专利名称：生长因子和免疫球蛋白制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生长因子和免疫球旦白制剂的制备方法及其应用，特别涉用一种从牛初乳中制备高生物活性的生长因子和免疫球旦白制剂的方法以及该制剂的应用。
发明技术背景初乳是指分娩后72小时内母体分泌的乳前液体。多年科学和医学研究发现，牛初乳含有多种珍贵的生物活性物质，具有保健、抗病、抗衰老等功效，其效用可以和人乳相媲美，某些研究人员认为牛乳是迄今为止所发现的最有益人体健康的食品。
牛初乳的研究始于70年代，30多年来各国科学家在牛初乳成份及其对人体作用方面的研究有很大进展，综合目前国际上的研究成果，初乳中的活性物质可以分为两大类免疫因子和生长因子。
牛初乳中的免疫因子可以抵抗病毒、细菌、酵母菌、真菌、过敏原和其他毒素，初乳中含有5种免疫球旦白，分别是IgG，IgD，IgM，IgA和IgE，其中IgG含量最高，在人体初乳中，IgG仅占2％左右，在牛初乳中IgG含量可达8％-25％，免疫球旦白对于病毒性感染、细菌性感染、寄生虫和酵母菌都有良好的防御作用，高质量牛初乳中免疫球旦白应最低达到20％；牛初乳中至少含有19种致病菌的抗体，包括沙门氏菌、大肠杆菌和链球菌的抗体。研究表明，天然初乳中IgG具有较广谱的抑菌效果，特别是对大多数导致肠胃道疾病的病原微生物具有良好的抑制和杀灭效果，根据《初乳功能性食品》文献，牛初乳中IgG能够抑制幽门螺旋杆菌、空肠炎弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠杆菌、致肠炎沙门氏菌，可防治胃溃疡、慢性胃炎、空肠炎、小肠结肠炎、食物中毒等。牛初乳中还含有富脯氨基酸多肽(PRP)，可以调节人体胸腺活动而增强人体免疫功能；乳铁旦白对癌症、艾滋病、疱疹、慢性疲劳等疾病有效；乳清旦白对于癌症和病毒有很好抵御作用；以及含有细胞活素和溶菌酶等免疫增强和调节物质。
牛初乳中还含有丰富的生长因子，医学研究表明，牛初乳中的重要生长因子除了有助于正常的生长之外，对人体组织修复有重要的作用。牛初乳中含量最丰富的生长因子是类胰岛素生长因子I和II(GIF-I和GIF-II)，它们帮助机体有效地进行脂肪代谢和葡萄糖代谢，增加葡萄糖利用，增强糖耐量。牛初乳中还含有转移生长因子(TGFA&B)，血小板诱导生长因子(PDGF)，表皮生长因子、骨髓生长因子等。生长因子是一类以肽为基本单位的组合物，顾名思义它可促进体内各种细胞群的生长，细分起来，实际上其功能是多种多样的，其组成和功效类似，往往相辅相成。血小板衍生因子(PDGF)是一种在循环血小板颗粒中发现的阳离子，热稳定物质，具有刺激旦白质合成和通过成纤维细胞刺激胶原旦白生成的作用，它还对成纤维细胞、平滑肌细胞和神经胶质细胞起促进细胞分裂和趋化作用。类胰岛素生长因子I和II(GIF-I、II)对细胞增殖分化有促进作用，对伤口愈合有明显益处，表皮生长因子(EGF)能促进表皮细胞生长，对受损害皮肤修复有促进作用，转化生长因子A和B(TgFA&B)对粘膜生长和组织创伤修复过程有重要意义。纤维细胞生长因子能促进组织正常生长、再生，加快衰老受伤的肌肉、皮肤胶质原、软骨和神经组织修复。神经营养生长因子(NGF)可刺激交感神经节生长。
多家国外研究成果证实，免疫球旦白是一组具有高活性同时又很敏感的旦白质，特别适合于细菌和病毒疾病的预防和治疗，目前已经有研究者应用它们治疗与细菌或病毒有关的疾病，如腹泻，特别是与艾滋病或其他免疫缺陷有关的腹泻、旅行者腹泻、婴儿中毒性腹泻、胃和肠溃疡、非溃疡性胃肠炎、老年慢性支气管炎等。
目前有多项技术用来提取制备牛初乳中生物活性物质，美国专利4,526,715介绍了一种从牛初乳中通过几种层析分离步骤制备免疫球旦白的方法。美国专利3,128,230介绍了一种从牛初乳中制备可用于治疗各种细菌感染的产品和方法。西德专利2,813,284和欧洲专利EP-A0,046,909及EP-A0,064,103叙述了从初乳中制备含免疫球旦白产品的方法，该产品可作为抗感染产品。
