到高于肽开始经历自组装ph0.1至0.5个ph单位的ph。提供高于肽开始经历自组装ph0.1至0.5个ph单位的ph的缓冲剂为基本非挥发性缓冲剂，以便缓冲剂在冻干期间和之后保持在组合物中。优选溶液包含提供高于ph7.50.1至0.5个ph单位的ph的缓冲剂。适合的缓冲剂包括taps({[三(羟基甲基)甲基]氨基}丙磺酸)、bicine(n,n-双(2-羟基乙基)甘氨酸)、tris(三(羟基甲基)-氨基甲烷)、曲辛(n-三(羟基甲基)甲基甘氨酸)、tapso(3-[n-三(羟基甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)、hepes(4-2-羟基乙基-1-哌嗪乙磺酸)、tes(2-{[三(羟基甲基)甲基]氨基}乙磺酸)、mops(3-(n-吗啉代)丙磺酸)、pipes(哌嗪-n,n′-双(2-乙磺酸))、二甲胂酸(二甲基次砷酸)、ssc(柠檬酸钠盐水)、mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)和保持基本中性ph范围的其它缓冲剂。为了得到高于肽开始经历自组装ph0.1至0.5个ph单位的所需ph，并提供缓冲能力，也可用酸缓冲剂(例如，柠檬酸、磷酸等)与任何以上缓冲剂和/或碱性缓冲剂组合，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、磷酸二钠和三钠、磷酸二钾和三钾、三聚磷酸钠、tris、三乙醇胺、聚乙烯亚胺。在一个优选的实施方案中，提供高于肽开始经历自组装ph(例如ph7.5)0.1至0.5个ph单位的特定ph的缓冲剂为tris。用于制备步骤a)的溶液的缓冲剂具有足以提供高于肽开始经历自组装ph0.1至0.5个ph单位的ph的浓度。同时，缓冲剂浓度应尽可能低，以便在冻干后提供低离子强度。在一个优选的实施方案中，步骤a)溶液中的缓冲剂浓度小于200mm、小于150mm、小于100mm、小于50mm、小于40mm、小于30mm、小于20mm或小于10mm。在更优选的实施方案中，缓冲剂为小于200mm、小于150mm、小于100mm、小于50mm、小于40mm、小于30mm、小于20mm或小于10mm浓度的tris。在一个优选的实施方案中，缓冲剂为约4mm浓度的tris。步骤a)的溶液可进一步包含另外的组分，例如盐，如氯化钠。技术人员已知，肽的组装状态也受溶液中离子强度影响。溶液的离子强度随该溶液中存在的所有离子的浓度而变化。因此，即使在高于肽开始经历自组装ph的ph，即，肽在溶液中基本为单体时，特别高的离子强度也可能引发肽组装。然而，当离子强度在生理范围时，即，相当于或低于对应于150mmnacl离子强度，本发明的肽组装有利地不被引发。技术人员将知道如何确定和测定溶液的离子强度。离子强度i一般根据式i=½∑zi2bi计算，其中z为化合价因子，bi为第i种离子浓度的重量摩尔浓度[mol/kg{h2o}]。总和∑对溶液中的所有离子求得。例如，150mmnacl溶液的离子强度为约0.15。这也近似为血液的离子强度。口腔中存在的唾液的离子强度一般低得多，例如约0.04。因此，在一个优选的实施方案中，步骤a)溶液的离子强度小于0.15，小于0.1，小于0.05，或小于0.025。在一个优选的实施方案中，步骤a)溶液的离子强度小于0.15。在更优选的实施方案中，溶液小于0.1。技术人员了解测定溶液离子强度的很多方法。例如，离子强度可通过russell因子从测定溶液的电导(s=1/ω=a/v)如下估算：i=1.6×10-5×比电导[µs/cm]。150mmnacl溶液具有约80-100ms/cm电导。因此，根据以上和所述电导估算，步骤a)的溶液具有低于100ms/cm的电导，优选低于80ms/cm。另外，技术人员了解确定本发明的肽在指定离子强度开始自组装的ph的很多方法。适合方法例如在出版物中由aggelietal.