一种外泌体经皮递送制剂及其用途的制作方法

本发明涉及一种外泌体经皮递送制剂及其用途。

背景技术：

干细胞是未充分分化、具有再生各种组织器官的潜在功能的一类细胞。干细胞已广泛用于皮肤再生。近来多个临床研究也证实植入间充质干细胞可以创面修复和再生。除了受损组织的移植替换，干细胞的旁分泌作用是在治疗过程中起着十分重要的作用。外泌体是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡(30-150nm)。外泌体源于细胞内吞体，经胞吐作用排到细胞外。它包含许多功能性mrna、非编码rna(如lncrna和mirna)以及丰富的蛋白(如与皮肤保持青春相关的各种生长因子)，大量参与细胞间物质交流和通讯。已有研究表明，干细胞外泌体可以激活皮肤活力，减缓皮肤衰老。最近越来越多的公司将注意力转向干细胞外泌体的化妆品产业化，以实现外泌体的快速转化。然而我们知道，皮肤是人体极为重要的保护屏障。皮肤的屏障作用主要来源于表皮最外层的角质层。角质层由15-25层内嵌于层状脂类基质中的扁平状角质细胞构成。细胞间脂类区域是化合物扩散的主要通道，且扩散方式以沿着脂类层状结构侧向移动为主。因此，角质层是疏水性半透膜，极大地阻碍亲水性化合物和生物大分子的透皮吸收。

外泌体仅依靠脂质双层膜的类脂质体结构，是无法将其包含的功能性生物大分子有效带入体内的。我们实验也证明，外泌体直接应用于完整皮肤表面时，仅有3％左右的外泌体被吸收。关于促进外泌体皮肤吸收技术，目前国内外尚未见有相关报道。因此，开发一种适合日常使用、成本低、安全有效的外泌体促渗方法是十分有必要的。

技术实现要素：

本发明的主要目的，在于提供一种外泌体经皮递送制剂，其包括外泌体和海绵骨针。

优选地，所述的海绵骨针为蜂海绵(spongehaliclonasp.)骨针。

本发明的另一目的，在于提供所述的一种外泌体经皮递送制剂在制备化妆品中的用途。

优选地，所述的用途，其特征在于：所述的化妆品为抗皮肤衰老化妆品。

本发明的再一目的，在于提供所述的一种外泌体经皮递送制剂在制备治疗皮肤病药物中的用途。

本发明所述的一种外泌体经皮递送制剂，外泌体和骨针可以是分开的，也可以是混合的。外泌体的含量可以为制剂的1-99wt％。例如，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％等。

使用时，海绵骨针先于外泌体的使用，涂抹于皮肤表面，提前为外泌体的皮肤吸收打开通道；或是与外泌体混合后一起涂抹于皮肤表面。

本发明蜂海绵骨针可刺入角质层打开皮肤屏障，并长时间滞留于皮肤角质层，为外泌体皮肤吸收提供长久的微通道。同时蜂海绵骨针可不限部位、不限面积的涂抹在皮肤表面，扩大了外泌体的应用范围。该发明可明显提高外泌体的皮肤吸收。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为实施例1不同经皮递送方式促进外泌体皮肤吸收的效果。

图2为实施例1不同经皮递送方式促进外泌体在皮肤各层分布情况。

图3为实施例2蜂海绵骨针对外泌体体内皮肤吸收的影响。

图4为实施例3基于蜂海绵骨针的外泌体外用对小鼠光老化皮肤的皱纹形态和组织病理学的影响。

图5为实施例3基于蜂海绵骨针的外泌体外用对小鼠光老化皮肤表皮厚度的影响。

图6为实施例3基于蜂海绵骨针的外泌体外用对小鼠光老化皮肤衰老相关因子mrna表达的影响。

图7为实施例4蜂海绵骨针与外泌体联合使用的安全性实验结果。

具体实施方式

蜂海绵骨针：申请人从人工养殖的蜂海绵(spongehaliclonasp.)中分离纯化获得的蜂海绵骨针(spongehaliclonasp.spicules简称shs)，其末端尖锐，性质稳定且机械强度高(sio2含量95％)，形态单一且尺寸均匀(长度约120μm，直径约7μm)。制备方法可参见cn201610267764.6“高纯度海绵骨针的制备方法”。

