铁皮石斛原球茎对皮肤祛斑及修复药效作用的方法与流程

本发明涉及一种铁皮石斛原球茎对皮肤祛斑及修复药效作用的方法。

背景技术：

铁皮石斛石斛具有生津作用，主要表现为促进腺体分泌和脏器运动，铁皮石斛对可降低链脲霉素诱发糖尿血糖值。另外铁皮石斛颗粒(tpsh)可促进荷瘤动物巨噬细胞的吞噬功能，增强t淋巴细胞的增殖和分化及nk细胞的活性，并能明显提高荷瘤动物的血清溶血素值，提示tpsh无论是对非特异性免疫功能，或是特异性细胞免疫以及体液免疫功能，均有一定的提高作用。但是目前对于铁皮石斛抗光老化的药效研究却非常少有。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提出一种铁皮石斛原球茎对皮肤祛斑及修复药效作用的方法。

本发明的一种铁皮石斛原球茎对皮肤祛斑及修复药效作用的方法，其特征在于，包括如下步骤：s101：首先对铁皮石斛原球茎粉末进行样品处理；s102：将所述样品对裸鼠进行分组给药，然后解剖所述裸鼠并收集其皮肤组织和血清进行观察和测定，并对铁皮石斛原球茎的药效进行评价。

本发明的铁皮石斛原球茎对皮肤祛斑及修复药效作用的方法，实验显示10mg/ml～50mg/ml的铁皮石斛原球茎混悬液经皮给药具有抗光老化作用，其中50mg/ml的原球茎混悬液的光老化修复作用更理想，光老化探索实验表明原球茎具有较高的开发潜能。

另外，本发明上述的铁皮石斛原球茎对皮肤祛斑及修复药效作用的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

进一步地，所述步骤s101具体包括如下步骤：首先将铁皮石斛原球茎粉末溶于去离子水中，制备成50mg/ml的混悬液，然后制备25mg/ml的中剂量组和10mg/ml的低剂量组，将基肽制备成10mg/ml的水溶液作为对照的阳性给药组。其中，基肽为棕榈酰五肽-3。

进一步地，所述步骤s102具体包括如下步骤：s1021：将裸鼠分为数量相等的6组，依次为空白组、模型组、阳性给药组、10mg/ml给药组、25mg/ml给药组、50mg/ml给药组，然后在22℃～27℃温度下、63％～67％的湿度下采用12h光暗周期进行适应性饲养6天～8天；s1022：对模型组、阳性给药组、10mg/ml给药组、25mg/ml给药组、50mg/ml给药组的小鼠从第二周开始照射紫外灯，连续照射4周，每隔3天照射1次～2次，每次0.8h～1.2h，然后从第5周开始停止照射紫外线，开始给药，连续给药6周，每隔1天～1.5天给药1次，观察并记录裸鼠皮肤的表观，然后在第11周给药结束，解剖所述裸鼠，并收集皮肤组织和血清，用于微观指标观察及测定，用以验证药效；其中，模型组裸鼠在结束4周照射之后，给空白溶剂。

进一步地，采用气质联用方法分析所述裸鼠的皮肤组织和血清中的脂溶性成分。

进一步地，所述气质联用方法的具体步骤如下：首先将铁皮石斛原球茎粉末与正己烷按照料液比0.5g：(38ml～42ml)混合后在65℃～75℃温度下回流2h～4h，然后回收所述正己烷，并将所述铁皮石斛原球茎粉末烘干后按照料液比为0.5g：(8ml～12ml)混合进行气质联用分析。

进一步地，在进行气质联用分析时，气相柱温箱的初始温度为58℃～62℃，保留2min；然后按照38℃/min～42℃/min的升温速率升温至178℃～182℃，保持2分钟；然后按照5℃/min～9℃/min的升温速率升温至248℃～252℃，保持2分钟；然后按照8℃/min～12℃/min的升温速率升温至278℃～282℃并保持10min。

进一步地，在进行气质联用分析时，质谱进样口温度为278℃～282℃，传送线温度为278℃～282℃，离子源温度为248℃～252℃。

进一步地，在进行气质联用分析时，载气为氦气且流量为1.0ml/min；进样量为2μl，分流比为30:1。

进一步地，在所述步骤s101中，所述铁皮石斛原球茎粉末的制备方法包括如下步骤：首先将铁皮石斛原球茎冻干，然后粉碎成粒径为2800目～3200目的粉末。

本发明的另一个目的在于提出所述的方法在临床医学领域的应用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1是实验裸鼠皮肤水分和斑点量化图；其中，图(1a)皮肤水分图；(1b)为皮肤斑点图；

