专利名称：Alcam和alcam调制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学和免疫治疗的领域。更具体而言，它涉及已知抗原ALCAM除了黑素瘤外还与多种人类癌症相关且抗ALCAM抗体可用于治疗这些癌症的有关发现。它还涉及ALCAM介导的新血管形成。
背景技术：
已激活的白细胞粘附分子(ALCAM)是I类跨膜蛋白和免疫球蛋白超家族成员。ALCAM还被称为/已知为CD166、KG-CAM或神经生长素，它具有一个短的细胞质尾部和含五个Ig结构域(两个N-末端可变型结构域以及随后的三个恒定型Ig结构域)的细胞外部分(Ohneda等，(2001)Blood 98(7)2134-2142)。ALCAM与鸡粘附分子BEN/SC1/DM-GRASP具有超过90％的同源性，与人黑素瘤细胞粘附分子Mel-CAM/MUC18/CD146有30％的同一性和50％的相似性(Leon等，(2001)J Biol Chem 276(28)25783-25790)。
已发现ALCAM表达于激活的白细胞亚群、成纤维细胞和上皮及神经细胞上，其中ALCAM的表达与细胞的群集相关。ALCAM被认为参与发育的多个过程，包括血细胞生成、胸腺发育、免疫应答系统、轴突延长、神经细胞迁移和骨发生。
免疫组织化学研究已显示了ALCAM表达于胚胎内皮和背主动脉中。胚胎内皮中ALCAM的活化导致了血细胞生成、内皮细胞发育和内皮管的形成(Ohneda等，(2001)Blood 98(7)2134-2142)。胚胎细胞刺激新血管形成以及血细胞生成的能力不存在于不表达ALCAM的成年细胞中。
新血管形成是新的血管在组织中的生长。一般而言，新的血管系统主要由内皮细胞(即，通常在血管中发现且组成血管的细胞)组成，内皮细胞的生长以各种血管生成因子作为信号。在肿瘤中，尤其是在那些与周围正常组织相比快速且侵略性生长的癌症中，已观察到了新血管的生长。有些人认为此新血管生成由肿瘤细胞产生的信号介质引起，而据推测这样的介质的作用在于刺激血管生长进入肿瘤。一直以来，认为此新的肿瘤血管系统一般由通常与血管有关的内皮细胞组成。研究小组已尝试用抑制正常血管形成的各种物质(如内抑制素(endostatin)和制管张素)来阻止所说的肿瘤血管生成。
阻断肿瘤血管生成的另一种方法包括鉴定选择性阻止肿瘤中和肿瘤周围新血管形成而不影响健康组织中正常脉管形成的药剂。这种方法的基础是发现在被称为“血管摹拟”(vascular mimicry)的过程中新血管系统产生自肿瘤细胞而非产生自从肿瘤外进入的内皮细胞(参阅，如，Hendrix等(2000)Breast Cancer Res.2417-422)。
ALCAM首先被确定为CD6的配体。ALCAM与CD6的结合被认为涉及T细胞与单核细胞和其它已活化的T细胞，以及上皮细胞、成纤维细胞和特化细胞，诸如胰岛细胞之间的相互作用。ALCAM还表达于类风湿性关节炎患者发炎的滑膜中的单核细胞系细胞上(Levesque等，(1998)ArthiritisRheum 41(12)2221-9)。ALCAM-CD6相互作用的定位暗示了其在诸如类风湿性关节炎之类疾病中维持慢性发炎反应的作用(美国专利No.5998172)。尽管涉及ALCAM的某些结合相互作用已被描述且ALCAM相关事件也正被阐明，但ALCAM的作用机制仍然有待确定。通过鉴定允许ALCAM与信号分子或其它分子相互作用的有关事件将大大增加对ALCAM功能的了解并将提供能调节ALCAM功能的物质。这些物质将可以用于治疗和诊断一系列的疾病，包括与上述过程相关的和下述章节中的那些病理学情况。因此需要更好的了解使得ALCAM可以与其天然配体相互作用的事件和由此产生的生物学事件，还需要能调节这些事件的肽及其它结构物。
按照从人转移性黑素瘤中所观察到的，除了异型ALCAM-CD6细胞间相互作用外，ALCAM还能形成同型ALCAM-ALCAM相互作用。先前的研究已表明，转移性恶性黑素瘤细胞表达ALCAM，而在非转移性恶性黑素瘤细胞中则未检测到ALCAM。ALCAM的表达与黑素瘤从非侵袭性放射生长状态向能转移的垂直生长状态发展有关。抗ALCAM抗体已被用作原发性恶性黑素瘤发展情况的诊断标志(Van kempen等，(2000)American J Path 156(3)769-774)。
除了用于诊断外，抗体还可以用作治疗剂。例如，免疫疗法或以治疗为目的的抗体应用近年来已被用于治疗癌症。被动的免疫疗法包括在癌症治疗中使用抗体，通常是单克隆抗体。参阅，例如，癌症肿瘤学原理及实践(CancerPrinciples and Practice of Oncology)，第6版(2001)第20章，第495-508页。这些抗体可能具有内在的治疗用生物学活性，其能直接抑制肿瘤细胞的生长或存活，并能募集身体免疫系统的天然细胞杀伤活性。这些药剂可以单独施用或与放射疗法或化疗剂联合施用。以商标Rituxan和Herceptin销售的单克隆抗体，已被批准分别用于治疗淋巴瘤和乳腺癌，是所说疗法的两个例子。或者，抗体可用于制备抗体缀合物，其中的抗体与毒性剂连接并通过与肿瘤的特异结合使此毒性剂定向于该肿瘤。以商标Mylotarg出售的抗体缀合物是已批准用于治疗白血病的抗体缀合物的一个例子。结合癌症细胞并可能用于诊断和治疗的单克隆抗体在出版物中已有公布。参阅，例如，其中尤其是公布了某些靶蛋白分子量的以下专利申请美国专利NO.6054561(200KD c-erbB-2(Her2)，和其它大小为40-200KD的未鉴定抗原)和美国专利NO.5656444(50KD和55KD，癌胚蛋白)。在临床试验中和/或已批准用于治疗实体肿瘤的抗体例子包括Herceptin(抗原180kD，HER2/neu)、Panorex(抗原40-50kD，Ep-CAM)、HMFG1(抗原＞200kD，HMW粘蛋白)、C225(抗原150kD和170kD，EGF受体)、Campath(抗原21-28kD，CD52)和Rituxan(抗原35kD，CD20)。用于治疗乳癌的Herceptin(Her-2受体)和在临床试验中用于治疗几种癌症的C225(EGF受体)的靶抗原以某种可检测的水平呈现于很多正常成人组织中，包括皮肤、结肠、肺、卵巢、肝和胰腺中。使用这些疗法的安全范围可能由这些位点处表达水平的差异或抗体接近程度或活性的差异来决定。至2002年四月为止，已知特异结合ALCAM的公众可获得的抗体包括克隆18，来自AntigenixAmerica Inc.，纽约；克隆3A6，来自Ancell公司，明尼苏达；克隆j3-119，来自Chromaprobe有限公司，加利福利亚；克隆L50，来自CaltagLaboratories有限公司，加州；目录号AF656的产品，来自R&D Systems有限公司，明尼苏达；和目录号为sc-8548和sc-8549的产品，来自SantaCruz Biotechnology，加州，这些列举于Linscott氏免疫学和生物学试剂字典(ISSN0740-7394)中。
现需要的是非黑素瘤癌症细胞表面的新靶标，这些靶可通过特异识别这些非黑素瘤癌症细胞表面靶的抗体和其它药剂用于治疗这些癌症。基于本文所公布的发现内容，另外还需要特异识别细胞表面靶的新抗体和其它药剂，这些抗体和药剂可调节，即降低或增强新发现的ALCAM的新血管形成活性。
发明概述本文公布的发明涉及如下发现除转移性恶性黑素瘤之外，已知抗原ALCAM还存在于多种人类原发性和转移性癌症中，以及抗ALCAM抗体可用于治疗这些癌症。此外，本发明还提供了ALCAM激动剂和拮抗剂以调节新血管形成。
一方面，本发明涉及包含与癌症细胞上呈递的ALCAM结合的抗ALCAM抗体的组合物。在优选的实施方案中，癌症细胞选自卵巢、肺、前列腺、胰腺、结肠和乳房的癌细胞。在某些实施方案中，所说的癌症细胞是分离的。在某些实施方案中，癌症细胞存在于生物学样品中。一般而言，生物学样品来自个体，诸如人。在某些实施方案中，将抗ALCAM抗体与治疗剂或可检测标记连接。
在一些实施方案中，本发明涉及由宿主细胞(ATCC PTA-4478)或其子代细胞所产生的抗ALCAM抗体mKID2。
另一方面，本发明涉及抗ALCAM抗体或竞争性抑制抗ALCAM抗体与ALCAM的优先结合的多肽(可以是抗体或非抗体)。在某些实施方案中，本发明的抗体或多肽(可以是抗体或非抗体)优先结合的ALCAM表位与别的抗ALCAM抗体与ALCAM结合的表位相同或不同。
另一方面，本发明涉及包含抗ALCAM抗体的片段或区域的抗体。在一实施方案中，所说的片段是抗体的轻链。在另一实施方案中，所说的片段是抗体的重链。在又一实施方案中，所说的片段包含来自抗体轻链和/或重链的一个或多个可变区。在另一实施方案中，所说的片段包含来自抗体轻链和/或重链的一个或多个互补决定区(CDR)。
另一方面，本发明提供了包含以下之任一在内的多肽(可以是抗体或非抗体)a)来自抗ALCAM抗体轻链或重链的一个或多个CDR(或其片段)；b)来自抗ALCAM抗体轻链的三个CDR；c)来自抗ALCAM抗体重链的三个CDR；d)来自抗ALCAM抗体轻链的三个CDR和来自其重链的三个CDR；e)抗ALCAM抗体的轻链可变区；f)抗ALCAM抗体的重链可变区。
另一方面，本发明是人源化的抗体。在某些实施方案中，所说的人源化抗体包含非人抗ALCAM抗体的一个或多个CDR。在某些实施方案中，人源化抗体所结合的表位与其它抗ALCAM抗体结合的表位相同或不同。一般而言，本发明的人源化抗体包含衍生自原先非人抗ALCAM抗体的CDR和/或与此CDR相同的一个或多个(1、2、3、4、5、6个或其片段)CDR。在某些实施方案中，此人抗体与其它抗ALCAM抗体结合相同或不同表位。另一方面，本发明是包含衍生自非人抗ALCAM抗体重链和轻链可变区的可变区域及衍生自人抗体重链和轻链恒定区的恒定区域的嵌合抗体。
另一方面，本发明是产生单克隆抗体mKID2的宿主细胞(ATCCNO.PTA-4478)。
另一方面，本发明是编码保藏号为ATCC PTA-4478的宿主细胞或其后代所产生的抗体mKID2的分离多核苷酸。另一方面，本发明提供了编码本文所述任何抗体(包括抗体片段)以及其它任何多肽的多核苷酸。
另一方面，本发明是含有本文所述任何多肽(包括本文所述任何抗体)或多核苷酸以及药用可接受赋形剂的药物组合物，诸如包含与化学治疗剂连接的抗ALCAM抗体、含抗ALCAM抗体片段的抗体、非人抗ALCAM抗体的人源化抗体、含来自非人抗ALCAM抗体可变区的可变区域和衍生自人抗体恒定区的恒定区域的嵌合抗体、或具有非人抗ALCAM抗体的一个或多个特性的人抗体、或与化学治疗剂(如放射性部分)连接的任何本文所述抗ALCAM抗体、以及药用可接受赋形剂的药物组合物。
另一方面，本发明是产生抗体mKID2的方法，包括在允许抗体mKID2产生的条件下培养宿主细胞(ATCC NO.PTA-4478)或其后代，并纯化抗体mKID2。
另一方面，本发明提供了产生本文所述的任何抗体(或多肽)的方法，即通过在合适的细胞中表达编码抗体的一个或多个多核苷酸(可作为单一的轻链或重链独立表达，或轻链和重链都表达自一个载体)，随后通常回收和/或分离目的抗体或多肽。
另一方面，本发明是用于诊断个体是否患癌症的方法，包括测定来自个体的选定细胞上是否有ALCAM的表达，其中ALCAM在所说细胞上的表达是所述癌症的指示标志。在一些实施方案，ALCAM的表达使用抗ALCAM抗体确定。在某些实施方案中，该方法包括检测细胞的ALCAM表达水平。术语“检测”用于此处包括在参考或不参考对照的条件下进行定性和/或定量检测(测量水平)。
