异鼠李素在制备治疗肺动脉高压药物中的用途的制作方法

一技术领域

本发明属于心血管疾病领域，具体地，本发明提供了异鼠李素在制备治疗肺动脉高压的药物中的用途。

二

背景技术：

肺动脉高压(pulmonaryarterialhypertension，pah)是不同病因导致的以肺动脉压力和肺血管循环阻力升高为特点的一组疾病或临床综合征，其发病率和病死率均较高，最终将导致右心衰竭、容量负荷增加直至死亡，被认为是“假恶性肿瘤”。血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，vsmc)增殖和肺血管重构导致的肺动脉闭塞被认为是pah发病机制及病理改变的主要特征。由于肺血管阻力的增加和右心室后负荷的增高，引起右心室重构，最终导致右心室衰竭。随着对肺动脉高压发病机制和病理生理学研究的深入，以及新型药物的临床应用，肺动脉高压患者的预后己有所改观，但长期有效性有限，5年存活率仅为49％。因此，寻找具有抑制甚至逆转肺血管重构、抑制细胞增殖、针对右心室功能且价格低廉的药物，将有助于临床的早期干预与治疗，具有深远的研究意义。

迄今为止，肺动脉高压一线药物仍以化学药为主，但天然药物作用于肺动脉高压带来了希望。异鼠李素(isorhamnetin，iso)是一种已知的黄酮类化合物，广泛存在于银杏、沙棘等多种植物的花、果实和叶中。近年来的研究发现，异鼠李素有内皮保护、抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血、保护心肌细胞、抑制心肌纤维化、降血压、抗血栓及血小板凝集、抗氧化等多种心脑血管保护作用，且具有抑制脂肪细胞分化，耐缺氧，抗肿瘤，降糖，抗炎，抗病毒等多种作用。有研究显示异鼠李素剂量依赖地抑制去甲肾上腺素促血管平滑肌细胞增殖和dna合成的作用。然而，异鼠李素是否对肺动脉高压产生保护作用，目前未见报道。

三

技术实现要素：

申请人在研究异鼠李素对心血管疾病效果的过程中，发现异鼠李素除了有抗动脉粥样硬化和保护心肌的作用，对肺动脉高压也有显著的疗效：不仅能直接降低肺动脉高压，而且可以减少右心肥厚指数和肺中小动脉重构。

一方面，本发明提供了异鼠李素在制备治疗肺动脉高压的药物中的用途，所述异鼠李素的结构式如式(1)所示：

式(1)。

进一步地，异鼠李素单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量。

进一步地，异鼠李素单次应用剂量为50-150mg/kg.

进一步地，异鼠李素单次应用剂量为100-150mg/kg。

进一步地，异鼠李素单次应用剂量为150mg/kg。

进一步地，药物的剂型为口服剂型。

进一步地，药物的剂型为口服液。

进一步地，异鼠李素降低平均肺动脉压和右心室收缩压、减少右心肥厚指数和肺中小动脉重构。

另一方面，本发明提供了一种治疗肺动脉高压的药物组合物，包括作为唯一活性成分的异鼠李素以及药学上可接受的辅料。

本发明中的肺动脉高压包括各种起因的肺动脉高压，包括但不限于：动脉性肺动脉高压、左心疾病肺动脉高压、缺氧肺动脉高压、血栓肺动脉高压、肺部疾病肺动脉高压、不明原因肺动脉高压等。

除上面所列口服剂型外，可以将异鼠李素制备为各种临床上可接受的口服和肠胃外给药剂型，包括但不限于各种片剂、各种胶囊剂、透皮给药制剂，各种注射剂如粉针剂、注射液等。

根据剂型的需要和药剂学常识，药物中可以包含各种药学可接受的辅料，包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、ph调节剂、矫味剂等。

本发明所制备的药物可以包含以下治疗肺动脉高压的药物或者与以下治疗肺动脉高压的药物共同使用，包括但不限于钙离子拮抗剂、前列环素、内皮受体阻滞剂、抗凝剂、吸入no，如波生坦、安立生等，并且可以与各种介入和手术治疗联用，球囊房间隔造口术、血栓内膜剥落术、肺移植术等。