图2是裸鼠背部皮肤组织切片增生皮脂腺和增厚表皮的量化图；其中，图(2a)为增生皮脂腺量化图，(2b)为皮肤表皮厚度量化图；

图3是实验裸鼠血清抗氧化指标；其中，(3a)实验裸鼠血清中cat的含量；(3b)实验裸鼠血清中sod的含量；(3c)实验裸鼠血清中gsh-px的含量；(3d)实验裸鼠血清中tbars的含量。柱状图上的不同标记字母(a,b)用于表示分组间统计学差异情况，相同符号的分组间具有统计学差异(p<0.05)；

图4是实验裸鼠皮肤组织基质金属蛋白酶mmps指标图；(4a)为裸鼠皮肤组织mmp-1表达量柱状图；(4b)为裸鼠皮肤组织mmp-3表达量柱状图给；柱状图上的不同标记字母(a,b)用于表示分组间统计学差异情况，相同符号的分组间具有统计学差异(p<0.05)；

图5为原球茎脂溶性成分气质联用检测图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

1.1实验材料

新鲜铁皮石斛原球茎(从广州中医药大学组培实验室获得，由广州中医药大学鉴定实验室张桂芳教授鉴定，确定为铁皮石斛原球茎)冻干，粉碎成超微粉，七周龄bc_nu裸鼠(广州中医药大学实验动物中心)，阳性药基肽，mda试剂盒(碧云天生物科技有限公司)，sod试剂盒、cat试剂盒(南京建成生物工程研究院)，mmp-1、mmp-3elisa试剂盒(瑞舒生物科技有限公司)，紫外灯，遮光帘。

1.2实验方法

1.2.1样品处理方法

精密称取铁皮石斛原球茎超微粉0.25g溶于5.0ml去离子水中，制成50mg/ml的混悬液作为高剂量组。分别以高剂量的50％、20％作为中、低剂量(分别为25mg/ml，10mg/ml)。基肽制成10mg/ml水溶液作为阳性药。

1.2.2光老化模型造模方法

试验裸鼠分成6组，每组8只(空白组、模型组、阳性给药组、10mg/ml给药组、25mg/ml给药组、50mg/ml给药组),25℃65％湿度12小时光暗周期适应性饲养一周。

非空白组裸鼠从第二周开始照射紫外灯(100mj/cm²)，连续4周，每周2次，每次1h。从第5周开始停止照射开始给药，连续六周，每周4次。观察并记录裸鼠皮肤表观。第11周给药结束解剖裸鼠，收集皮肤组织和血清用于微观指标观察及测定。

1.2.3脂溶性成分气质联用分析方法

准确称取0.5g铁皮石斛原球茎超微粉于锥形瓶中，加入40ml正己烷70℃回流3h。回收正己烷，残留物溶于10ml氯仿用于气质联用分析。气相柱温箱初始温度为60℃，保留2min；以40℃/min升温至180℃，保持2分钟；6℃/min升温至250℃，保持2分钟；10℃/min升温至280℃并保持10min。质谱进样口温度为280℃，传送线温度280℃，离子源温度250℃。载气为氦气且流量为1.0ml/min；进样量为2μl，分流比为30:1。

1.3结果分析

由图1可知，空白组裸鼠不照射不给药，皮肤出现干燥、溃疡点；模型组小鼠只接受紫外辐射不给药，较空白组裸鼠皮肤干燥、粗糙、起皮、长斑及溃疡点，表现出光老化的普遍症状，模型成功，适用于进一步试验。阳性对照裸鼠照射之后给阳性药，其皮肤与模型组相比，状态明显改善，出现少量的溃疡点；样品给药组裸鼠照射之后给铁皮石斛原球茎混悬液，其皮肤未出现干燥、粗糙、起皮、长斑、溃疡点等症状。对皮肤水分及溃疡点进行量化，可明显观察到紫外线照射之后的裸鼠皮肤含水量降低，这种紫外照射引起的皮肤失水可以被原球茎混悬液改善，实验浓度下的原球茎混悬液对裸鼠皮肤具有一定的保湿作用；由于裸鼠的抵抗力较低，在实验的后期空白裸鼠皮肤出现了溃疡点，紫外照射使溃疡点数量增多，阳性药能够降低溃疡点的形成，而铁皮石斛原球茎给药组裸鼠皮肤均未出现溃疡点，说明原球茎能够抑制溃疡点的生成，由裸鼠皮肤表观特征可初步判断浓度为10mg/ml～50mg/ml的铁皮石斛原球茎经皮给药能够修复由紫外照射诱导的光老化。