按上述方法，开始从牛初乳或从经过免疫接种的牛初乳中制备有效的免疫球旦白产品，为了达到抗致病菌或抗致病病毒的效果，必须先给动物注射一株或多株细菌，或它的抗原，以便能够产生一种抗体或一组特异性抗体，用该方法获得的产物的活性与所应用免疫的品种有关，应用受到限制，产品用途单一。
中国发明专利(申请号95100461)公布的技术中，去除酪旦白不完全，而且应用胃旦白酶会损伤免疫球旦白活性。
而且牛初乳中还富含多种生长因子和活性多肽，这些生物活性物质能帮助局部组织修复，促进旦白合成，减轻或恢复局部组织结构和功能，与免疫球旦白协同，能有效促进疾病的痊愈，目前公开的技术中尚未有看到类似报导。
此外，目前的技术仅将免疫球旦白应用在胃肠道，如果制备合适的剂型也可以应用于呼吸道、泌尿道、阴道等空腔脏器的细菌或病毒感染，由于其天然特性，无毒付作用，应该得到良好的效果。
本发明所要解决的技术问题是，通过简单和经济的方法从牛初乳中制备高纯度和高抗体活性免疫球旦白产品，同时保存其中高生物活性的生长因子和活性多肽，在对抗、杀灭局部致病细菌和致病病毒的同时，帮助局部组织修复，促进旦白合成，快速恢复局部组织结构和功能。而且使用该产品预先无需进行免疫接种，可以将这个制剂制备成适合人体多个器官应用的多种剂型，广泛应用于多种细菌和病毒相关疾病的治疗。
发明内容
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，收集牛分娩后72小时内初乳，离心脱脂，用酸剂调节PH至酸性状态，同时，加热凝固酪旦白，用离心方式或滤布过滤方式去除酪旦白后稀释，收集上清液，采用低分子量超微滤膜浓缩，根据剂型的不同用途分别制备液体浓缩制剂或干粉制剂、喷雾制剂、药物栓剂、皮肤贴剂等不同剂型。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案也可以通过下列途径实现，收集的牛初乳用离心方式脱脂，脱脂牛初乳用蒸镏水稀释，稀释后脱脂初乳内加酸制剂调整PH，同时加热，使酪旦白凝固后离心沉淀去除酪旦白，或静置过夜后用滤布过滤去除酪旦白，收集上清液后用低分子量超微滤膜浓缩后制备上述各种剂型。
本发明的技术特征是，收集牛初乳，采用离心方式去除脂肪，离心速度为2000～4000转/分，优选3000转/分，离心时间15～30分钟，优选20分钟，采用冷冻离心设备在冷冻状态下离心，离心后去除表面的脂肪，加入酸剂，例如2N HCL或其他酸性制剂，调整浓缩物PH至弱酸性，PH3.8～5.2，优选4.5～4.8，调整浓缩物PH值后，加热析出酪旦白，加热温度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加热时间15分钟～90分钟，最好30～45分钟，最好是加热至看到乳水明显分离，然后用离心机离心沉淀析出的酪旦白，离心速度3000～6000转/分，优选5000转/分，收集离心上清液。
本发明的技术特征是，本发明的技术解决方案也可以从下列途径实现，脱脂牛初乳用1倍～5倍蒸镏水稀释，优选2倍～3倍，调节PH值至4.6～4.9，优选4.7～4.8，与此同时加热30℃～40℃，持续15～45分钟，然后于4℃貯存过夜，用尼龙滤布或其他滤布，或用离心方式去除沉淀的酪旦白，上清液用分子量为4000～6000的超滤膜浓缩，并冷冻干燥制粉。
本发明的技术特征是，本发明制剂还可以制备成注射剂，用于动物感染性疾病的治疗。
本发明的技术特征是，本发明上述制备方法中最后工艺中液体浓缩物的干燥方法，既可以采用上述的冷冻干燥方法，也可以采用喷雾干燥方法，这两种干燥方法都不会影响免疫球旦白的生物活性，但是喷雾干燥的方法，可能会影响制剂中生长因子或其他活性多肽的生物活性，因此，如希望同时保存制剂中生长因子和免疫球旦白生物活性时，应采用冷冻干燥方法，如果希望降低成本，又无需保存生长因子类多肽的活性时应选择喷雾干燥方法，喷雾干燥时温度不能超过160°F，以免损害免疫球旦白活性。