本发明提供的异鼠李素作为治疗肺动脉高压药物的用途具有以下有益效果：

(1)异鼠李素能显著降低平均肺动脉压和右心室收缩压、减少右心肥厚指数和肺中小动脉重构；

(2)异鼠李素能抑制氧化作用，显著抑制了肺动脉高压大鼠肺组织中bmpr2，il-6，tnf-α蛋白的表达。

四附图说明

图1为异鼠李素显著降低肺动脉高压大鼠平均肺动脉压(mpap)、右心室收缩压(rvsp)和右心肥厚指数(rvhi)的影响；

图2为异鼠李素对脉动脉高压大鼠超声心动图参数变化影响；

图3为异鼠李素对肺动脉高压大鼠肺组织病理变化影响的he染色图(×400)(图3a为正常对照组，图3b为模型组，图3c为异鼠李素50mg/kg，图3d为异鼠李素100mg/kg，图3e为异鼠李素150mg/kg,图3f为阳性药物组)；

图4为异鼠李素显著降低肺动脉高压大鼠管壁厚度百分比(wt％)和管壁面积百分比(wa％)图；

图5为异鼠李素对肺动脉高压大鼠右心室病理变化影响的he染色图(×400)(图5a为正常对照组，图5b为模型组，图5c为异鼠李素50mg/kg，图5d为异鼠李素100mg/kg，图5e为异鼠李素150mg/kg,图5f为阳性药物组)；

图6为异鼠李素显著降低肺动脉高压大鼠右心室心肌细胞横截面积(cas)图；

图7为异鼠李素对肺动脉高压大鼠肺组织胶原纤维变化影响的masson染色图(×400)(图7a为正常对照组，图7b为模型组,图7c为异鼠李素50mg/kg，图7d为异鼠李素100mg/kg，图7e为异鼠李素150mg/kg，图7f为阳性药物组)；

图8为异鼠李素对肺动脉高压大鼠肺组织电镜图(×400)(图8a为正常对照组，图8b为模型组,图8c为异鼠李素50mg/kg，图8d为异鼠李素100mg/kg，图8e为异鼠李素200mg/kg，图8f为阳性药物组)；

图9为异鼠李素对肺动脉高压大鼠肺组织中tnf-α蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p<0.01，与模型组比较：＊p<0.05，＊＊p<0.01(n＝6))；

图10为异鼠李素对肺动脉高压大鼠肺组织中il-6蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p<0.01，与模型组比较：＊p<0.05，＊＊p<0.01(n＝6))；

图11为异鼠李素对肺动脉高压大鼠肺组织中bmpr2蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p<0.01，与模型组比较：＊p<0.05，＊＊p<0.01(n＝6))。

五具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1：异鼠李素作为治疗肺动脉高压药物的用途，异鼠李素的结构式如式(1)所示：

其中，异鼠李素单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量，异鼠李素单次应用剂量为大鼠50mg/kg，药物的剂型为溶液剂型。

实施例2：异鼠李素作为治疗肺动脉高压药物的用途，异鼠李素的结构式如式(1)所示：

其中，异鼠李素单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量，异鼠李素单次应用剂量为大鼠100mg/kg，药物的剂型为溶液剂型。

实施例3

异鼠李素作为治疗肺动脉高压药物的用途，异鼠李素的结构式如式(1)所示：

其中，异鼠李素单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量，异鼠李素单次应用剂量为大鼠150mg/kg，药物的剂型为溶液剂型。

下面的动物实验进一步说明了上述实施例1至3的效果：

一、实验材料

1.1动物处理

成年雄性sd大鼠，230-250g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：ncxk(宁)2016-0005。喂养条件包括标准饲料，自来水，室温保持在(24±2)℃，湿度50-60％，每日光照与黑暗时间各12h。实验前，将动物置于实验环境适应3天。

1.2实验药品及仪器

异鼠李素(纯度＞99％)(北京中科质检生物公司)，以生理盐水配制，浓度分别为50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml，现配现用。masson染色液(购自南京建成生物工程研究所)，鼠抗bmpr2单克隆抗体(购自abcam公司)，兔抗il-6，tnf-α多克隆抗体购自公司，酶标仪(1510，thermofisher公司)，电泳仪、电转仪(powerpacbasic,美国bio-rad公司)，凝胶成像分析仪(js-860b,上海培清公司)。

1.3实验动物分组、造模及给药

sd大鼠肺动脉高压(pah)模型建立：称取野百合碱后置于15ml离心管中，用hcl(1mol/l)溶解后在用naoh(1mol/l)调节ph值至7.0～7.2，然后用蒸馏水补齐体积。230-250g左右的大鼠，一次性颈背部皮下注射野百合碱(60mg/kg)。在注射后将大鼠放回鼠笼,自由饮食和饮水,21天后造模完成。