1.3.2裸鼠皮肤组织切片观察

如图2所示，紫外照射使模型裸鼠皮肤角质层加厚、皮脂腺增生、皮下细胞及胶原蛋白纤维紊乱，导致皮肤出现松弛、干燥等症状，这与目前的研究是一致的。与模型组裸鼠相比，原球茎给药组裸鼠皮肤状态有明显的改善，随给药浓度升高，其角质层厚度逐渐回归正常、增生的皮脂腺减少、皮下细胞和胶原蛋白纤维更为规整，高浓度效果接近阳性对照组。对皮肤增生的皮脂腺和表皮厚度进行量化，显示紫外照射能够引发皮脂腺增生，而这种皮脂腺的增生可以被原球茎混悬液抑制，且呈剂量依赖关系，浓度越高，其抑制作用越明显；紫外照射增加皮肤角质层的厚度，原球茎混悬液能够改善紫外辐射诱导的表皮增厚，其改善作用与阳性药效果相似且与剂量无关。

1.3.3抗氧化指标的测定及分析

如图3所示，采用抗氧化指标试剂盒(cat、sod、gsh-px检测试剂盒)检测实验动物组织中过氧化物酶的含量，以此判断原球茎混悬液与阳性药的抗氧化能力。与模型组相比，铁皮石斛原球茎过氧化物酶的含量明显增加，并且呈现微弱的剂量依赖关系。原球茎混悬液的含量越高，其对过氧化酶的升高作用越明显。高剂量(50mg/ml)原球茎给药组的过氧化氢酶cat的含量达到模型组的两倍(p<0.05)，说明原球茎具有抗氧化活性，尤其是抗过氧化氢活性。过氧化物以及脂质氧化产物与硫代巴比妥酸(tba)反应生成红色产物。mda试剂盒利用这样的原理用于检测硫代巴比妥酸反应物(tbars)的含量，指示脂质氧化程度。紫外照射使实验裸鼠产生大量的tbars，阳性药可以较大程度降低tbars的生成。三个剂量的原球茎给药组对tbars的产生都有一定的抑制作用，且呈剂量依赖关系，50mg/ml的原球茎给药组对tbars的抑制作用最强(p<0.05)，且接近阳性药给药组。

1.3.4基质金属蛋白酶mmps的表达量测定

如图4所示，mmps通过破坏皮肤基底膜结构，降解胶原纤维等细胞外基质成分进而促进皱纹的产生。与空白组相比，紫外照射提高了mmp-1(0.51％)和mmp-3(40.0％)的表达，说明紫外照射使皮肤组织mmps表达量升高，从而促使皮肤组织蛋白纤维紊乱，细胞外基质流失，出现松弛和皱纹，与实验动物表观拍片与切片观察结果一致。原球茎给药组裸鼠皮肤组织mmps的表达量降低，且三个不同的原球茎剂量对mmp-3的抑制作用均较为明显(图4b)，与模型组相比，具有显著的差异(p<0.05，分别为0.010，0.004，0.004)。由此可知由紫外照射引起的mmps的升高可以被原球茎改善。

原球茎给药对各指标的影响如表1所示：

表1各分组实验动物抗氧化指标和mmps指标统计表

注：与model比较，*：p＜0.05

1.3.5脂溶性挥发成分的检测

表2原球茎脂溶性成分气质联用检测化合物分类表

表4原球茎特征成分定量表

利用气质联用检测到一系列挥发性脂溶性化合物，其中与皮肤保护相关的化合物由鲨烯、维生素e、羽扇豆醇、油酸以及一些长链化合物。鲨烯、维生素e和羽扇豆醇定量如表3、表4示。

1.4小结及讨论

光老化现象是指重复暴露于紫外辐射环境中而引起的体内氧化产物和脂质氧化产物累积，诱导角质形成细胞的增殖和表皮增生，同时减少i型胶原蛋白的产生，导致胶原蛋白的丢失，进而引起的皮肤疾病，其症状包括出现晒斑、干燥粗糙、皱纹、皮肤弹性下降等。药理学研究显示光老化涉及mmps和抗氧化指标(cat、sod、gsh-px、mda)的变化。作为阳性药的基肽，是一种著名的抗衰老物质。它能改善分子透过皮肤脂质结构的渗透，且能与特定受体相互作用来调节细胞活动，激活细胞外基质大分子的新合成，具有强大的抗皱作用。本实验采用紫外照射裸鼠后背皮肤造成光老化模型之后，局部涂抹原球茎水溶混悬液与阳性药基肽对比给药，通过观察裸鼠皮肤表观及微观特征，结合检测相关指标成分的表达，来评价实验动物光老化程度及原球茎抗光老化作用的强弱。