另一方面，本发明是用于诊断个体是否患卵巢癌的方法，包括测定个体的卵巢细胞上是否有ALCAM的表达，其中在所述细胞上ALCAM的表达是所说癌症的指示标志。在某些实施方案中，用抗ALCAM抗体测定ALCAM的表达。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是mKID2。在某些实施方案中，该方法包括检测细胞表达ALCAM的水平。术语“检测”用于此处包括在参考或不参考对照的条件下进行定性和/或定量检测(测量水平)。
另一方面，本发明是用于诊断个体是否患肺癌的方法，包括测定个体的肺细胞上是否有ALCAM的表达，其中在所述细胞上ALCAM的表达是所说癌症的指示标志。在某些实施方案中，用抗ALCAM抗体测定ALCAM的表达。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是mKID2。在某些实施方案中，该方法包括检测细胞表达ALCAM的水平。
另一方面，本发明是用于诊断个体是否患前列腺癌的方法，包括测定个体的前列腺细胞上是否有ALCAM的表达，其中在所述细胞上ALCAM的表达是所说癌症的指示标志。在某些实施方案中，用抗ALCAM抗体测定ALCAM的表达。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是mKID2。在某些实施方案中，该方法包括检测细胞表达ALCAM的水平。
另一方面，本发明是用于诊断个体是否患胰腺癌的方法，包括测定个体的胰腺细胞上是否有ALCAM的表达，其中在所述细胞上ALCAM的表达是所说癌症的指示标志。在某些实施方案中，用抗ALCAM抗体测定ALCAM的表达。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是mKID2。在某些实施方案中，该方法包括检测细胞表达ALCAM的水平。
另一方面，本发明是用于诊断个体是否患结肠癌的方法，包括测定个体的结肠细胞上是否有ALCAM的表达，其中在所述细胞上ALCAM的表达是所说癌症的指示标志。在某些实施方案中，用抗ALCAM抗体测定ALCAM的表达。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是mKID2。在某些实施方案中，该方法包括检测细胞表达ALCAM的水平。
另一方面，本发明是用于诊断个体是否患乳癌的方法，包括测定个体的乳房细胞上是否有ALCAM的表达，其中在所述细胞上ALCAM的表达是所说癌症的指示标志。在某些实施方案中，用抗ALCAM抗体测定ALCAM的表达。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是mKID2。在某些实施方案中，该方法包括检测细胞表达ALCAM的水平。
另一方面，本发明是用于帮助诊断个体是否患癌症(诸如但不局限于卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌或乳癌)的方法，包括测定在来自个体的生物学样品中ALCAM的表达。在某些实施方案中，用抗ALCAM抗体测定ALCAM的表达。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是mKID2。在某些实施方案中，该方法为检测细胞表达ALCAM的水平。
在又一方面，本发明是在个体中将化学治疗剂投递至癌症细胞处的方法，包括对个体施用有效量的含有与化学治疗剂缔合(包括连接)的抗ALCAM抗体的组合物。在某些实施方案中，癌症细胞是(但不局限于)卵巢、前列腺、胰腺、肺、结肠或乳房的癌细胞。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是衍生自mKID2的人源化抗体(通常，但不是必要的，包含抗体mKID2的一个或多个部分或完整的CDR)。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是具有抗体mKID2的一种或多种特性的人抗体。在某些实施方案中，化学治疗剂(诸如毒素或放射性分子)被递送入卵巢癌细胞内(被内在化)。在某些实施方案中，该化学治疗剂是皂草素。
另一方面，本发明是治疗个体所患癌症的方法，包括对个体施用有效量的含有与化学治疗剂缔合(包括连接)的抗ALCAM抗体的组合物。在某些实施方案中，癌症选自，但不局限于卵巢、前列腺、胰腺、肺、结肠和乳房的癌症。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是衍生自mKID2的人源化抗体(通常，但不是必要的，包含抗体mKID2的一个或多个CDR)。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是具有抗体mKID2的一种或多种特性的人抗体。在某些实施方案中，被治疗的癌症是卵巢癌，而化学治疗剂(诸如毒素或放射性分子)被递送入卵巢癌细胞内(被内在化)。在某些实施方案中，该化学治疗剂是皂草素。
在另一方面，本发明是抑制体外或个体内癌细胞生长和/或增殖的方法，包括将有效量的含有与化学治疗剂缔合(包括连接)的抗ALCAM抗体的组合物施用于细胞培养物或样品或个体。在某些实施方案中，癌细胞是(但不局限于)卵巢、前列腺、胰腺、肺、结肠或乳房的癌细胞。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是衍生自mKID2的人源化抗体(通常，但不是必要的，包含抗体mKID2的一个或多个部分或完整的CDR)。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是具有抗体mKID2的一种或多种特性的人抗体。在某些实施方案中，癌细胞是卵巢癌细胞，且化学治疗剂(诸如毒素或放射性分子)被递送入卵巢癌细胞内(被内在化)。在某些实施方案中，该化学治疗剂是皂草素。
在另一方面，本发明是延迟患癌症的个体内转移瘤发生的方法，包括对个体施用有效量的含有与化学治疗剂缔合(包括连接)的抗ALCAM抗体的组合物。在某些实施方案中，癌症是卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌或乳癌。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是衍生自mKID2的人源化抗体(通常，但不是必要的，包含抗体mKID2的一个或多个CDR)。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是具有抗体mKID2的一种或多种特性的人抗体。在某些实施方案中，所述癌症是卵巢癌，而化学治疗剂(诸如毒素或放射性分子)被递送入了卵巢癌细胞内(被内在化)。在某些实施方案中，该化学治疗剂是皂草素。
本发明进一步提供了通过增强或降低的方式来调节ALCAM与细胞质信号配偶体(Partner)缔合的方法。通过使呈递于细胞表面的ALCAM分子接触可以调节信号配偶体与ALCAM的结合的药剂，能影响ALCAM与细胞质信号配偶体的缔合。阻断或减少ALCAM与其结合配偶体和/或信号配偶体缔合的药剂可用于调节ALCAM介导的新血管形成中所涉及的生物学和病理学过程。涉及此作用的病理学过程包括与肿瘤相关的血管生长。
可检测药剂阻断、减少、增强或以其它方式调节ALCAM与抗ALCAM抗体或CD6之类结合配偶体缔合的能力。具体而言，通过将含ALCAM相互作用位点(通常为存在于完整活细胞上的其天然构象形式)的肽与结合配偶体和待测药剂一起温育并测定待测药剂是否减少或增强了结合配偶体与ALCAM肽的结合，从而可以检测药剂调控这些相互作用的能力。激动剂、拮抗剂和其它调制剂是特别预期的。
在另一方面，本发明是促进体外或个体内血管产生的方法，包括将有效量的含有抗ALCAM药剂的组合物施用于个体。
在另一方面，本发明是促进体外或个体内血管产生的方法，包括将有效量的含有抗ALCAM抗体的组合物施用于个体。
在另一方面，本发明是抑制体外或个体内血管产生的方法，包括将有效量的含有抗ALCAM拮抗剂的组合物施用于个体。
在另一方面，本发明是抑制体外或个体内血管产生的方法，包括将有效量的含有拮抗性抗ALCAM抗体的组合物施用于个体。
在另一方面，本发明是促进新血管形成的组合物，其中包含可以与非内皮细胞上的ALCAM结合的药剂。
在另一方面，本发明是抑制新血管形成的组合物，其中包含可以与非内皮细胞上的ALCAM结合的拮抗剂。
在另一方面，本发明是促进新血管形成的组合物，其中包含可以与非内皮细胞上的ALCAM结合的抗体。
在另一方面，本发明是抑制新血管形成的组合物，其中包含可以与非内皮细胞上的ALCAM结合的拮抗性抗体。
在另一方面，本发明是抑制体外或个体内血管产生的方法，包括将有效量的含有对抗新血管形成促进分子的抗体的组合物施用于个体。
在另一方面，本发明是促进体外或个体内血管产生的方法，包括将有效量的含有至少一种新血管形成促进分子的组合物施用于个体。
附图简述本专利或申请文件包含至少一幅彩图。在提出要求并且交付必要的费用后，本专利局可提供带彩图的本专利或专利申请出版物的复印件。
图1显示了抗ALCAM单克隆抗体2D4与9种不同的胰腺癌细胞系结合的矩形图。用荧光激活细胞分选仪将各细胞系中的细胞进行分选。在各矩形图中，灰色填充的曲线代表在无一抗的情况下抗人IgG Fc与各个细胞系的非特异性结合。黑色曲线是抗ALCAM与各个胰腺癌细胞系结合的矩形图。
图2是显示移植了Rav9926细胞的裸鼠(移植在肾囊下)的血管形成的照片，Rav9926是一种专利人胰腺肿瘤细胞系。图2A和2B是注射了赋形剂的对照小鼠肾囊的照片。图2C和2D是注射了抗ALCAM抗体克隆2D4的小鼠肾囊照片。
图3是显示mKID2和MAb-ZAP(与皂草素缀合的抗IgG)对人卵巢癌细胞SKOV3生长的影响的曲线图。
图4是显示mKID2(浓度为1μg/ml、10μg/ml和20μg/ml)和MAb-ZAP对人卵巢癌细胞SKOV3生长的影响的曲线图。
发明详述本文所公布的发明涉及抗原ALCAM存在于多种人类癌症中的有关发现，所述癌症包括但不局限于卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和乳癌。本发明提供了与ALCAM结合的抗体和多肽，以及制备和利用这些抗体和多肽诊断所说癌症并治疗这些癌症的方法。已发现抗ALCAM抗体通过与呈递于细胞表面的ALCAM结合并导致治疗剂内化进入癌细胞，可以抑制癌细胞在体外的生长。