(2003,jamchemsoc,125,9619-9628)概述。在以上方法的步骤b)中，向溶液加入使溶液ph提高到8.0或更高的碱性化合物。优选使步骤b)中的所述ph提高到8.0或更高，优选提高到8.0-9.5，更优选提高到ph8.5。碱性化合物为部分或完全挥发性，以便在冻干期间通过与水一起蒸发去除。在一个优选的实施方案中，在步骤c)中去除大于70%、大于80%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%且甚至更优选大于99%挥发性化合物。如果在冻干物中保留痕量的这种化合物，则与没有任何该化合物的相同溶液比较，这些量将不足以在冻干物重构后使ph提高大于0.3个ph单位。用于在本发明方法步骤b)中提高ph的适合碱性化合物包括但不限于例如氨(nh3)、2-氨基乙醇(单乙醇胺)、4-甲基吗啉和吡啶。特别优选在本发明方法的步骤b)中使用氨。技术人员应能够确定使溶液ph提高到8.0或更高所需碱性化合物的浓度。可通过常规方法在加入碱性化合物时确定ph。例如，在简单的方法中，通过使用ph指示剂(例如溴百里酚蓝)、ph计或ph条，可确定溶液中的ph。将提高ph的化合物加入到溶液，直至达到8.0或更高的ph。优选加入提高ph的化合物，直至达到ph至少8.0、至少8.2、至少8.4、至少8.6、至少8.8、至少9.0的ph。在本发明方法的步骤b)中，使ph提高，直至基本所有的自组装肽为单体形式。技术人员应能够通过常规试验确定是否基本所有的自组装肽为单体形式。例如，通过核磁共振(nmr)(如，1h-nmr)、圆二色谱分析、动态光散射(dls)分析、扩散波波谱学、天然电泳方法、傅里叶变换红外光谱(ftir)、粘度测定(流变)等，可确定溶液中肽的组装状态。另外，也可根据所得溶液的粘度估计组装状态，因为显著程度的组装将改变肽溶液的粘度。例如，在水溶液中，肽p11-4(seqidno:1)高于ph7.5作为各向同性流体存在，在约ph7.5和约ph5之间作为向列流体存在，在约ph5和约ph3之间作为絮凝物存在，低于ph3作为向列胶存在(aggelietal.,2003,jamchemsoc,125:9619-9628;图3)，相当于随ph递减肽自组装。通过目视检查溶液的流动性质，可评估溶液的粘度。例如，虽然各向同性流体可通过针有效喷出，但对于更粘性相，情况并非如此。当本发明的肽在溶液中基本为单体时，即，溶液作为各向同性流体存在，则溶液具有相对较低粘度，这有利于容易地通过针喷出溶液。例如，当本发明的肽在溶液中基本为单体时，则可容易地通过具有例如1.6mm或1.1mm直径的针喷出溶液。为了防止溶液中的肽降解和/或沉淀，一般不使ph提高到高于10.5的值。一般已知肽的化学性质取决于氨基酸序列。例如，半胱氨酸和甲硫氨酸残基的可逆氧化可在较高ph加速，此时，硫醇更容易去质子化，并容易形成链内或链间二硫键。技术人员应了解受碱性ph不利影响的氨基酸侧链，并且能够通过常规试验确定保持自组装肽完整性完整的最高ph。例如，可根据肽中存在的各氨基酸的已知性质预测此最高ph。或者，可用生物化学方法(例如，电泳方法)确定肽的完整性。优选在加入碱性化合物后步骤b)中的ph在8.0和10.5之间，更优选在8.0和10.0之间，最优选在8.0和9.5之间。另外，步骤b)中的ph可在8.5和10.5之间，或者在8.0和10.0之间。另外，如以上关于步骤a)的溶液所述，通过加入以上限定碱性化合物，步骤b)中溶液的离子强度不应提高大于0.15，从而防止本发明的肽组装。因此，步骤b)溶液的离子强度应小于0.15，小于0.1，小于0.05，或小于0.025。在一个优选的实施方案中，步骤b)溶液的离子强度小于0.15。在更优选的实施方案中，溶液小于0.1。以上关于步骤a)溶液离子强度所作的所有说明也适用于步骤b)的溶液。在本发明的一个实施方案中，在以上方法的步骤b)和步骤c)之间增加过滤步骤b1)，以使肽溶液灭菌。可在本发明的方法中使用在本领域已知的任何过滤技术。