给药结束之后，得到实验裸鼠的表观拍片和切片。在表观拍片中，观察到空白对照、模型组、阳性对照这三个非原球茎给药组均出现了皮肤溃疡点(在文中统计为erythema，图1b表示)，模型组裸鼠的溃疡点数量明显较其他两组多，阳性药可以改善溃疡点症状。这说明紫外辐射不是导致溃疡点产生的唯一原因，裸鼠本身免疫力低下可能是造成溃疡点形成的因素，而紫外辐射使溃疡症状恶化。紫外辐射对表皮组织与真皮组织都有一定的损伤。表皮作为皮肤最外层的保护屏障，我们认为表皮的增厚是皮肤对紫外辐射的适应性反应，起到保护的作用。胶原蛋白和弹性蛋白是细胞外基质的主要结构蛋白。在细胞外基质重构过程中，表皮角质细胞和纤维母细胞会产生mmps和弹性蛋白酶等蛋白水解酶。mmps的作用类似胶原蛋白水解酶，其表达量升高将降低胶原蛋白的密度，使蛋白纤维紊乱。在显微切片中，观察到模型组裸鼠皮肤出现增厚的表皮、紊乱的胶原蛋白纤维、增生的皮脂腺。这些症状在原球茎与阳性药给药之后能够得到有效的缓解，mmps的检测数据与显微切片所观察的结果相对应，说明原球茎混悬液与阳性药都能抑制mmps的产生，mmps参与光老化症状的形成。结果更提示了在抗衰老的过程中，扭转组织中mmps的表达可以起到抗紫外辐射引起的衰老的效果。

通过检测cat、sod、gsh-px、tbars的水平评价原球茎的抗氧化作用，并观察其与抗光老化作用的联系。实验结果显示紫外照射使裸鼠血清中的抗过氧化物酶的含量减少从而使过氧化物和脂质氧化产物的水平升高。50mg/ml的原球茎能够有效升高cat的含量且其升高的效果与阳性药相似；三个剂量的原球茎都能抑制tbars的产生，且存在剂量依赖关系，原球茎的含量越高其抑制效果更为明显。相比之下，原球茎对sod和gsh-px的升高效果远不及阳性药明显，且不同的剂量之间差异不大，可以认为原球茎混悬液经皮给药对裸鼠具有一定的抗氧化作用，其抗光老化的作用可能与抗氧化作用的有关。

为进一步探索原球茎的抗光老化作用，本实验对原球茎脂溶性成分进行气质联用检测，得到一系列脂溶性成分，其中包括维生素e、羽扇豆醇、角鲨烯、油酸、豆甾醇等，这些化合物据报道具有皮肤保护作用。例如：维生素e是一种脂溶性抗氧化剂，可与细胞膜结合，从而防止氧化损伤；羽扇豆醇是一种抗炎剂，主要作为白细胞介素系统的一部分，在实验室模型中有效抑制前列腺癌和皮肤癌；角鲨烯、油酸和豆甾醇是皮脂腺产生的常见脂类；角鲨烯起局部皮肤润滑和保护作用等。

化学成分的气相联用检测结果为原球茎抗光老化效应的相关因素提供了一条线索，我们怀疑原球茎的抗光老化作用可能与这些化合物有关，然而，这些化合物的护肤作用研究较少，由于文献和研究的限制，这种相关性仅仅在猜测层面。尽管如此，基于维生素e、角鲨烯、羽扇豆醇的护肤作用，本实验作此猜想并提供了这些化合物的定量数据，这些化合物与抗光老化作用是否具有直接关系还需要更深入验证。

结合后面部分的代谢组的数据，原球茎里面含有的游离氨基酸，如赖氨酸具有修复损伤皮肤的作用，这种作用可能对修复裸鼠光损伤具有协同作用。

总而言之，实验显示10mg/ml～50mg/ml的铁皮石斛原球茎混悬液经皮给药具有抗光老化作用，其中50mg/ml的原球茎混悬液的光老化修复作用更理想。光老化探索实验表明原球茎具有较高的开发潜能，然而目前我们对原球茎知之甚少，其代谢组分和药理作用方面都值得更深入的研究。于是，本课题接下来采用转录组测序和色谱技术对原球茎进行代谢组学研究，并对比了铁皮石斛成熟茎。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。