将sd大鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性药物组、异鼠李素不同剂量组。正常对照组腹部皮下注射生理盐水，其余各组大鼠在颈背部皮下一次性注射野百合碱(60mg/kg)，造模后的第22天开始50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg剂量的异鼠李素和30mg/kg剂量的西地那非每天灌胃给药。正常对照组和模型组同法给予等量的生理盐水。在连续给药后的第22天进行血流动力学、组织病理与形态学改变、分子生物学表达变化等药效学评价。

二、实验过程

(一)血流动力学测定

1.1实验方法：

实验末次给药24h后，乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，分离右颈外静脉，结扎远心端，在近心端倾斜45°剪一小口，将与压力换能器相连接并充满肝素的大鼠专用右心导管插入右颈外静脉，左旋并向前推进可根据压力波形曲线压力值和导管进入的长度来判断导管口所处的位置，依次进入颈总静脉-上腔静脉-右心房右心室,当出现典型右心室波形时稳定片刻后测定并记录右心室收缩压,再将导管送入肺动脉,出现典型肺动脉波形时稳定片刻后记录肺动脉平均压,测定完毕后将导管从肺动脉中退出。

1.2实验结果：

由图1可以看出在注射野百合碱后的第42天，与对照组大鼠相比，模型组大鼠平均肺动脉压和右心室收缩压显著上升(p＜0.01)。与模型组相比，给予异鼠李素治疗的大鼠平均肺动脉压和右心室收缩压显著降低(p＜0.01，p＜0.05)。提示异鼠李素(50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压,对大鼠肺动脉高压的保护作用呈剂量相关性。

(二)右心肥厚指数检测

2.1实验方法

大鼠血流动力学指标检测结束后，打开胸腔，将连接灌注装置的针头经右心室插入至肺动脉，用生理盐水冲洗肺。取出心脏，分离右心室、左心室加室间隔，分别称重，计算右心室肥厚指数(rvhi)＝右心室(rv)/左心室+室间隔(lv+s)。

2.2实验结果：

由图1可以看出在注射野百合碱后的第42天，与对照组大鼠相比，模型组大鼠右心肥厚指数显著上升(p＜0.01)。与模型组相比，给予异鼠李素治疗的大鼠右心肥厚指数显著降低(p＜0.01，p＜0.05)，右心室重构得到改善。提示异鼠李素(50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg)具有减轻野百合碱所致肺动脉高压大鼠右心室肥大的作用,对肺动脉高压大鼠右心室肥大的保护作用呈剂量相关性。

(三)超声心动图

3.1实验方法

将大鼠称重后,以10％水合氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠,待呼吸均匀稳定后,胸前备毛,固定于手术台上,使用cevivid7超声心动仪。依次分别检测大鼠右心室壁厚度(rvwt)、右心室舒张结束直径(rvedd)、右心室收缩期结束直径(rvesd)、最大肺部流速(pvmax)、肺动脉加速时间(paat)、肺动脉内径(pa)等指标。

3.2实验结果

由图2可以看出在注射野百合碱后的第42天，与对照组大鼠相比模型组大鼠，rvedd,rvesd，rvwt和pa显著增加(p＜0.01)，patt和pad明显降低(p＜0.01，p＜0.05)。与模型组相比,给予异鼠李素治疗可以明显改善肺动脉高压大鼠超声心动图参数。提示异鼠李素(50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压,对大鼠肺动脉高压的保护作用呈剂量相关性。

(四)肺组织病理变化he染色图

4.1实验方法

取右下肺，10％甲醛固定48h，常规石蜡包埋，取5um厚连续切片，伊红-苏木素(he)染色，中性树脂封片，显微镜下检查并照相。随机选取管径在50-100um肺小动脉各10根，用显微镜进行摄片，image-proplus图像分析软件系统进行图像分析，计算肺小动脉管壁厚度(wallthickness,wt)占管径的百分比wt％、管壁面积(wallarea,wa)占血管总面积的百分比wa％。

4.2实验结果

由图3，4可以看出在注射野百合碱后的第42天，与对照组大鼠相比，模型组大鼠肺小动脉管壁厚度占管径的百分比wt％、管壁面积占血管总面积的百分比wa％显著上升(p＜0.01)。与模型组相比，给予异鼠李素治疗的大鼠肺小动脉管壁厚度占管径的百分比wt％、管壁面积占血管总面积的百分比wa％显著降低(p＜0.01，p＜0.05)，肺中小动脉重构得到改善。提示异鼠李素(50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg)可以改善野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉重构,对大鼠肺动脉高压的保护作用呈剂量相关性。