I.一般技术除非另外提及，本发明的实施将应用本领域技术人员能力范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生化和免疫学常规技术。这些技术在以下文献中进行了充分的说明，如，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Mannual)，第二版(Sambrook等，1989)冷泉港出版社；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait编辑，1984)；分子生物学中的方法(Methods in MolecularBiology)，Humana出版社；细胞生物学实验室手册(Cell BiologyALaboratory Notebook)(J.E.Cellis编辑，1998)，学术出版社；动物细胞培养(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney编辑，1987)；细胞和组织培养入门(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum出版社；细胞和组织培养实验室方法(Cell and Tissue CultureLaboratory Procedures)(A.Doyle，J.B.Griffiths，和D.G.Newell编辑，1993-8)J.Wiley and Sons；酶学方法(Methods in Enzymology)(Academic Press，Inc.)；实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；哺乳动物细胞基因转移载体(Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells)(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M Ausubel等编，1987)；PCR聚合酶链式反应PCR(The Polymerase Chain Reaction)，(Mullis等编辑，1994)；免疫学通用方法(Current Protocols in Immunology)(J.E.Coligan等编辑，1991)；分子生物学简略方法(Short Protocols in Molecular Biology)(Wiley和Sons，1999)；免疫生物学(Immunobiology)(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；抗体(Antibodies)(P.Finch，1997)；抗体应用方法(Antibodiesa practical approach)(D.Catty编辑，IRL出版社，1988-1989)；单克隆抗体应用方法(Monoclonal antibodiesa practical approach)(P.Shepherd和C.Dean编辑，牛津大学出版社，2000)；应用抗体实验室手册(Usingantibodiesa laboratory manual)(E.Harlow和D.Lane，冷泉港实验室出版社，1999)；抗体(The Antibodies)(M.Zanetti和J.D.Capra编辑，HarwoodAcademic Publishers，1995)；和癌症肿瘤学原理和实践(CancerPrinciples and Practice of Oncology)(V.T.DeVita等编辑，J.B.Lippincott公司，1993)。
II.定义“抗体”是能通过位于免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点特异识别诸如多肽之类靶标的免疫球蛋白分子。用于本文时，此术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、天然存在的变体、包含具有所需特异性的抗原识别位点的抗体部分在内的融合蛋白质、诸如人源化抗体之类的嵌合抗体、以及包含具有所需特异性的抗原识别位点在内的任何其它修饰构型的免疫球蛋白分子。
“单克隆抗体”指可以包括天然变体的基本上同质的抗体群，其中的单克隆抗体是由涉及抗原的选择性结合的氨基酸(天然存在和非天然存在的)组成的。单克隆抗体是高度特异性的，定向于单一的抗原位点。该术语并不限制抗体的来源或其制备方式(如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组体表达、转基因动物技术，等等)。该术语包括上文“抗体”定义下的完整免疫球蛋白以及片段等。
“人源化抗体”指通常用重组技术制备的一种嵌合分子，它包含非人可变区和人恒定区。这样就消除了在人体内作为免疫原的恒定区，但仍保留了对外源可变区产生免疫应答的可能性(LoBuglio，A.F.等，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 864220-4224)。另一种方法不仅着手于提供来源于人的恒定区，还对可变区进行修饰以便将它们改造得尽可能接近人的形式。已知重链和轻链可变区均包含随应答的目标抗原不同而变化的并决定结合能力的三个互补决定区(CDR)，CDR的两侧是在给定物种中相对保守并被认为为CDR提供了脚手架的四个构架区(FR)。在制备针对特定抗原的非人抗体时，通过将来源于非人抗体的CDR移植至待修饰的人抗体的FR上可“改形(reshape)”或“人源化”可变区。将此方法应用于多种抗体中的有关报道参阅以下文献Sato，K.等，(1993)Cancer Res 53851-856；Riechmann，L.等，(1988)Nature 332323-327；Verhoeyen，M.等，(1988)Science 2391534-1536；Kettleborough，C.A.等，(1991)Protein Engineering 4773-3783；Maeda，H.等，(1991)HumanAntibodies Hybridoma 2124-134；Gorman，S.D.等(1991)Proc Natl AcadSci USA 884181-4185；Tempest，P.R.等，(1991)Bio/Technology 9266-271；Co，M.S.等，(1991)Proc Natl Acad Sci USA 882869-2873；Carter，P.等，(1992)Proc Natl Acad Sci USA 894285-4289；和Co，M.S.等，(1992)J Immunol 1481149-1154。在某些实施方案中，人源化抗体保持了所有CDR序列(例如，包含所有六个来自小鼠抗体的CDR的人源化小鼠抗体)。在其它实施方案中，人源化抗体具有相应于原先抗体有所改变的一个或多个CDR(1、2、3、4、5、6个)，它们也被称为“衍生自”原先抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。
与抗体或多肽“特异结合”或“优先结合”(在此可交换使用)的表位是一个本领域通晓的术语，而测定这些特异或优先结合的方法在本领域中是众所周知的。如果，某分子与特定细胞或底物的反应或结合相对于该分子与其它细胞或底物的反应或结合更频繁、更迅速、持续时间更长且/或具有更高的亲和力，那么此分子就被称为呈现了“特异结合”或“优先结合”。如果相对于与其它底物的结合而言，抗体与靶的结合具有更高的亲和性、亲合力、更容易且/或持续时间更长，那么该抗体就是“特异结合”或“优先结合”所说的靶。例如，特异或优先结合某ALCAM表位的抗体是相对于此抗体与其它ALCAM表位或非ALCAM表位的结合而言，与此ALCAM表位结合时亲和性、亲合力更高、更容易且/或持续时间更长的抗体。阅读此定义时也应理解，例如，与第一靶特异或优先结合的抗体(或部分或表位)可能会或可能不会与第二靶特异或优先结合。因此，“特异结合”或“优先结合”并非一定要求(尽管它可以包括)是唯一的结合。一般而言，但不是必定的，提及结合时是指优先的结合。
用于本文中时，术语“mKID2”、“抗体mKID2”和“单克隆抗体mKID2”可互换用于指保藏号为ATCC No.PTA-4478的宿主细胞或其后代所产生的免疫球蛋白。
抗ALCAM抗体与不同的生物学功能有关，包括但不局限于，结合ALCAM的能力(包括癌细胞上的ALCAM，包括但不局限于卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌或乳癌细胞上的ALCAM)、在体外或体内与暴露于活细胞表面的ALCAM的部分结合的能力、运送化学治疗剂至表达ALCAM的癌细胞(如卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌或乳癌细胞)的能力、将治疗剂或可检测标记运送入表达ALCAM的癌细胞(诸如卵巢癌细胞)内的能力。正如本文所讨论的，本发明的多肽(包括抗体)可以具有这些特征中的任一个或多个。
“抗ALCAM等价抗体”或“抗ALCAM等价多肽”指具有与抗ALCAM抗体有关的一种或多种生物学功能，诸如，结合特异性的抗体或多肽。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在此可互换用于指任何长度的氨基酸聚合物。所说的聚合物可以是线性的或有分支的，它可以包含已修饰的氨基酸，且可以被非氨基酸所中断。这些术语还包括已天然修饰或人工修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，诸如与标记组分缀合。还包括在此定义范围内的是，例如，含一种或多种氨基酸类似物(包括，例如，非天然的氨基酸，等等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。可以理解，因为本发明的多肽是以抗体为基础的，所以这样的多肽可作为单链或缔合的链存在。
在一实施方案中，药物组合物的“有效量”是指足以产生有益或期望结果的量，所述结果包括但不局限于以下临床结果例如，使肿瘤的尺寸减小、阻滞癌细胞的生长、延迟转移的发生、减少疾病产生的症状、提高疾病患者的生活质量、降低治疗该疾病所需的其它药物的剂量、通过诸如定向和/或内在化方式增强其它药物的效用、延迟疾病的发展、和/或延长患有与癌症相关的严重疾病的患者的存活期。在另一实施方案中，有效量是指在用ALCAM激动剂或拮抗剂治疗时足以调节(促进或抑制)新血管形成的量。有效量可以一次或分次施用。对于本发明的目的而言，药物组合物的有效量是指足以直接或间接减少(或破坏)癌细胞的增殖以及减缓和/或延迟癌细胞转移发生的量。在某些实施方案中，药物、化合物或药物组合物的有效量可以与或可以不与其它药物、化合物或药物组合物联合达到。因此，可以在施用一种或多种化学治疗剂的背景下考虑“有效量”，并且对于单个的药剂，如果在与一种或多种其它药剂联合的情况下，可能达到或会达到期望的效果，则可以认为以有效量施用该单个药剂。尽管个体需要不同，但确定每一组分有效量的最适范围是本领域技术人员能力范畴的内容。典型的剂量包括0.1-100mg/kg体重。优选的剂量包括1-100mg/kg体重。最优选的剂量包括10-100mg/kg体重。
用于本文时，“治疗”或“处理”是指用于获得有益的或期望的效果的方法，所说的效果包括并优选为临床效果。就本发明的目的而言，有益的或期望的临床效果包括，但不局限于，以下一种或多种减少癌细胞或其它疾病细胞的增殖(或消灭它们)、减少癌症中癌细胞的转移、使肿瘤的尺寸减小、减轻疾病产生的症状、提高疾病患者的生活质量、降低治疗该疾病所需的其它药物的剂量、延迟疾病的发展、和/或延长癌症患者的存活期。
用于本文时，“延迟转移的发生”指推迟、阻碍、减缓、推后、稳定和/或延迟瘤转移的发生。此延迟的时间长度可以变化，取决于癌症和/或待治疗个体的病史。事实上，正如对本领域技术熟练人员来说显而易见的，足够或显著的延迟可以包含预防，即个体不发生瘤转移。
“生物学样品”包括来自个体并可用于诊断或监测试验的各种样品。此定义包括血液和生物来源的其它液体样品、诸如活组织检查标本之类的实体组织样品或由其衍生的组织培养物或细胞及其后代，例如，从收集自疑似癌症患者个体的组织样品中获得的细胞，优选地来自卵巢、肺、前列腺、胰腺、结肠和乳房组织。术语“生物学样品”既包括临床样品，还包括培养中的细胞、细胞上清、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。
于本文中，当核酸分子、药剂、抗体、组合物或细胞等基本上与其天然来源中的杂质核酸分子、抗体、药剂、组合物或细胞等分开时，我们说该核酸分子或药剂、抗体、组合物或细胞等是“分离的”。
“个体”是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。所说的哺乳动物包括但不局限于农畜、运动型动物、宠物(如猫、狗、马)、灵长类、小鼠和大鼠。