猪皮的处理：家猪处死后，立即取下背部两侧皮肤，除去皮下脂肪组织。在不伤及皮肤的情况下尽可能剔除猪毛，使用磷酸缓冲盐溶液(pbs)清洗皮肤表面及底部，擦干后存于-20℃以备后用。

外泌体制备：收集人脐带间充质干细胞前三代的无血清培养基，在低温条件下(4℃)按下述方案实施梯度离心：400g×10min，保留上清；2000g×30min，保留上清；10,000g×60min，保留上清；200,000g×120min，吸弃上次。用pbs重悬沉淀，离心200,000g×120min，小心弃去上清液。用少量pbs将沉淀重悬分装，-80℃保存备用。

外泌体荧光标记：使用市售的exoglow^tm-proteinevlabeling试剂，按照说明书操作对外泌体的蛋白进行荧光标记。

实施例1蜂海绵骨针对模型外泌体皮肤吸收的促进效果

体外透皮实验：取出冷冻皮肤，使用打孔器取圆形皮肤(直径为28mm)置于室温中解冻半小时，并用蒸馏水清洗皮肤表面。本实验通过皮肤的导电性来评价皮肤的完整性，皮肤电阻大于30kω-cm2，则认为皮肤表面完整适合后续的渗透实验。将皮肤表面朝上放置于franz扩散池，接收池装满pbs溶液。按以下四种方式进行递送外泌体:

外泌体组：给药池中加入150μl的荧光标记外泌体溶液；

外泌体(按摩)组：使用电动按摩棒按摩皮肤2min，加入150μl的荧光标记外泌体溶液；

外泌体(微滚针)组：在皮肤放上franz扩散池前，使用dermaroller^tm微滚针在皮肤表面共滚动2min。皮肤放上扩散池后，直接加入150μl的荧光标记外泌体溶液；

外泌体(骨针)组：给药池中加入10mg/100μl的蜂海绵骨针pbs混悬液，并使用电动按摩棒按摩2min。用pbs清洗掉皮肤表面残余骨针，并加入150μl的荧光标记外泌体溶液。

透皮16小时后，取出皮肤，进行冷冻切片，经抗荧光淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜拍照分析。使用imagej软件分析共聚焦显微图片中皮肤各层的荧光信号强度。

对比不同递送方式经皮吸收效果(结果见图1)及外泌体在皮肤各层的分布情况(结果见图2)。

实施例2

以蛋白标记荧光的人脐带间充质干细胞外泌体为模型外泌体，比较有无使用蜂海绵骨针促渗情况下，外泌体的小鼠活体皮肤吸收，如图3所示。

方法：

异氟烷麻醉下，使用电动剃毛刀去除六周龄spf级昆明种小鼠给药部位的毛发，并用动物组织胶将franz给药池固定在给药部位。外泌体(骨针)组：给药池中加入10mg/100μl的蜂海绵骨针pbs混悬液，并使用电动按摩棒按摩2min。用pbs清洗掉皮肤表面残余骨针，并加入150μl的荧光标记外泌体溶液。外泌体组：直接向给药池中加入150μl的荧光标记外泌体溶液。在小鼠麻醉的情况下透皮8小时，然后取下皮肤组织，进行冷冻切片，通过共聚焦显微镜分析两组皮肤样品中的荧光信号。

实施例3

以人脐带间充质干细胞外泌体为活性测试外泌体，通过紫外诱导的小鼠皮肤光老化模型，评价在有无使用蜂海绵骨针促渗的情况下，脐带间充质干细胞外泌体的抗皮肤衰老作用，具体评价标准包括皮肤皱纹变化(图4)，皮肤组织的病理变化(包括表皮厚度)(图4，5)，相关生理因子表达变化(图6)。