由于肽溶液过滤是常规措施，技术人员应能够在没有创造性活动下确定必需的滤器类型、孔径和有效过滤的常规程序。在另一个实施方案中，在填充步骤b2)将步骤b)或b1的肽溶液填入容器。填充步骤b2)优选在步骤b)和步骤c)之间或者在步骤b1)和步骤c)之间进行。优选将规定体积的肽溶液填入容器。规定体积例如在约5µl和1ml之间、在约5µl和500µl之间或在约10µl和250µl之间。例如，规定体积优选低于1ml、低于500µl、低于250µl或低于50µl。然而，规定体积当然也可大于1ml。填充可用移液器、管或注射器等进行。肽溶液可人工填入容器，例如，通过移取溶液，或者自动填充，例如在高通量设备中。容器可以为适用于容纳液体肽溶液的任何性质。例如，容器可以为管形瓶。优选管形瓶或容器由玻璃或硬塑料制成。管形瓶或容器材料优选为化学惰性，并且不与肽溶液可观反应。更优选肽溶液不或基本不粘住容器壁。因此，材料可具有防止肽粘住材料的静电性质。在一个优选的实施方案中，步骤b1)和步骤b2)作为组合步骤进行，即，将规定体积的肽溶液滤入容器。优选在冻干后在步骤d)封闭容器或管形瓶。例如，可将容器或管形瓶加盖或密封。适合的盖和密封在本领域已知。在以上方法的步骤c)中，将溶液冻干。可在本发明的方法中使用在本领域已知的任何冻干方法。冻干一般包括三个主要阶段：冷冻、初级干燥和次级干燥。冷冻使水转变成冰，或者使一些无定形组合物组分转变成晶形。初级干燥为通过在低压和低温直接升华从冷冻产物去除冰时的过程步骤。次级干燥为利用残余水扩散到蒸发表面，从产物基质去除结合水的过程步骤。可用任何种类的冷冻干燥器冻干，例如歧管冷冻干燥器、旋转冷冻干燥器、多架(multi-shelve)冷冻干燥器或盘式冷冻干燥器。包含自组装肽并且经过冻干的溶液也可包含赋形剂，例如，稳定剂、填充剂和/或表面活性剂，已证明这些赋形剂可用于防止肽在冷冻干燥和/或储存期间降解，或支持经干燥肽的再水合。因此，在步骤c)前，可加入适合的赋形剂以防止蛋白在冻干期间受到脱水应力，以在冻干期间提高蛋白稳定性，提高饼状物(cake)(冻干物)稳定性和/或提高储存期间冻干肽的稳定性。优选赋形剂在步骤a)和步骤b)之间加入。具体地讲，赋形剂具有使肽在冻干和/或储存期间基本保持其物理和化学稳定性及其单体状态的作用。一般适合的赋形剂为不带电荷和/或非还原糖(例如蔗糖、棉子糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇)或其衍生物(例如二水合海藻糖)或氨基酸(例如，甘氨酸、精氨酸和甲硫氨酸)。其它适合的稳定剂包括柠檬酸、碳酸氢钠、edta、苄醇、氯化钠或乳糖。在一个优选的实施方案中，加入的稳定剂或填充剂为选自甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖的非还原糖和甘氨酸或其衍生物(例如二水合海藻糖)。在一个特别优选的实施方案中，在本发明的方法中，二水合海藻糖在步骤c)之前加入。冻干前溶液中稳定剂和/或填充剂的量取决于要冻干组合物中所用的具体肽和组分。例如要用于非还原糖的一般量包括步骤a)、b)或d)中任何溶液的0.1-5%，优选1-4%，更优选2-3%。例如要用于非还原糖(例如，二水合海藻糖)的适合量包括约1至30mg/ml，约5至20mg/ml，例如约10mg/ml。从步骤c)得到的组合物为适用于运输和储存的冻干物，因为它非常稳定，即防止肽降解或不合需要地自组装。因此，在本发明方法的一个实施方案中，使冻干物溶于水溶液，以得到具有高于肽开始经历自组装ph0.1至0.5个ph单位的ph的包含单体状态肽的溶液。例如，在例如牙科医生用冻干物治疗龋齿损伤时，向冻干物加入水溶液(例如，水)，以得到具有高于肽开始经历自组装ph0.1至0.5个ph单位的ph的包含单体状态肽的最终溶液。冻干物优选溶于纯净水，更优选溶于去离子水。然而，可使冻干物溶于任何种类的水溶液，只要所得溶液具有高于肽开始经历自组装ph0.1至0.5个ph单位的ph，且包含单体状态的肽。