用于本文中时，“药剂”指生物学、制药学或化学化合物。举例来说包括但不局限于简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、维生素衍生物、碳水化合物、毒素或化学治疗化合物。多种化合物可被合成，例如，小分子和寡聚体(如寡肽和寡核苷酸)，以及基于各种核心结构合成的有机化合物。此外，可从多种天然来源，诸如植物或动物提取物，等等中筛选化合物。本领域技术人员很容易认识到，有关本发明药剂的结构性质并不存在限制。
应用于本发明方法中的药剂可以随机挑选或理性的进行选择或设计。于本文中，未考虑ALCAM与其天然配偶体或已知抗体结合中所涉及的特异序列而随机挑选的药剂被称为是随机选择的。随机选择药剂的例子是使用化学文库或肽组合文库。
本文中，考虑到药剂作用的靶位点序列和/或其构象而非随机挑选的药剂被认为是理性选择或设计的。就抗ALCAM药剂而言，目前认为在ALCAM上至少有三个可以引起抗体形成的表位，因此对于药剂来说至少有三个阻断ALCAM/抗ALCAM相互作用的作用位点。本发明还包括作用于ALCAM和其天然结合配偶体间相互作用位点处的药剂，通常已知的天然结合配偶体为CD6(其它天然配体和它们的活性ALCAM相互作用位点也包括在本发明的范围内，不管是目前已知的或以后确定的)。利用组成受体/配体对和/或ALCAM/抗ALCAM抗体对的接触位点的肽序列可理性的选择或设计药剂。例如，理性选择的肽药剂可以是其氨基酸序列与在ALCAM的天然环境中暴露于活细胞表面的ALCAM上所呈现的表位一致的肽。这样的药剂将通过与抗ALCAM抗体或CD6的结合而减少或阻断ALCAM抗体与ALCAM的缔合或ALCAM与CD6的缔合。
用于本文中时，术语“标记的”对于抗体而言包括通过偶联(即物理连接)可检测物质对抗体进行直接标记，如将放射性试剂或荧光基团(如异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE))偶联到抗体上，和通过与可检测物质反应间接标记探针或抗体。
用于本文中时，术语“缔合(association)”就抗体而言包括与药剂(如化学治疗剂)的共价和非共价附着或结合。抗体可以通过直接结合的方式与药剂(如化学治疗剂)缔合，或通过附着于共同平台上以间接结合的方式缔合，这样抗体可以指导药剂定位于抗体所结合的癌细胞处，其中抗体和药剂在生理条件下基本上不解离从而使得药剂可以导向于与抗体结合的相同癌细胞或使得药剂的效力不会降低。
III.抗ALCAM抗体的组合物本领域中存在特异于活化的白细胞粘附分子(ALCAM)的已知抗体，包括多克隆和单克隆抗体。至2002年四月为止，公众可获得的抗ALCAM抗体可来自R&D System，Inc.；克隆18，来自Antigenix America Inc.，纽约；克隆3A6，来自Ancell公司，明尼苏达；克隆j3-119，来自Chromaprobe有限公司，加州；克隆L50，来自Caltag Laboratories有限公司，加州；目录号AF656的产品，来自R&D Systems有限公司，明尼苏达； (这些列举于Linscott氏免疫学和生物学试剂字典(ISSN0740-7394)中)，以及多克隆抗体，来自Santa Cruz Biotechnology。这些抗体可以购买到，或抗原ALCAM可以购买到或通过常规方法获得并用作免疫原来产生别的抗ALCAM抗体。利用表达ALCAM的细胞作为免疫原的技术在下文中有进一步的详述。
本发明还包括组合物，包括药物组合物，其中包含抗ALCAM抗体、衍生自抗ALCAM抗体的多肽、含抗ALCAM抗体编码序列的多核苷酸和本文所述的其它药剂。抗体mKID2是适用于本发明实践中的抗ALCAM抗体。它产生自2002年6月21日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Blvd.，Manassas VA 20110-2209)的杂交瘤，该杂交瘤的保藏编号为PTA-4478。用于本文中时，组合物还包含可以与ALCAM结合的一种或多种抗体、多肽和/或蛋白质，以及/或含有编码可以与ALCAM结合的一种或多种抗体、多肽和/或蛋白质的序列的一种或多种多核苷酸。正如下文所进一步论述的，本发明的组合物还包括可以增加或减少ALCAM介导的新血管形成的药剂。不局限于任何特殊的作用机制，这些新血管形成调制剂可直接作用于ALCAM或作用于其天然的或诱导产生的结合配偶体。依照本发明的教导，CD6是已知的结合配偶体的一个例子，它适于用增加和减少ALCAM所介导的新血管形成的药剂进行调节。在本发明实践中可利用具有本文所述的期望特征的抗CD6抗体。
除了药理学活性剂外，本发明的组合物还可包含合适的可药用载体，包括本领域众所周知的赋形剂和辅助剂，它将有利于将活性化合物加工成在制药学上可用于向作用位点递送的制剂。适于肠胃外投药的适宜制剂包括水溶形式的活性化合物，例如水溶性盐的水溶液。此外，当适于油性注射悬浮液时还可施用活性化合物的悬浮液。合适的亲脂性溶剂或赋形剂包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射悬浮液可包含增加悬浮液粘性的物质，包括，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可任选地包含稳定剂。脂质体也可用于将药剂包囊化以便向细胞递送。
依照本发明全身施用的药用制剂可配制成肠道内施用、肠道外施用或局部施用的形式。实际上，所有的三种制剂可同时施用以达到全身施用活性组分的目的。
适于口服的制剂包括硬的或软的明胶胶囊、药丸、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、悬浮剂、糖浆或吸入剂和其控释形式。
可以用以下任何标准(一条或多条)对本发明的抗体、药剂、多肽和蛋白质进行进一步的鉴定和表征(a)与ALCAM(包括癌细胞，包括但不局限于卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌或乳癌细胞上的ALCAM)结合的能力；(b)竞争性抑制已知抗ALCAM抗体与ALCAM优先结合的能力，包括优先结合与原始抗体所优先结合的ALCAM表位相同的表位的能力；(c)体外或体内与暴露于活细胞表面的ALCAM部分结合的能力；(d)与暴露于活的癌细胞表面的ALCAM部分结合的能力，所述癌细胞诸如但不局限于，卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌或乳癌细胞；(e)将化学治疗剂或可检测标记递送至表达ALCAM的癌细胞(诸如但不局限于，卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌或乳癌细胞)的能力；(f)将治疗剂递送至表达ALCAM的癌细胞(诸如但不局限于卵巢癌细胞)的能力。
在某些实施方案中，本发明的抗体是ATCC PTA-4478的宿主细胞或其后代产生的抗体mKID2。本发明还包括各种mKID2制剂和等价的抗体或多肽片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、单链抗体(ScFv)、它们的突变体、含抗体一部分的融合蛋白、人源化抗体、和含有具有所需特异性的抗原(ALCAM)识别位点在内的任何其它已修饰构型的mKID2。本发明还提供展示出mKID2的一种或多种生物学特征的人抗体。可以用上述五个标准中的任一条或多条对mKID2的等价抗体(包括人源化抗体和人抗体)、mKID2的多肽片段和含这些片段之任一的多肽进行鉴定和表征。
在某些实施方案中，与ALCAM结合的本发明抗体、多肽和蛋白质是竞争性抑制mKID2与ALCAM优先结合的抗体、多肽和蛋白质。在某些实施方案中，抗体、多肽和蛋白质优先结合ALCAM上与抗体mKID2所优先结合的表位相同的表位。
因此，本发明提供以下任一物质(或包含以下任一物质的组合物，包括药物组合物)(a)ATCC PTA-4478的宿主细胞或其后代产生的抗体mKID2；(b)人源化形式的抗体mKID2；(c)含抗体mKID2的一个或多个轻链和/或重链可变区的抗体；(d)嵌合抗体，含有来自抗体mKID2重链和轻链可变区或与之同源的可变区以及来自人抗体重链和轻链恒定区或与之同源的恒定区；(e)包含mKID2的一个或多个轻链和/或重链CDR(至少1、2、3、4、5或6个)的抗体；(f)含mKID2重链和/或轻链的抗体；(g)与mKID2等价的人抗体。抗体的人源化形式可以具有或不具有与mKID2或ATCC PTA-4478宿主细胞所产生的抗体一致的CDR。CDR区域的确定是本领域技术人员所熟知的。在某些实施方案中，本发明提供了含有至少一个CDR与mKID2或ATCC PTA-4478宿主细胞所产生的抗体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个CDR基本上同源(或，在某些实施方案中与mKID2的或衍生自mKID2的所有6个CDR基本上同源)的CDR的抗体。其它的实施方案包括具有至少2个、3个、4个、5个或6个CDR与mKID2的或衍生自mKID2的或ATCC PTA-4478宿主细胞所产生抗体的至少2个、3个、4个、5个或6个CDR基本上同源的抗体。可以理解，为了达到本发明的目的，通常保留结合特异性和/或整体活性(该活性可以就如下而言递送化学治疗剂至或进入癌细胞从而减缓癌细胞的生长和/或增殖、在癌细胞中诱发细胞程序死亡、延迟转移的发生；以及/或缓解性治疗)，尽管与mKID2相比活性程度可能有所变化(可能更高或更低)。本发明还提供了制备任何此类抗体的方法。制备抗体的方法是本领域所已知的且在本文中对其进行了描述。
本发明还提供了含诸4如mKID2之类本发明抗体的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，该多肽含有所说抗体的一个或多个轻链和/或重链可变区。在某些实施方案中，该多肽含有所说抗体的一个或多个轻链和/或重链CDR。在某些实施方案中，该多肽含有所说抗体的轻链和/或重链的三个CDR。在某些实施方案中，该多肽含有具有以下任一片段的所说抗体的氨基酸序列原始抗体序列中的至少5个连续的氨基酸、至少8个连续的氨基酸、至少约10个连续的氨基酸、至少约15个连续的氨基酸、至少约20个连续的氨基酸、至少约25个连续的氨基酸、至少约30个连续的氨基酸，其中至少有3个氨基酸来自抗体的可变区。在某一实施方案中，可变区来自原始抗体轻链。在另一实施方案中，可变区来自抗体的重链。在另一实施方案中，有5个(或更多个)连续氨基酸来自抗体的互补决定区(CDR)。
IV.产生抗ALCAM抗体的方法制备抗ALCAM抗体的方法是本领域已知的。通常，单克隆抗体产生于非人物种中，诸如小鼠。通过用免疫原性量的含有人ALCAM的细胞、细胞提取物或蛋白质制品(如，人胸腺上皮细胞)免疫小鼠产生抗体。可将作为免疫原使用的细胞在用作免疫原前先培养一段时间(至少24个小时)。细胞自身可用作免疫原，或可与诸如Ribi之类非变性佐剂联合起来用作免疫原。一般而言，细胞在用作免疫原时应保持完整且优选有生存力。与破裂细胞内的抗原相比，完整细胞可使抗原更好地被检测到。变性佐剂或粗糙的佐剂(harsh adjuvant)，如弗氏佐剂的使用可能破裂细胞，因此并不鼓励使用。可诸如两周一次或每周一次定期间隔多次施用免疫原，或可以用能维持其在动物体内(如在组织重组体内)的生存能力的方式施用。杂交瘤可以例如，利用通常的体细胞杂交技术融合脾细胞和小鼠肿瘤配偶体而制备(Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497)。