本发明的技术特征是，采用上述方法制备的富含生长因子和免疫球旦白的制剂，也可以直接以液体浓缩物的形式应用，例如制备成口服浓缩液方式应用于治疗胃肠道疾病，制备成滴液形式用于眼睛、口腔、耳朵的感染性疾病的治疗。也可以制备成栓剂用于肠道感染性疾病的治疗。制备成膜型剂用于皮肤外伤及皮肤感染性疾病的治疗。制备成喷雾剂形式用于呼吸道感染性疾病的治疗，也可以加入喷雾雾化的贮药装置内，采用超声喷雾雾化的方式治疗呼吸道、口腔、咽喉的感染性疾病。上述制剂的制备采用本领域技术人员都能理解，并熟练掌握的成熟剂型制造技术，加入各种医药等级的辅料，应用医药等级的设备制备。
本发明的技术特征是，采用上述方法制备的富含生长因子和免疫球旦白制剂，包括液体状态浓缩物或干粉均可以用于多种胃肠道疾病的治疗，这些胃肠道疾病包括但不限于腹泻、食物中毒、婴儿腹泻、旅行者腹泻、与艾滋病或其他免疫缺陷疾病相关的腹泻、胃肠道溃疡、慢性胃炎、空肠炎、小肠结肠炎、耶尔森氏菌感染等多种与细菌或病毒有关的胃肠道疾病。
本发明的有益效果是，与现有技术相比，本发明制备的制剂不仅含有大量的免疫球旦白，而且还含有大量生长因子，在杀灭局部细菌及病毒的同时，能够帮助修复局部组织。
实施例2收集牛初乳，离心脱脂，用双倍量蒸镏水稀释，用2N HCL调PH至4.8，得到上清液，于38℃加热40分钟，然后于4℃静置贮存过夜，上清液通过尼龙布滤器去除沉淀的酪旦白粗颗粒，用分子量6000的超微滤膜在板框式超滤装置内浓缩至原体积30％，用喷雾干燥法喷雾干燥，喷雾干燥时入口温度160°F，出口温度130°F，结果得到含有80％纯度的免疫球旦白干粉，喷雾干燥前制剂的生物活性与喷雾干燥后制剂的生物活性一致。
实施例3收集分娩后10小时牛初乳，以3000转/分速度离心分离脂肪，用1N HCL调节PH至4.7(每升初乳中加入约54m11N HCL)，同时加热42℃持续35分钟，用5000转/分速度离心沉淀凝固的酪旦白，收集上清液，用2倍量的生理盐水稀释，稀释后的上清液用中空纤维柱初滤，中空纤维平均孔径0.4μm，表面积3m2，纤维直径1.2mm，使用压力超过大气0.2-0.6巴。收集过滤液，用6倍量的生理盐水稀释再通过由三个中空纤维柱组成的系统进行第二次过滤，每个柱的分离极限为60,000D，表面积为1.4m2，浓缩到第一次过滤前初始容量2倍。经过测定，所得到的浓缩液中旦白质含量为6％，用已知方法进行过滤消毒，或采用巴氏消毒法。
实施例4按实施例3方法制备浓缩液，加入医用等级聚二醇加热溶液内，混合搅拌，倒入预置栓剂模型，室温冷却后制备栓剂，可以应用于妇女宫颈或阴道各类感染。
实施例5按实施例3方法制备浓缩液，与医用等级气溶胶溶液混合搅拌，加压灌装入气瓶内，制备气雾剂，可用于口腔、咽喉、上呼吸道感染性疾病的治疗，还可以用来防治感冒和上呼吸道感染。
实施例6按实施例1方法制备的干粉，制备200m15％旦白质无菌溶液，该溶液由15g干粉加入100ml蒸镏水搅拌均匀配成，其组成如下总旦白质4.2g/100ml，IgG 3.0g/100ml，IgA0.35g/100ml，IgM 0.96g/100ml。
实施例7应用含毒素的金黄色葡萄球菌上清液进行毒素中和试验，采用实施例1制备的制剂与人免疫球旦白制剂相比较，对于50％溶血(毒素中和作用)所需的人免疫球旦白用量，是本发明制剂用量的三倍。
实施例8用实施例1制剂与含革兰氏阴性细菌(绿浓杆菌)的毒素上清液进行毒素中和试验，本发明方法制备的免疫球旦白在很低浓度可产生100％的毒素中和作用。
权利要求
1.本发明涉及一种从牛初乳中制备高生物活性生长因子和免疫球旦白的方法以及该制剂的应用，其特征是，收集牛分娩后72小时内初乳，采用离心脱脂，用酸剂调节PH至酸性状态，同时，加热凝固酪旦白，用离心方式或滤布过滤方式去除酪旦白后稀释，收集上清液，采用低分子量超微滤膜浓缩，根据剂型的不同用途分别制备液体浓缩制剂或干粉制剂、喷雾制剂，药物栓剂，皮肤贴剂等不同剂型。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是，本发明解决其技术问题所采用的技术方案也可以通过下列途径实现，收集的牛初乳用离心方式脱脂，脱脂牛初乳用蒸镏水稀释，稀释后脱脂初乳内加酸制剂调整PH，同时加热，使酪旦白凝固后离心沉淀去除酪旦白，或静置过夜后用滤布过滤去除酪旦白，收集上清液后用低分子量超微滤膜浓缩后制备上述各种剂型。