在一个优选的实施方案中，水溶液，例如水，具有相当于在25℃小于5ms/cm电导的离子强度。在步骤a)溶液中存在非挥发性缓冲剂的情况下，它仍存在于冻干物中。冻干物优选溶于足以得到0.1至100mg/ml之间、0.5至50mg/ml之间、1至40mg/ml之间、1至30mg/ml之间、1至20mg/ml之间或1至10mg/ml之间肽浓度的体积。在一个特别优选的实施方案中，冻干物优选溶于足以得到1至10mg/ml之间肽浓度的体积。在更优选的实施方案中，冻干物优选溶于足以得到约2mg/ml肽浓度的体积。另外，如以上关于步骤a)的溶液所述，步骤d)溶液的离子强度应小于0.15，小于0.1，小于0.05，或小于0.025。在一个优选的实施方案中，步骤d)溶液的离子强度小于0.15。在更优选的实施方案中，溶液小于0.1。以上关于步骤a)溶液离子强度所作的所有说明也适用于步骤d)的溶液。为了使肽在溶液中的时间最大限度地减少，优选恰在施用到牙齿之前溶解冻干物。具体地讲，优选冻干物在使用前1小时内溶解，优选在使用前约45分钟内，在使用前约45分钟内，在使用前约45分钟内，在使用前约30分钟内，在使用前约25分钟内，在使用前约20分钟内，在使用前约15分钟内，在使用前约10分钟内，甚至更优选在使用前约5分钟内或更少。在另一个方面，本发明提供一种组合物，例如用于治疗龋齿损伤的组合物和/或用于使牙齿表面和/或龋齿损伤再矿化的组合物。组合物优选为用于重构的包含在低于7.5的ph值经历自组装的上述肽之一的冻干形式的组合物，其中通过冻干物重构，得到具有高于肽开始经历自组装ph0.1至0.5个ph单位的ph的溶液，其中肽主要以单体形式存在。如上所述，肽优选包含序列x1-x2-x1-x2-x1，其中x1为具有酸性侧链的氨基酸，x2为具有疏水侧链的氨基酸，选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。更优选肽包含序列glu-x2-glu-x2-glu或asp-x2-asp-x2-asp，其中x2为具有疏水侧链的氨基酸，选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。例如，组合物可包含一种肽，所述肽包含seqidno:1或seqidno:2所示序列或与其具有至少80%序列同一性的序列。在一个优选的实施方案中，至少70%肽以单体形式存在，优选至少80%，更优选至少90%。本发明的组合物优选通过上述方法得到。在一个实施方案中，本发明提供一种组合物，所述组合物包含在本发明方法步骤c)中得到的冻干物或在所述方法步骤d)中得到的重构溶液。可使组合物与有助于将单体肽给予治疗部位(即，牙齿损伤部位或牙腔)的另外化合物混合。例如，可使在步骤d)中得到的重构溶液与溶媒例如水凝胶混合。在本发明情况下，水凝胶是指不溶于水但吸收水且经历溶胀而导致显著体积增加的共价或非共价互连聚合物网络。优选在溶胀时体积增加为10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更大。优选的水凝胶包含透明质酸或聚氨酯或由其组成。用于药物施用的水凝胶一般已知，并且可从不同制造商购得。本发明也提供用于治疗龋齿损伤(例如，表层下龋齿损伤)的方法，其中将本发明的组合物给予有需要的患者。在另一个方面，本发明提供使牙齿表面和/或龋齿损伤(优选表层下龋齿损伤)再矿化的方法，其中将本发明的组合物给予有需要的患者。因此，可在治疗龋齿损伤(优选表层下龋齿损伤)的方法中使用上述组合物。在一个优选的实施方案中，可在使牙齿表面和/或龋齿损伤(优选表层下龋齿损伤)再矿化的方法中使用以上组合物。可将本发明的组合物直接由开业医师施用到需要治疗的牙齿，或者通过在口腔损伤部位使药物组合物与酸性环境有一定隔离的装置。例如，可借助于液体药物输送装置施用组合物，如wo2011/104712a1、wo2011/104711a1、wo2011/058545、wo2005/105014a2所述。