作为细胞融合技术的另一个选择，可用EBV永生化的B细胞生产本发明的单克隆抗体。如果需要，可将所说的杂交瘤扩增和亚克隆，并用常规检测方法(如，FACS、IHC、放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法，等等)测定上清的抗免疫原活性。
或者，可通过重组方法制备抗体。制备重组抗体的方法在本领域中是众所周知的。单克隆抗体mKID2和任何其它等价抗体都可在体外测序并用重组方法产生。在一个实施方案中，对mKID2进行测序，然后将多核苷酸序列克隆入用于表达或增殖的载体中。编码目的抗体的序列可保持在宿主细胞内的载体中，然后扩增宿主细胞并将其冻存以备未来使用。或者，可以用噬菌体展示技术制备重组抗体。参阅，例如，美国专利NO.5565332、5580717、5733743、6265150；以及Winter等，Annu.Rev.Immunol.(1994)12433-455。
可用本领域技术人员众所周知的Edman降解法对抗体mKID2或任何其它目的抗体或目的蛋白进行测序。可用质谱或Edman降解法产生的肽信息来设计探针或引物用于克隆目的蛋白。
克隆目的蛋白的另一种方法是用ALCAM“淘选”表达目的抗体或蛋白的细胞。“淘选”方法进行如下从表达目的抗体或蛋白的组织或细胞获取cDNA文库，在另一种类型的细胞中过表达cDNA，筛选特异结合ALCAM的后一种类型的被转染细胞。在本领域中可找到通过“淘选”用于克隆编码细胞表面蛋白质的哺乳动物基因的方法的有关详述。参阅，例如，Aruffo，A.和Seed，B.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，8573-8577(1987)和Stephan，J.等，Endocrinology 1405841-5854(1999)。
可按照本领域的标准方法将来自特定细胞类型的mRNA进行逆转录获取cDNA。具体而言，可按照Sambrook等人(引文同上)提出的方法用各种分解酶或化学溶液分离mRNA或按照制造商(如，Qiagen，Invitrogen，Promega)提供的附属说明书通过商品化的核酸结合树脂提取mRNA。然后将合成的cDNA引入表达载体中从而在另一种类型的细胞中产生目的抗体或蛋白。这就意味着表达载体在宿主细胞内必须是可复制的，或者作为附加体或者作为染色体DNA的一部分存在。合适的表达载体包括但不局限于质粒、病毒载体，包括腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒，以及粘粒。
可用许多合适方法中的任一种将含目的多核苷酸的载体引入宿主细胞中，包括电穿孔；利用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质进行的转染；微粒轰击；脂转染法；和感染(如，在载体为诸如痘苗病毒之类的感染剂的情况下)。对引入载体或多核苷酸的方法的选择将常常取决于宿主细胞的性质。
任何能过表达异源DNA的宿主细胞都可用于分离编码目的抗体、多肽或蛋白的基因。非局限性的哺乳动物宿主细胞例子包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。优选的，宿主细胞中cDNA的表达水平比宿主细胞中相应内源性目的抗体或蛋白(如果有的话)的表达水平高约5倍，更优选高10倍，还更优选高20倍。可以用免疫检测法或FACS筛选特异结合ALCAM的宿主细胞。过表达目的抗体或蛋白的细胞可被鉴别。
本发明包括含本发明抗体如mKID2的氨基酸序列的多肽。可用本领域已知的方法制备本发明的多肽。可用如上所述的重组方法(即，单一的多肽或融合多肽)或化学合成法或通过抗体的蛋白水解或其它降解方式产生多肽。抗体的多肽，尤其是长度不超过约50个氨基酸的较短多肽可通过化学合成方便的制备。化学合成法是本领域已知的且已商品化。例如，可应用固相方法通过自动多肽合成仪生产mKID2多肽。
本发明还包括诸如mKID2之类的本发明抗体的单链可变区片段(“scFv”)。通过用短的连接肽连接轻链和/或重链可变区可以制备单链可变区片段。Bird等(1988)Science242423-426。连接肽的例子是(GGGGS)3(SEQ ID NO1)，它在一个可变区的羧基末端和另一个可变区的氨基末端间架设一约3.5nm的桥梁。还有其它序列的接头也已被设计并应用。Bird等(1988)。接头还可反过来被修饰以获得附加的功能，诸如与药物附着或与固相支持物附着。单链变体可通过重组或合成方式产生。为了进行scFv的合成生产，可使用自动合成仪。为了进行scFv的重组生产，可将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入合适的宿主细胞，诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞等真核细胞或诸如大肠杆菌之类的原核细胞。可通过诸如多核苷酸连接之类的常规操作制备编码目的scFv的多核苷酸。所产生的scFv可用本领域已知的标准蛋白质纯化技术进行分离。
本发明包括对抗体进行的修饰，诸如对抗体mKID2和其它抗ALCAM抗体的修饰，包括未显著影响其特性的功能上同等的抗体和多肽以及活性增强或降低的变体。对多肽进行修饰在本领域中是常规的实验，在此不必详述。经修饰的多肽的例子包括其中具有氨基酸残基保守性替代、缺失或添加了一个或多个氨基酸却未使其功能活性有显著不利变化，或应用了化学类似物的多肽。可保守性替代成另一氨基酸的氨基酸残基包括但不局限于甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸；赖氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。这些多肽还包括糖基化和非糖基化的多肽，以及经其它翻译后修饰的多肽，诸如，用不同的糖进行糖基化、乙酰化和磷酸化。优选的，氨基酸替代是保守性的，即，用于替代的氨基酸具有与原来的氨基酸相似的化学特性。这样的保守性替代是本领域所已知的，上文已提供了其实例。氨基酸修饰的涵盖范畴可以包括从改变或修饰一个或多个氨基酸到完全重新设计某区域，如可变区。可变区中的变化可改变结合亲合力和/或特异性。进行修饰的其它方法包括使用本领域已知的偶联技术，包括但不局限于，酶促方法、氧化取代和螯合。修饰作用可用于，例如，连接在免疫检测法中使用的标记物，如连接在放射免疫测定法中使用的放射性部分。可用本领域已建立的方法制备经修饰的mKID2多肽并且用本领域已知的标准检测法进行筛选。
本发明还包括含有来自诸如mKID2之类本发明抗体的一个或多个片段或区域的融合蛋白。在一个实施方案中，提供了含可变轻链区中至少10个连续氨基酸和可变重链区中至少10个氨基酸的融合多肽。在另一实施方案中，融合多肽含有异源免疫球蛋白的恒定区。在另一实施方案中，融合多肽包含mKID2的轻链可变区和重链可变区。为了达到本发明的目的，mKID2融合蛋白包含一个或多个mKID2多肽以及在mKID2天然分子中未连接的其它氨基酸序列，例如，来自另一区域的异源序列或同源序列。可用本领域已知的方法，例如合成或重组方法产生mKID2多肽。
因为产生的抗体通常是小鼠抗体或其它非人抗体，所以产生自杂交瘤的抗体在人体内会引起免疫应答。为了减少免疫应答，抗体可以被“人源化”。产生人源化抗体的技术是本领域已知的。可生产含有来自小鼠抗ALCAM抗体的可变区和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合分子。通过只将小鼠抗体互补决定区(CDR)移植至人抗体可变构架上可进一步使免疫应答最小化，但此修饰会导致所产生的嵌合抗体的结合活性降低。进一步的改进可涉及通过鉴定具有增强结合亲合力的改变的抗体可变区优化抗体可变区(参阅，例如，WO01/27160)。
在某些实施方案中，提供了mKID2嵌合体，其中的重链和/或轻链是融合蛋白。在某些实施方案中，链的恒定结构域来自一特定物种和/或类型，而可变结构域来自不同的物种和/或类型。例如，嵌合抗体(在某些实施方案中)中的恒定区可以来自于人，而可变区可以与之同源或来自mKID2(即，小鼠)。还包含于本发明中的是具有人源化可变区的抗体，其中(在某些实施方案中)CDR区域包含mKID2氨基酸序列，而构架区则来自于人的序列。其它形式的人源化抗体是本领域所已知的并描述于此。此外还包括嵌合体的功能片段。其中一个例子是人源化的Fab片段，它包含人的铰链区、人的第一恒定区、人1轻或重链恒定区和mKID2的轻和/或重链可变区。人源化的mKID2 Fab片段可反过来制备成Fab二聚体。通常，本发明的mKID2融合蛋白和mKID2嵌合体可通过用本文所述重组方法制备抗体编码多核苷酸并表达之来制造，尽管它们也可用本领域已知的其它方法制备，包括，例如，化学合成。参阅，例如，美国专利NO.5807715；4816567和6331415。
可以通过4个一般步骤来使单克隆抗体人源化。它们是(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预期的氨基酸序列，(2)设计人源化抗体，即，决定在人源化过程中使用什么抗体构架区，(3)真正的人源化方法学/技术和，(4)转染和表达人源化抗体。例如，如果抗体用于人的临床试验和治疗中，可将恒定区工程化以便更类似于人的恒定区从而避免免疫应答。参阅，例如，美国专利NO.5997867和5866692。
文献中已描述了包含来自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的许多“人源化”抗体分子，包括含有与人恒定区融合的啮齿动物或修饰过的啮齿动物V区及其相关互补决定区(CDR)的嵌合抗体。参阅，例如，Winter等，Nature 349293-299(1991)；Lobuglio等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 864220-4224(1989)；Shaw等，J Immunol.1384534-4538(1987)和Brown等，Cancer Res.473577-3583(1987)。其它文献描述了在与合适的人抗体恒定结构域融合前移植入人支持构架区(FR)内的啮齿动物CDR。参阅，例如，Riechmann等，Nature332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988)和Jones等，Nature321522-525(1986)。另外的文献描述了用重组镶嵌的啮齿动物构架区支持的啮齿动物CDR。参阅，例如，欧洲专利出版物519596。设计这些“人源化”分子的目的在于使得针对于啮齿动物抗人抗体分子的不想要的免疫学应答最小化，这样的免疫应答将限制这些结构成分在人受体中治疗施用时的持续时间和效力。还可利用的将抗体人源化的其它方法，参阅，Daugherty等，Nucl.Acids Res.192471-2476(1991)和美国专利NO.6180377、6054297、5997867、5866692、6210671、6350861和PCT WO01/27160。
另外，还可用已被工程化从而表达特异的人免疫球蛋白的商品化小鼠获得完全人抗体。还可将设计成产生更期望的(如，完全的人抗体)或更强的免疫应答的转基因动物用于产生人源化的或人的抗体。这些技术的例子有来自Abgenix，Inc.(Fremont，CA)的XenomouseTM和来自Medarex，Inc.(Princeton，NJ)的HuMAb-Mouse和TC MouseTM。