(五)右心室病理变化染色图

5.1实验方法

取右心室心尖组织，10％甲醛固定48h，梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡2小时，常规石蜡包埋，取5um厚连续切片，伊红-苏木素(he)染色。每张片随机6个视野，用显微镜进行摄片，image-proplus图像分析软件系统进行图像分析，计算右心室心肌细胞横截面积(cellcross-sectionalarea，cas)。

5.2实验结果

由图5,6可以看出在注射野百合碱后的第42天，与对照组大鼠相比，模型组大鼠右心室心肌细胞横截面积cas显著上升(p＜0.01)。与模型组相比，给予异鼠李素治疗的右心室心肌细胞横截面积cas显著上升显著降低(p＜0.01，p＜0.05)，右心室肥厚得到改善。提示异鼠李素(50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg)可以改善野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠右心室肥厚，对大鼠肺动脉高压的保护作用呈剂量相关性。

(六)肺组织masson染色图

6.1实验方法

取右下肺组织，10％甲醛固定48h，梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡2小时，常规石蜡包埋，取5um厚连续切片，行masson染色。

6.2实验结果

由图7可以看出，在对照组大鼠肺组织切片masson染色可见中小动脉血管壁胶原纤维结构清晰，排列整齐，肺泡结构清晰，模型组大鼠中小动脉血管壁及周围组织则见到大量胶原纤维增殖，结构紊乱，肺泡明显萎缩甚至堵塞，异鼠李素治疗组大鼠肺组织情况较模型组有明显改善，胶原纤维增生减少，肺泡结构也较清晰，同西地那非组大鼠情况相近。提示异鼠李素(50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压，对大鼠肺动脉高压的保护作用呈剂量相关性。

(七)肺组织电镜图

7.1实验方法

取右上肺组织，于4℃固定液中固定2h，切成1mm×1mm×1mm的立方体。所有肺标本用0.1m磷酸盐缓冲液冲洗三次，2％四氧化锇浸泡，乙醇梯度脱水后埋入肺内。取超薄切片(75nm厚)后，用0.4％乙酸铀酰和2％柠檬酸铅染色。采用电子显微镜(olympus,tokyo,japan)盲法观察各组肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞的组织病理学变化。

7.2实验结果

由图8可以看出，对照组肺动脉形态特征正常，肺动脉基底膜内皮细胞扁平、粘连紧密，平滑肌细胞胞体小，细胞器正常。模型组电镜图像显示肺动脉内皮细胞无基底膜、隆起、增生性、肥厚，表现为肿胀坏死。平滑肌细胞增生性、肥厚，有大量空泡，线粒体、内质网肿胀。异鼠李素、西地那非治疗后，内皮细胞贴附于基底膜，与模型组相比。与模型组相比，异鼠李素和西地那非组明显改善了平滑肌细胞的过度成形和肥大，线粒体和内质网正常。提示异鼠李素(50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压，对大鼠肺动脉高压的保护作用呈剂量相关性。

(八)肺组织westernblot实验

8.1实验方法

取适量冻存肺组织，经液氮研磨后，加入全组织蛋白抽提液提取组织蛋白，测定蛋白含量，并统一稀释后在沸水中煮10min，室温冷却后，－82℃冰箱保存备用；根据待测蛋白分子的大小制备适宜浓度的sds凝胶，加入蛋白样品及标准蛋白标志物，电泳分离蛋白质后，转印蛋白于硝酸纤维素膜。

载有蛋白的硝酸纤维素膜经5％脱脂牛奶封闭后，加入bmpr2，tnf-α，il-6及内参照β-actin等一抗4℃过夜，经pbs换洗后，加相应二抗孵育，再经pbs换洗后曝光，测定各蛋白条带光密度值并计算相应的光密度比值。

8.2实验结果

由图9，10，11可以看出，与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠肺组织中tnf-α，il-6的蛋白表达量显著上升、bmpr2的蛋白表达量显著下降(p＜0.01)，而进行异鼠李素治疗组大鼠肺组织中tnf-α，il-6的蛋白表达量显著降低、bmpr2的蛋白表达量显著上升(p＜0.01)。提示异鼠李素(150mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。