液体药物输送装置可例如包括在口腔损伤部位中使组合物与酸性环境隔离的密封布置。附图简述图1示出了自组装肽p11-4的序列(seqidno:1)和n端和c端修饰的p11-4的序列(seqidno:2)。图2显示在冻干前(a)、在冻干前填充后(b)和在冻干后(c和d)本体溶液中的实例组合物。(b)中的组合物已只为了可视化目的而染色。图3显示p11-4(c=6.3mm)随ph(dcl/naod)变化的相性质：i=向列胶，ii=絮凝物，iii=向列流体，iv=各向同性流体。○=零剪切粘度，和●=用ftir波谱学测定的%β-片：连续线表示原纤中肽的比例。分隔区域i、ii和iii的垂直虚线表示不同宏观原纤态之间的近似界线，而分隔区域iii和iv的虚线表示第一级向列-各向同性转变。(图从aggelietal.(2003,jamchemsoc,125,9619-9628)经许可而复制)在以下实施例中更详细地例示本发明的方法。实施例实施例1：制备肽溶液使用前，在5+/-3℃将具有seqidno:2中所示序列的经修饰p11-4肽解冻24小时。在搅拌下，在室温经至少10分钟将4mmtris加入到wfi水(注射用水)。在连续搅拌下，将二水合海藻糖加到10mg/g最终浓度。随后将肽p11-4加到2mg/ml最终浓度，并在搅拌下溶解至澄清。这种肽溶液最初具有约8.2的ph。用1%nh4oh溶液将肽溶液的ph调节至8.5+/-0.4。随后将肽溶液通过sartopore滤器无菌过滤。将无菌溶液填入管形瓶，然后在多架冷冻干燥器中冻干。在-45℃冷冻1至3小时后，使管形瓶在30℃经过主干燥步骤10至13h，并在30℃经过后干燥步骤7至10小时。用200至800mbar氮提供充气。将管形瓶在30℃和200mbar封闭，并加盖用于运输。随后目视检查管形瓶的饼状物(即，冻干物)的完整性。结果：在溶解后，肽溶液为向列粘弹性流体形式。在将ph调节到8.5后，肽溶液显得澄清和非粘性，为一种各向同性流体(图2a)。在溶液填入管形瓶后，溶液仍显得澄清和非粘性(图2b：实例等分试样，只为了溶液可视化而染蓝)。冻干产生显示良好储存稳定性的完整“饼状物”，即冻干物(图2c)。实施例2：制备具有不同浓度的肽溶液如上所述制备具有不同缓冲剂(tris)、肽(p11-4)和填充剂(二水合海藻糖)浓度的肽溶液。如上所述调节ph。结果:在溶液填入管形瓶后，所有三种溶液显得澄清和非粘性。冻干产生显示良好储存稳定性的完整“饼状物”，即冻干物。实施例3：p11-4肽溶液的粘度为了评价在肽溶液中的组装状态，试验p11-4肽溶液通过不同的填充针。p11-4本体溶液的组成如下配混p11-4本体溶液。表1：表1显示溶液的组成使p11-4、二水合海藻糖(hayashibaraco.ltd.,lotnr.9d081)和tris(carlroth,a411.1)溶于约200g纯净水。用约0.5ml1%nh3-溶液将ph调节到8.5。将最终重量的本体溶液用纯净水调节至250g。然后用连接到蠕动泵(520di,watson-marlowpumpsgroup,falmouth,unitedkingdom)的acrodisc®25mm注射滤器(0.22μmfluorodyne®ii膜)过滤溶液，蠕动泵以10rpm泵速递送本体溶液。肽溶液密度配混p11-4本体溶液，并用dma300便携式密度计(antonpaargermanygmbh,ostfildern,germany)测定溶液的密度。用注射器将本体溶液填入密度计。通过密度计自动补偿温度到25℃。进行肽溶液的密度测定。溶液在25℃达到1.001mg/ml密度，n=2。肽溶液的粘度将edm3295定量配料机(bausch+ströbelmaschinenfabrikgmbh+co.kg,ilshofen,germany)调节到250mg填充重量。将试验嵌入(inlay)管形瓶空称，用本体溶液填充，在填充后再次称重。