V.ALCAM结合抗体的筛选方法有许多方法可用于筛选与ALCAM结合的单克隆抗体。一种可应用的方法是免疫组织化学法(IHC)。标准的免疫组织化学技术是本领域技术人员所已知的。参阅，例如，动物细胞培养方法(Animal Cell CultureMethods)(J.P.Mather和D.Barnes编辑，学术出版社，第57卷，第18章和19章，第314-350页，1998)。
在IHC筛选中选择合适的抗ALCAM抗体的第一步是将一抗与多种组织或细胞结合。生物学样品(如，组织)可获自活组织检查、尸体解剖或尸检。在一个实施方案中，组织样品可以是来自不同器官的冰冻组织切片。冰冻组织可用本领域技术人员已知的许多方法中的任一种在固定或未固定的情况下制备、切片，然后进行IHC。参阅，例如，Stephan等，Dev.Biol.212264-277(1999)和Stephan等，Endocrinology 1405841-54(1999)。在另一实施方案中，组织样品是新鲜组织的切片。所说的细胞或组织样品可以是癌性的或非癌性的。
可利用许多不同的检测系统探测抗体与组织切片的结合。典型地，免疫组织化学法包括使一抗与组织结合，然后与缀合了可检测标记(如，辣根过氧化物酶、HRP或碱性磷酸酶)的二抗(与产生一抗的物种具反应性)结合。可利用的另一种方法是多克隆镜像互补抗体或polyMICA。D.C.Mangham和P.G.Isaacson所述的(组织病理学(Histopatholoy)(1999)35(2)129-33)polyMICA(多克隆镜像互补抗体)技术可用于检测一抗与正常组织和癌组织的结合。有数种polyMICATM检测试剂盒可购自The Binding Site Limited(P.O.Box 4073 Birmingham B29 6AT England)。编号为HK004.D的产品是利用DAB为色原的polyMICATM检测试剂盒。编号为HK004.A的产品是利用AEC为色原的polyMICATM检测试剂盒。或者，可用可检测标记物直接标记一抗。
为了确定抗体是否与ALCAM特异结合，可用Western印迹法检测抗体与ALCAM的结合(参阅实施例1)。或者，可通过在已知表达ALCAM的组织上的结合检测抗体与ALCAM的特异结合。可将组织样品包埋在防止冷冻过程中的损坏的固体或半固体物质(如，琼脂糖凝胶或OCT)中，然后切片用于染色。来自不同器官和处于不同阶段的癌症可用于筛选抗体。可用于筛选目的的组织例子包括但不局限于卵巢、肺、前列腺、胰腺、结肠和乳房。
或者，诸如但不局限于SK-Ov-3(ATCC#HTB 77)、CFPAC-1(ATCC#CRL 1918)和HPAF-II(ATCC#CRL-1997)之类的癌细胞系和诸如但不局限于卵巢上皮细胞、支气管上皮细胞和活化的白细胞之类来自各自组织的正常细胞可用于筛选对ALCAM具有结合亲合力的单克隆抗体。已知无ALCAM表达的培养细胞，诸如MOLT-3(ATCC#CRL-1552)和SK-LMS-1(ATCC#HTB88)可用作阴性对照。癌性或非癌性的细胞可按照文件WO 01/43869中所述的方法培养于玻璃载玻片或盖玻片或塑料表面上，或制备于CellArrayTM中，并用如上所述用于组织的IHC筛选与抗体的结合。或者，可用非蛋白水解的方式从培养表面取下细胞并离心沉淀，然后将其像组织一样包埋和处理以进行如上所述的IHC分析。或者，单细胞可通过与一抗和连接了荧光分子的二级报道抗体一起温育进行筛选，然后用荧光激活细胞分拣(FACS)器进行分析。
选择与表达ALCAM的癌细胞或组织结合的抗体。在优选的实施方案中，单克隆抗体与人细胞有交叉反应性。2D4和mKID2是与抗原ALCAM结合的抗体的实例，ALCAM存在于许多不同的癌组织上，包括但不局限于卵巢、肺、前列腺、胰腺、结肠和乳房组织。
可选择上述分泌单克隆抗体的杂交瘤来产生这样的抗体，该抗体优先结合ALCAM上与已知抗ALCAM抗体所优先结合的表位相同的表位。选择这些抗体的方法是本领域所已知的。例如，结合竞争检测法可用于确定抗体是否能与原抗体竞争性地抑制与同一表位的结合。一个抗体与另一抗体竞争性地结合ALCAM，表明了该抗体优先结合原抗体所结合的表位。目前认为当ALCAM在其天然环境中以天然构型存在于细胞表面上时其上至少有两个和可能的更多个表位。因此，可能具有变化的结合特异性但仍保持本发明的期望生物学作用的抗ALCAM抗体也包括在本发明的范围内。结合竞争检测法是本领域众所周知的。
表位作图可用于对抗体进行进一步的表征。商品化的服务(如，PepscanSystems，P.O.Box 2098，8203 AB Lelystad，荷兰)可用于确定抗原ALCAM上的哪一个表位是抗体所结合的。
VI.抗ALCAM抗体与化学治疗剂的缔合在一个实施方案中，抗ALCAM的抗体(或其片段)可以与化学治疗剂缔合(包括连接)。可以向需要此类治疗的个体施用此化学治疗剂，以便将这些药剂递送至表达该抗体所识别的抗原的癌细胞处并由此消灭癌细胞。化学治疗剂包括放射性分子和毒素，后者也被称为细胞毒素或细胞毒性剂，它包括不利于癌细胞生存的任何药剂，另外，化学治疗剂还包括含化学治疗化合物的药剂和脂质体或其它囊泡。化学治疗剂的例子包括但不局限于加利车霉素、美登木素生物碱、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、鬼臼亚乙苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春花新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺红菌素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、嘌呤霉素及其类似物或同系物、抗代谢物(如，氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、decarbazine)、烷化剂(如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、cyclothosphamide、二甲磺酸丁酯、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺氯氨铂)、蒽环霉素(如，道诺红菌素(从前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(如，更生霉素(从前的放线菌素)、博莱霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(如，长春花新碱和长春花碱)。在优选的实施方案中，细胞毒素对分裂的或快速分裂的细胞尤其有效，这样未分裂的细胞就相对不受毒性作用的伤害。
本发明的抗体可被内化入它们所结合的癌细胞(诸如卵巢癌细胞)内并因此对于治疗应用特别有用，例如，将由于其不利的活性而需内在化的毒素送入细胞。这些毒素的例子包括但不局限于皂草素、加利车霉素、auristatin和美登木素生物碱。
本发明的抗体或多肽可与放射性分子、毒素或其它治疗剂或含治疗剂的脂质体或囊泡共价或非共价、直接或间接地缔合(包括缀合或连接)。抗体可与放射性分子、毒素或化学治疗分子在抗体上的任何位置连接，只要抗体能与其靶ALCAM结合就可。
毒素或化学治疗剂可与合适的单克隆抗体直接或间接(如，通过连接基团，或者通过具有合适附着位点的连接分子，如美国专利5552391所述的平台分子)偶联(如，共价键合)。本发明的毒素和化学治疗剂可利用本领域已知方法与此特定的导向蛋白(targeting proteins)直接偶联。例如，当药剂和抗体具有能相互反应的取代基时，它们之间的直接反应就是可能的。例如，在一个分子上的亲核基团，诸如氨基或巯基，可能可以与另一分子上的含羰基基团，诸如酸酐或酰基卤，或含良好离去基团的烷基(如，卤化物)反应。
抗体或多肽还可通过微载体与化学治疗剂连接。微载体指不溶于水的生物可降解或生物不可降解微粒，其尺寸小于约150、120或100μm，更常见的是小于约50-60μm，优选小于约10、5、2.5、2或1.5μm。微载体包括“纳米载体”，它是尺寸小于约1μm的微载体，优选小于约500nm。这样的微粒在本领域中是已知的。固相微载体可以是由生物相容性天然聚合物、合成聚合物或合成共聚物形成的微粒，它可以包括或不包括由琼脂糖或交联琼脂糖以及本领域已知的其它生物可降解材料形成的微载体。生物可降解固相微载体可以由在哺乳动物生理学条件下可降解的(如，聚(乳酸)、聚(羟基乙酸)及其共聚物)或可侵蚀的(如，聚(原酸酯，诸如3，9-二亚乙基-2，4，8，10-四氧杂螺[5，5]十一碳烷(DETOSU)，或聚(酸酐)，诸如癸二酸的聚(酸酐))聚合物形成。微载体还可以是液相的(如，以油或脂质为基础的)，诸如脂质体、无抗原的iscom(免疫刺激性复合物，它是胆固醇、磷脂和具有佐剂活性的皂甙的稳定复合物)，或以水包油或油包水乳剂存在的微滴或微胶粒，只要该液相微载体是生物可降解的即可。生物可降解液相微载体通常掺合了生物可降解油，其中的许多油是本领域所已知的，包括角鲨烯和植物油。微载体通常是球形的，但非球形的微载体也是可接受的(如，椭圆形、杆状，等)。由于它们不可溶的特性(相对于水而言)，微载体可从水和以水为基础的溶液(水溶液)中过滤出来。
本发明的抗体或多肽缀合体可以包括双官能接头，该接头含有能与毒性剂或化学治疗剂偶联的基团和能与抗体偶联的基团。接头可用作间隔区将抗体和药剂分隔开以避免干扰结合能力。接头可以是可裂解的或不可裂解的。接头还可用于提高药剂或抗体上取代基的化学反应性，并由此提高偶联效率。化学反应性的提高还可以有利于原不可能使用的药剂或药剂上官能基团的使用。双官能接头可通过本领域已知的方式与抗体偶联。例如，含活性酯部分，诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯的接头可用于通过酰胺键与抗体中的赖氨酸残基偶联。在另一实例中，包含亲核胺或肼残基的接头可与抗体碳水化合物残基糖酵解氧化作用所产生的醛基偶联。除了这些直接的偶联方法外，接头还可通过诸如氨基葡聚糖之类的中间载体间接与抗体偶联。在这些实施方案中，修饰后的连接通过赖氨酸、碳水化合物或中间载体实现。在一个实施方案中，接头以位点选择性方式与蛋白质中的自由疏基偶联。适于选择性偶联蛋白质上的疏基的部分是本领域众所周知的。例子包括二硫化物化合物、α-卤代羰基和α-卤代羧基化合物以及顺丁烯二酰亚胺。当亲核胺官能团与α-卤代羰基或羧基出现于同一分子中时，就存在通过胺的分子内烷基化发生环化作用的可能。防止这种问题发生的方法是本领域普通技术人员众所周知的，例如制备其中的胺和α卤代官能团被诸如芳基或反式-烯烃之类刚性基团分开的分子，这样将使得不想要的环化作用在立体化学上是不利的。参阅，例如，用于通过二硫化物部分制备美登木素生物碱和抗体的缀合物的美国专利NO.6441163。
可用于制备抗体-药物缀合体的可裂解接头之一是以顺乌头酸为基础的酸不稳定性接头，它利用了诸如受体介导的胞吞过程中遇到的内体和溶酶体之类的不同细胞内区室的酸性环境。参阅，例如，Shen等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048-1054(1981)，有关道诺红菌素和大分子载体的缀合物的制备；Yang等，J.Natl.Canc.Inst.801154-1159(1988)，有关道诺红菌素和抗黑素瘤抗体的缀合物的制备；Dillman等，Cancer Res.486097-6102(1988)，有关用酸不稳定性接头以相似方式制备道诺红菌素与抗T细胞抗体的缀合物；Trouet等，Proc.Natl.Acad.Sci.79626-629(1982)，有关通过肽间隔臂连接道诺红菌素和抗体。