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征是，收集牛初乳，采用离心方式去除脂肪，离心速度为2000～4000转/分，优选3000转/分，离心时间15～30分钟，优选20分钟，采用冷冻离心设备在冷冻状态下离心，离心后去除表面的脂肪，加入酸剂，例如2N HCL或其他酸性制剂，调整浓缩物PH至弱酸性，PH3.8～5.2，优选4.5～4.8，调整浓缩物PH值后，加热析出酪旦白，加热温度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加热时间15分钟～90分钟，最好30～45分钟，最好是加热至看到乳水明显分离，然后用离心机离心沉淀析出的酪旦白，离心速度3000～6000转/分，优选5000转/分，收集离心上清液。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征是，本发明的技术解决方案也可以从下列途径实现，脱脂牛初乳用1倍～5倍蒸镏水稀释，优选2倍～3倍，调节PH值至4.6～4.9，优选4.7～4.8，与此同时加热30℃～40℃，持续15～45分钟，然后于4℃貯存过夜，用尼龙滤布或其他滤布，或用离心方式去除沉淀的酪旦白，上清液用分子量为4000～6000的超滤膜浓缩，并冷冻干燥制粉。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征是，本发明上述制备方法中最后工艺中液体浓缩物的干燥方法，既可以采用上述的冷冻干燥方法，也可以采用喷雾干燥方法，这两种干燥方法都不会影响免疫球旦白的生物活性，但是喷雾干燥的方法，可能会影响制剂中生长因子或其他活性多肽的生物活性，因此，如希望同时保存制剂中生长因子和免疫球旦白生物活性时，应采用冷冻干燥方法，如果希望降低成本，又无需保存生长因子类多肽的活性时应选择喷雾干燥方法。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征是，采用上述方法制备的富含生长因子和免疫球旦白的制剂，也可以直接以液体浓缩物的形式应用，例如制备成口服浓缩液方式应用于治疗胃肠道疾病，制备成滴液形式用于眼睛、口腔、耳朵的感染性疾病的治疗。也可以制备成栓剂用于肠道感染性疾病的治疗。制备成膜型剂用于皮肤外伤及皮肤感染性疾病的治疗。制备成喷雾剂形式用于呼吸道感染性疾病的治疗，也可以加入喷雾雾化的贮药装置内，采用超声喷雾雾化的方式治疗呼吸道、口腔、咽喉的感染性疾病。上述制剂的制备采用本领域技术人员都能理解，并熟练掌握的成熟剂型制造技术，加入各种医药等级的辅料，应用医药等级的设备制备。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征是，采用上述方法制备的富含生长因子和免疫球旦白制剂，包括液体状态浓缩物或干粉均可以用于多种胃肠道疾病的治疗，这些胃肠道疾病包括但不限于腹泻、食物中毒、婴儿腹泻、旅行者腹泻、与艾滋病或其他免疫缺陷疾病相关的腹泻、胃肠道溃疡、慢性胃炎、空肠炎、小肠结肠炎、耶尔森氏菌感染等多种与细菌或病毒有关的胃肠道疾病。
8.按照权利要求1所述的方法中，本发明制剂还可以制备成注射剂，用于动物感染性疾病的治疗。
全文摘要
本发明涉及一种从牛初乳中制备高生物活性生长因子和免疫球蛋白的方法以及该制剂的应用，其特征是，收集牛分娩后72小时内初乳，采用离心脱脂，用酸剂调节pH至酸性状态，同时，加热凝固酪蛋白，用离心方式或滤布过滤方式去除酪蛋白后稀释，收集上清液，采用低分子量超微滤膜浓缩，根据剂型的不同用途分别制备液体浓缩制剂或干粉制剂、喷雾制剂，药物栓剂，皮肤贴剂等不同剂型，可广泛应用于各类细菌和病毒相关的感染性疾病治疗中。
文档编号A61K39/00GK1557340SQ20041001585
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月15日 优先权日2004年1月15日
发明者高春平 申请人:高春平