表2给出用填充针443009l(ø1.6mm，长度96mm；材料编号：aisi316l)填充的试验结果。平均[mg]248.4sd[mg]0.3rel.sd[%]0.12xsd[mg]0.72xrel.sd[%]0.3最小[mg]248.0最大[mg]249.3n20表2：用填充针443009l(ø1.6mm)填充的统计评价试验表3给出用填充针443008l(ø1.1mm，长度96mm；材料编号：aisi316l)填充的试验结果。表3：用填充针443008l(ø1.1mm)填充的统计评价试验在250mg填充重量，两种填充针均显示小于1.0mg(即，最小物质损失)的可比填充精确度。因此，肽溶液能够有效地通过两种针。基本上不出现针堵塞。溶液的粘度低得足以使针通过。这表明，肽溶液作为各向同性流体存在(关于随ph变化的肽p11-4的相性质，比较aggelietal.,2003,jamchemsoc,125:9619-9628)。序列表<110>克里登蒂斯股份公司<120>用于制备治疗牙齿损伤的组合物的方法<130>p87324<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>11<212>prt<213>人工<220><223>设计的自组装肽p11-4<400>1glnglnargpheglutrpgluphegluglngln1510<210>2<211>11<212>prt<213>人工<220><223>设计的自组装肽p11-4mod<220><221>mod_res<222>(1)..(1)<223>乙酰化<220><221>mod_res<222>(11)..(11)<223>酰胺化<400>2glnglnargpheglutrpgluphegluglngln1510<210>3<211>5<212>prt<213>人工<220><223>设计的自组装肽<220><223>变体<222>(1)..(1)<223>具有酸性侧链的氨基酸<220><223>变体<222>(2)..(2)<223>具有疏水侧链的选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的氨基酸<220><223>变体<222>(3)..(3)<223>具有酸性侧链的氨基酸<220><223>变体<222>(4)..(4)<223>具有疏水侧链的选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的氨基酸<220><223>变体<222>(5)..(5)<223>具有酸性侧链的氨基酸<400>3xaaxaaxaaxaaxaa15<210>4<211>5<212>prt<213>人工<220><223>设计的自组装肽<220><221>variant<222>(2)..(2)<223>具有疏水侧链的选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的氨基酸<220><223>变体<222>(4)..(4)<223>具有疏水侧链的选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的氨基酸<400>4gluxaagluxaaglu15<210>5<211>5<212>prt<213>人工<220><223>设计的自组装肽<220><223>变体<222>(2)..(2)<223>具有疏水侧链的选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的氨基酸<220><223>变体<222>(4)..(4)<223>具有疏水侧链的选自丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的氨基酸<400>5aspxaaaspxaaasp15当前第1页12