本发明的抗体(或多肽)可通过本领域已知的任何方法与放射性分子缀合(连接)。对抗体进行放射性标记的有关方法的讨论参阅“用单克隆抗体进行的癌症治疗(Cancer Therapy with Monoclonal Antibodies)”，D.M.Goldenberg编辑(CRC出版社，Boca Raton，1995)。
或者，如Segal在美国专利NO.4676980中所述的，抗体可与二抗缀合形成抗体杂缀合物。交联抗体的形成可将免疫系统定向于特异的细胞类型，例如，表达ALCAM的癌细胞。
VII.ALCAM是多种非黑素瘤癌症的标记有关报道已公开ALCAM表达于转移的恶性黑素瘤中，而在非转移性细胞系中则检测不到(Degen等，(1998)Am J Pathol 152805-813)。抗ALCAM单克隆抗体2D4和mKID2被用于筛选各种非黑素瘤癌细胞，包括卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和乳癌细胞。我们已发现除了转移的恶性黑素瘤外，某些癌症细胞也表达ALCAM，包括卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和乳癌细胞。利用抗ALCAM抗体筛选癌细胞取决于ALCAM在癌细胞上和在同一类型的正常细胞上有不同的表达。在一个实施方案中，该方法包括，使生物学样品与抗ALCAM抗体接触，并将待测样品中存在或缺乏ALCAM的情况和对照样品中存在或缺乏ALCAM的情况相比较。用抗ALCAM单克隆抗体2D4筛选原发性和转移性卵巢癌和前列腺癌组织，发现原来在正常组织中ALCAM表达呈阴性的细胞出现ALCAM表达。用Medarex，Inc.(Princeton，NJ)提供的转基因小鼠所产生的抗ALCAM单克隆抗体2D4测定了卵巢癌和前列腺癌组织以及一组正常组织中ALCAM的表达水平，见实施例2。另外还检测了原发性和转移性胰腺癌细胞系中ALCAM的表达。如实施例3所示，9个胰腺癌细胞系中有8个表达可检测水平的ALCAM，而在正常胰腺中ALCAM只在导管上皮细胞内表达。另外还检测了原发性肺鳞状细胞癌细胞系并发现有ALCAM的表达，参见实施例4。此外还用单克隆抗体mKID2检测了结肠癌、肺癌、前列腺癌和乳癌组织以及皮肤、肾、肺、肝、胰腺、结肠和十二指肠正常组织中ALCAM的表达，见实施例6。
VIII.诊断癌症的方法为了诊断的目的，按照本文所公布方法制备的单克隆抗体可用于鉴定或检测各种细胞和组织中是否存在表达抗原ALCAM的癌细胞，所说的细胞和组织包括但不局限于卵巢、肺、前列腺、胰腺、结肠或乳房细胞和组织。这其中包括使ALCAM与特异结合ALCAM的抗体形成复合物，以评估生物学样品中ALCAM的水平。在优选的实施方案中，抗体携带可检测的标记物。可使用的标记物的例子包括放射性物质或荧光团，诸如异硫氰酸荧光素或藻红蛋白。这样的复合物可在体外或体内形成。单克隆抗体还可用于鉴别在不同发育阶段的癌细胞。抗体可识别表达ALCAM的卵巢、前列腺和胰腺的原发性和转移性癌以及肺的原发性癌。正如本文中所使用的，检测可以包括定性和/或定量的检测，还可包括将检测到的水平与正常细胞相比，从而确定癌细胞中增高的ALCAM表达水平。
本发明还提供了用任何可以结合ALCAM的抗体在受试者中辅助诊断癌症(如卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌或乳癌)的方法以及可用于测定ALCAM表达水平的任何其它方法。用于本文中时，用于“辅助诊断”的方法意指这些方法在有关癌症的分类或性质的临床确定中起到辅助的作用，但就确诊来说却可以是结论性的也可以不是。因此，辅助癌症诊断的方法可包括以下步骤检测来自个体的生物学样品中ALCAM的水平和/或测定样品中ALCAM的表达水平。
按本文所公布的方法制备的抗ALCAM抗体还可用于确定已诊断为癌症患者的个体是否可以被视为是使用抗ALCAM抗体进行免疫治疗的侯选者。在一个实施方案中，可以用抗ALCAM的抗体检测恶性肿瘤或活组织检查样品中ALCAM的表达。携带表达ALCAM的癌细胞的个体是用抗ALCAM抗体进行免疫治疗的合适候选人。利用抗ALCAM抗体达到筛选免疫疗法候选人的目的的方法在进行任何形式的抗癌治疗(如化疗或放疗)之前和之后都是有用的，可用于确定哪一种肿瘤最有可能对所给出的疗法产生反应、受试者的预后、转移性疾病的肿瘤的亚型或来源、以及疾病的进展或对治疗产生的反应。
体外检测ALCAM的方法是本领域的常规技术，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、免疫荧光、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和蛋白质印迹分析。在一个实施方案中，取出含癌细胞的组织并用本领域众所周知的方法对此组织进行制备以供免疫组织化学使用，如，经固定或不经固定，在冷冻化合物中包埋、冷冻和切片；在使用或不使用各种抗原修复(antigen retrieval)和复染方法的情况下进行固定和石蜡包埋。
在另一实施方案中，用单克隆抗体2D4、mKID2或本文所述的任何其它结合ALCAM的实施方式检测非黑素瘤癌细胞中ALCAM的表达。为了简单起见，通常提及2D4或mKID2，但是可以理解这些方法适用于本文所述的任何结合ALCAM的实施方式。抗ALCAM单克隆抗体2D4和mKID2特异结合多种表达ALCAM的癌细胞类型，包括但不局限于卵巢、肺、前列腺、胰腺、结肠和乳癌细胞。在卵巢、肺、前列腺、胰腺、结肠和乳癌细胞中不是所有细胞都表达ALCAM，而其它组织中的癌细胞也可能表达ALCAM，因此应检查受试者癌细胞上是否存在ALCAM以确定免疫疗法对受试者的有用性。在一个实施方案中，可通过用抗ALCAM抗体对前列腺组织进行染色，将正常前列腺上皮细胞与前列腺癌上皮细胞区分开来。组织学上正常前列腺上皮细胞组织良好，而癌组织则具有非常不同的形态。用抗ALCAM抗体进行染色可以将癌组织与正常组织区分开来。
用标记的抗ALCAM单克隆抗体2D4筛选了一组胰腺癌细胞系。如实施例3所示，抗ALCAM抗体2D4与多种胰腺癌细胞系结合，9个胰腺癌细胞系中有8个表达ALCAM。单克隆抗体2D4与转移的和原发的胰腺癌细胞系均发生反应。
在另一实施方案中，除了单克隆抗体2D4外，还可用特异结合ALCAM的单克隆抗体筛选非黑素瘤癌细胞和组织中ALCAM的存在。
一种可用于体内检测ALCAM的技术将标记的抗ALCAM抗体引入已诊断为癌症患者的个体中。在一个实施方案中，使用抗体筛选免疫疗法候选者的方法是体内肿瘤成像，其中，将抗体与放射性或不透射线的物质连接，向个体施用抗体并用x-射线或其它成像机器来显现标记后的抗体在已知癌细胞(如，肿瘤)区域处的定位。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体是mKID2或可以与ALCAM结合的生物学等价抗体或多肽。
还可用识别此抗原的抗体(或多肽)建立诊断免疫测定法以检测活的或垂死的癌细胞向体液中释放或分泌的抗原，所说的体液包括但不局限于血液、唾液、尿液、肺液或腹水。如实施例中所进一步详述的，2D4和mKID2可与来自组织的不同阶段的各种形式癌症结合，所述组织包括但不局限于卵巢、乳房、肺、前列腺、结肠和胰腺。将本发明抗体和药剂用于诊断目的的方法在进行任何形式的抗癌治疗(如化疗或放疗)之前和之后都是有用，可用于确定哪一种肿瘤最可能对给定的疗法产生反应、病人的预后、转移性疾病的肿瘤亚型或来源以及疾病的进展或对治疗的反应。
IX.用抗ALCAM抗体进行免疫治疗的方法按本文所述方法制备的单克隆抗体2D4和其它抗ALCAM抗体(诸如人源化的或嵌合的抗体)可用于例如治疗携带了表达ALCAM的癌细胞的个体，所述癌细胞包括但不局限于卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌或乳癌细胞。治疗可以包括按如上所述在体内或体外形成抗ALCAM抗体和ALCAM的复合物。在优选的实施方案中，用抗ALCAM抗体进行的治疗可以包括按如上所述将抗ALCAM抗体与化学治疗剂或其它抗体缔合。
本发明提供了将任何本文所述组合物(包括缀合物)运送至ALCAM表达细胞，诸如表达ALCAM的癌细胞的方法。这些方法需要将本文所述组合物(包括缀合物)施用于个体。在某些实施方案中，该方法可用于，例如，将缀合物引入靶细胞。在另一实施方案中，抗ALCAM抗体(诸如人源化或嵌合形式的抗ALCAM抗体和这些抗体的各种制剂)可与化学治疗剂(诸如放射性分子、毒素，如皂草素、加利车霉素、auristatin或美登木素生物碱，或其它化学治疗分子)或含化学治疗化合物的脂质体或囊泡缀合(包括连接)并施用于个体，从而将这些化合物定向于含有被抗体所识别的抗原的癌细胞并由此消灭癌细胞。在某些实施方案中，化学治疗剂被运送入癌细胞(诸如卵巢癌细胞)。
本发明还提供了用抗ALCAM抗体或连接了化学治疗剂的可以与ALCAM结合的其它实施方式抑制前列腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰腺癌或结肠癌细胞的生长和/或增殖的方法。在某些实施方案中，所说的抗体是人源化的或嵌合形式的非人抗ALCAM抗体。
本发明还提供了用抗ALCAM抗体或连接了化学治疗剂的可与ALCAM结合的其它实施方式延迟癌症患者(包括但不局限于前列腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰腺癌或结肠癌)中转移发生的方法。在某些实施方案中，抗体是人源化的或嵌合形式的非人抗ALCAM抗体。
在另一实施方案中，为了延迟转移的发生，在手术切除表达该抗原的癌后可将所说的抗体用作辅助治疗(adjuvant therapy)。也可将所说抗体或与化学治疗剂缔合的抗体在手术前施用给具有表达该抗原的肿瘤的患者以减小肿瘤的大小，从而使手术能够进行或得以简化、在手术过程中不伤害组织和/或减少所产生的畸形。
在另一实施方案中，mKID2或本文所述任何可以结合ALCAM的实施方式可以与表达ALCAM的癌细胞结合并诱导抗表达ALCAM的癌细胞的主动免疫应答。在某些情况下，主动免疫应答可引起癌细胞的死亡(如，抗体与癌细胞的结合诱发了细胞的程序死亡)或抑制癌细胞的生长(如，阻断了细胞周期的进行)。在其它情况下，mKID2或本文所述的任何抗体可与癌细胞结合且抗体依赖性细胞毒性(ADCC)可消灭与mKID2结合的癌细胞。因此，本发明提供了刺激免疫应答的方法，包括施用本文所述任何组合物。
在某些情况中，抗体的结合还可激活细胞和体液免疫应答并募集更多的天然杀伤细胞或提高细胞因子的产量(如，IL-2、IFN-γ、IL-12、TNF-α、TNF-β等)，这样就进一步激活了个体的免疫系统以破坏癌细胞。在另一实施方案中，mKID2可与癌细胞结合，而巨噬细胞或其它吞噬细胞可调理癌细胞。