方法：

小鼠皮肤光老化模型建立及分组给药：将六周龄的spf级昆明种小鼠放进自制的密闭的照射盒中并固定。光源距离皮肤约43cm。灯管要进行预热15-30分钟，辐射动物暴露在紫外辐射进行照射，紫外测量仪测定小鼠的照射剂量。根据测得的最小红斑量(med)进行照射，共照射十周。第一周按100mj/cm²进行照射，每周照射五次(连续五天)，第二、三周为200mj/cm²，第四周为250mj/cm²，第五周300mj/cm²，第六到十周维持400mj/cm²。在此条件下，如果小鼠出现皮肤发炎，水肿或者皮肤溃烂，则停止照射2-3天，等小鼠皮肤好转后继续照射，直至造模成功。在造模过程中，动物饮食和活动自由，并且将动物安排在没有uva和uvb，温度为24±2℃，湿度为50±10％的spf级动物房，使用12小时自动光暗循环。将小鼠分成六组进行给药：正常组(简称normal；150μlpbs)、模型组(简称model；150μlpbs)、高剂量外泌体组(简称exosome2；150μg/150μl外泌体)、pbs+骨针组(简称shs+pbs；150μlpbs)、低剂量外泌体+骨针组(简称shs+exosome1；涂抹骨针，15μg/150μl外泌体)、高剂量外泌体+骨针组(简称shs+exosome2；涂抹骨针，150μg/150μl外泌体)，按体重大小均匀分配，每组各6只。隔天给药1次，持续给药2周。末次给药后一周，使用50倍显微相机拍摄给药区域皮肤的皱纹。然后用手术剪取下皮肤，取部分皮肤，进行病理切片分析(he染色)，使用imagej软件分析表皮厚度。同时，通过qrt-pcr技术分析剩余皮肤组织中的1型胶原蛋白(collagen1)、弹性蛋白(elastin)、纤粘蛋白(fibronectin)和基质金属蛋白酶-1(mmp-1)的mrna表达水平。

结果分析：

1、体外透皮实验显示，外泌体直接应用于完整猪皮时，仅有少量外泌体被吸收进入皮肤，按摩或市售的微滚针也并未能有效增加外泌体的吸收。而当使用蜂海绵骨针进行促渗时，外泌体的皮肤吸收显著增强，角质层、活性表皮层、真皮层中外泌体含量均明显增加。

2、体内透皮实验的结果与体外实验结果一致，蜂海绵骨针对外泌体有明显的促渗效果。

3、蜂海绵骨针配合外泌体外用于光老化小鼠皮肤，可产生显著的抗皮肤衰老作用，包括皱纹的明显减少、皮肤表皮-真皮结合处呈乳突状、表皮变薄、炎性细胞减少、相关生理因子mrna表达恢复或好于正常水平。这一作用呈剂量依赖性。同时，直接使用外泌体，并未展现明显的抗衰老作用。这些结果表明蜂海绵骨针能够有效地促进外泌体的吸收，产生良好的治疗或保健效果。

实施例4.蜂海绵骨针与外泌体联合使用的安全性

1)实验操作：选取8-10周龄的普通级雌性豚鼠，剃去豚鼠背部平坦皮肤表面的毛发，不破坏豚鼠皮肤完整性，圈定一个直径为1cm的实验区，接着用2mg蜂海绵骨针手动按摩2min(转速120r/min)后，涂抹150μg/150μl外泌体溶液，观察豚鼠皮肤表面情况如下图：

实验结果见图7：

根据国际通行的draize皮肤刺激性评价标准，对比分析实验后皮肤的红斑生成情况以及水肿形成情况：可见实验组较对照组皮肤表面没有显著红斑，没有显著水肿，皮肤屏障完好，证明蜂海绵骨针与外泌体的联合使用对皮肤刺激性较小，具有使用安全性。