与化学治疗剂缔合(包括连接)的抗ALCAM抗体或片段(如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)的各种制剂均可以用于给药，这些制剂如嵌合抗体、单链(ScFv)、其突变体、含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体和含具所需特异性的抗原ALCAM识别位点的任何其它修饰构型的抗ALCAM抗体。在某些实施方案中，抗ALCAM抗体或其片段可不经稀释直接施用。在其它实施方案中，抗ALCAM抗体或其片段可以与药用可接受赋形剂一起施用并且可以是各种制剂形式。药用可接受赋形剂是本领域所已知的，它们是有利于药理学有效物质施用的相对惰性的材料。例如，赋形剂可以使药物成形或保持一定的稠度，或用作稀释液。合适的赋形剂包括但不局限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于变动渗透压的盐、包囊剂、缓冲液和皮肤穿透增强剂。用于肠胃外和非肠胃外药物运送的赋形剂以及制剂参阅RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott，Williams & Wilkins，Publishing。
一般的，这些药剂被配制成用于注射方式施用(如，腹膜内、静脉内、皮下、肌肉注射，等)，尽管其它给药形式(如，口服、粘膜施用，等)也可使用。因此，抗ALCAM抗体和其等价物优选与诸如盐、林各溶液、葡萄糖溶液等药物可接受赋形剂组合。具体的服药方案，即剂量、时间选择和重复用量取决于具体的个体和该个体的医疗史。一般而言，任何以下剂量均可使用施用至少约50mg/kg体重的剂量；至少约10mg/kg体重；至少约3mg/kg体重；至少约1mg/kg体重；至少约750μg/kg体重；至少约500μg/kg体重；至少约250μg/kg体重；至少约100μg/kg体重；至少约50μg/kg体重；至少约10μg/kg体重；至少约1μg/kg体重，或更多。经验性考虑因素，诸如半衰期，通常有助于给药量的确定。可以利用与人免疫系统相容的抗体，诸如人源化抗体或完全的人抗体，延长抗体的半寿期并防止抗体被宿主免疫系统攻击。在治疗过程中可以确定和调整给药频率，其基础是减少癌细胞的数目、保持癌细胞的缩小、减少癌细胞的增殖或延迟转移的发生。或者，抗ALCAM抗体的持续连续释放制剂可能是合适的。用于达到持续释放的各种制剂和装置是本领域所已知的。
在一个实施方案中，抗ALCAM抗体的给药量在已给药一次或多次的个体中可以按经验决定。可以向个体施用递增量的抗ALCAM抗体。为了评估抗ALCAM或其片段的效力，可用各种方法跟踪特定癌症的状态，诸如通过触诊或目测法直接检测肿瘤的大小；用x-射线或其它成像技术间接检测肿瘤的大小；通过直接的肿瘤活组织检查和肿瘤样品的显微镜检验评估病情的改善；检测间接的肿瘤标志(如，用于前列腺癌的PSA)；疼痛、麻痹的减轻、言语、视觉、呼吸受损或其它与肿瘤相关的其它障碍的减轻；食欲增加；或用公认的试验测量生命质量的提高或生存期的延长。对本领域技术人员显而易见的是，给药量的变化将取决于个体、癌症的类型、癌症的阶段、癌症是否已开始转移到个体的其它部位以及过去和同时使用的疗法。
其它的制剂包括本领域已知的合适递送形式，包括但不局限于，诸如脂质体之类的载体。参阅，例如，Mahato等，(1997)Pharm.Res.14853-859。脂质体制品包括但不局限于细胞转染剂、多层脂质体和单层脂质体。
在某些实施方案中，可以存在一种以上的抗体。这样的组合物可以包含对例如卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌或乳癌细胞具有反应性的一种或一种以上的抗体(可以包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的抗体)。正如本领域中常常论述的，抗体的混合物可能对治疗较宽范围的个体群特别有用。
可以用本领域的标准方法进行疾病的评估，诸如成像方法和监测适当的标记。
X.ALCAM参与新血管形成在细胞表面表达ALCAM的细胞或组织(包括成年细胞和组织以及移植的细胞和组织)在抗ALCAM抗体施用后可激活新血管形成。如实施例5中所示，将一种表达ALCAM的具有专利的人胰腺肿瘤细胞系Rav9926植入裸鼠。抗ALCAM单克隆抗体2D4的施用导致了小鼠血管在此人肿瘤中的新血管形成。在进一步的实验中，使表达ALCAM的人卵巢癌细胞系SKOV-3于肾囊下或作为皮下肿瘤进行培养。2D4的施用导致了所产生的卵巢肿瘤中新血管形成的增加。因为单克隆抗体2D4不与小鼠ALCAM结合，所以MAb 2D4与表达ALCAM的外源细胞(即，人胰腺肿瘤细胞)结合并将其激活，然后引发了血管的生长。不受理论的局限，ALCAM的活化导致促进血管产生的促血管形成分子的释放。
因此，在一个实施方案中，可以将诸如抗ALCAM抗体之类的抗ALCAM剂以有效引发组织中血管生长的量施用于个体。在一个实施方案中，所述个体已接受了组织移植且可能需要在组织移植物中形成血管。可以通过施用有效量的抗ALCAM药剂达到新血管形成的目的。
在另一实施方案中，抗ALCAM抗体可用于鉴别促血管形成分子。例如，可用抗ALCAM抗体刺激细胞产生促进新血管形成的活性。可用标准技术纯化促进新血管形成或血管生成的分子，诸如对来自呈现所说活性的细胞的细胞裂解物进行亲和层析。编码这些活性分子的多核苷酸(如，DNA或RNA)可用诸如表达克隆、差异展示和基因阵列之类的标准技术进行分离并克隆。在一个实施方案中，本发明可通过如下方式鉴别促血管形成分子用抗ALCAM抗体刺激肿瘤细胞，分级分离释放自肿瘤细胞的分子，分析各组分的血管形成活性，从而鉴别在用抗ALCAM抗体刺激后自肿瘤细胞释放的促血管形成分子。
在另一实施方案中，可将有效量的促血管形成分子施用于个体以引发组织中的血管生长。可用本领域已知的标准技术(如上文所述)制备针对促血管形成分子的抗体。在另一实施方案中，可将有效量的药剂，诸如抗已鉴别的促血管形成分子的抗体施用给个体以抑制促血管形成分子的新血管形成活性。
诸如实施例5所述的动物模型可用于筛选抑制ALCAM的新血管形成活性的一种或多种拮抗剂，如拮抗抗体。在施用候选拮抗剂，如拮抗性抗体后，监测动物模型中新血管形成的减少。新血管形成量的减少将指示候选抗体对血管生长具有抑制作用。
具有本文所述的期望特征的抗CD6抗体可用于本发明的实践中。此外，某些CD6肽和多肽片段及类似物分子也包括在本发明的范围内，优选那些与本发明的ALCAM激动剂和拮抗剂具有共同生物学活性的分子，包括但不局限于可以调节ALCAM的血管形成相关活性的那些分子。
尽管本文频繁讨论到将抗体作为本发明的候选治疗剂，但本发明的组合物也可以包括能增加或减少ALCAM介导的新血管形成的非抗体药剂。不受任何特定作用机制的限制，这些新血管形成的调制剂可直接作用于ALCAM或作用于其天然或诱导的结合配偶体。按照本发明的教导，CD6是适于用增加或减少ALCAM介导的新血管形成的药剂调节的已知结合配偶体的一个例子。可检测药剂阻断、减少、增加或以另外方式调节ALCAM与诸如抗ALCAM抗体或CD6之类结合配偶体的缔合的能力。具体而言，可以通过将含有ALCAM相互作用位点(通常采取当ALCAM存在于完整活细胞上时的天然构象)的肽与结合配偶体及待测药剂一起温育并测定待测药剂是否减少或增强结合配偶体与ALCAM肽的结合，测定该药剂调节此相互作用的能力。激动剂、拮抗物和其它调制剂是本发明所明确考虑的。
XI.含有与ALCAM结合的抗体的试剂盒本发明还提供了含有与ALCAM结合的抗体的试剂盒，用于筛选个体是否可以作为接受各种癌症免疫治疗的候选者，用于使表达ALCAM的组织形成新血管或抑制其新血管形成。因此，该试剂盒包含可与ALCAM特异结合并/或与ALCAM形成复合物的抗体(用于，例如，检测卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌或乳癌细胞)。在某些实施方案中，试剂盒包含抗体mKID2或竞争性抑制mKID2与ALCAM优先结合的抗体，它们可作为单独药剂使用或以和化学治疗剂或标记物质连接的形式使用。这些试剂盒还可以包括说明书和/或试剂，用于将该抗体或本文所述任何抗体或多肽实施方式与化学治疗剂或标记物质连接在一起。在某些情况下，抗体(如，单克隆、人的、人源化的，等等)的结合可以用于筛选个体是否可以作为免疫治疗的候选者。在另外的方面，试剂盒可用于，例如，治疗癌症患者。在某些实施方案中，用于治疗癌症患者的试剂盒包括用于将送化学治疗剂递送至癌细胞(诸如但不局限于卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌或乳癌细胞)或递送入癌细胞(诸如但不局限于卵巢癌细胞)的试剂盒。本发明的试剂盒可以适宜地进行包装，且可以任选地提供诸如缓冲液和说明书之类用于测定与ALCAM的结合的另外组分，如捕获试剂、显影试剂、标记物、反应表面、检测手段、对照样品和说明性信息。该说明书可用于任何测定抗原结合的方法，包括但不局限于本文所述的那些测定法。在某些实施方案中提供了上述试剂以便可以进行多重测定，如允许对同一个体随时间进行测定或对多个个体进行测定。适于检测抗体结合的方式都可以应用(并提供于试剂盒中)，诸如标记的抗人抗体，其中的标记物可以是酶、荧光团、化学发光材料、放射性同位素或辅酶。在其它的实施方案中，抗ALCAM抗体可以与化学治疗剂缔合作为化学疗法治疗癌症患者。
以下实施例仅供举例说明，而非对本发明的限制。
实施例实施例1前列腺癌细胞中ALCAM的蛋白质印迹分析在175cm2的培养皿上培养LNCAP细胞(前列腺癌细胞ATCC#CRL-1740或CRL-10995)至汇合。用Hank氏平衡盐溶液(HBSS+，不含碳酸氢钠或酚红；用10mM HEPES，pH7.4缓冲，来自Sigma Chemicals)洗涤汇合的细胞单层三次，然后用200μg磺基-NHS-LC-生物素(PierceEndogen)在室温对其进行生物素化30分钟。将细胞进一步用含0.1M Tris，pH7.4(Sigma Chemicals)的HBSS+洗三次并于室温下在含0.1M Tris，pH7.4的HBSS+中保温15分钟。细胞最后用HBSS+洗三次，然后冰上于裂解缓冲液(含2％Triton X-100、2mM PMSF、0.1％叠氮化钠的HBSS+、每5ml裂解缓冲液中加一片无EDTA的完全小量蛋白酶混合物(complete mini-protease cocktail)，无EDTA的完全小量蛋白酶混合物获自Roche Molecular Biochemicals，所有的其它试剂来自Sigma Chemicals)中温育5分钟进行裂解。将细胞在裂解缓冲液中刮下并收集裂解物。在4℃14000g离心1小时使裂解物澄清。澄清后的裂解物首先在4℃用5μl缀合了人IgG(1mg/ml)的CNBr 4MB琼脂糖珠子(Amersham Pharmacia)预清除2小时。移出人IgG珠子，然后将预清除的裂解物与缀合了CNBr 4MB琼脂糖珠子的单克隆抗体2D4(以1mg/ml缀合)一起在4℃保温2小时。2小时保温后移出2D4珠子。将人IgG珠子和2D4珠子都分别用1ml裂解缓冲液洗3次，，然后用HBSS+洗3次，1ml/次。洗后的珠子通过添加30μl SDS-PAGE样品缓冲液并在99℃煮沸5分钟进行洗脱。类似地，用来自AncellCorporation，Minnesota的抗ALCAM单克隆抗体克隆3A6将ALCAM从LNCAP细胞裂解物中免疫沉淀出来。样品于4-20％Novex梯度凝胶(Invitrogen)上解析，转移到0.2μm的硝酸纤维素(Invitrogen)上并用缀合了链霉亲和素的辣根过氧化物酶(HRP)(Pierce Endogen)显色或用5μg 2D4/个印迹的量进行蛋白质印迹分析。为了用缀合了链霉亲和素的HRP进行检测，首先用封闭缓冲液(5％脱脂干奶于含0.05％Tween-20的磷酸缓冲盐水(PBST)中，Sigma Chemicals)封闭硝酸纤维素膜1小时。将缀合了链霉亲和素的HRP在PBST中稀释至1μg/ml并室温接触硝酸纤维素30分钟。在用DAB底物显色前先用PBST洗硝酸纤维素膜三次。为了用2D4进行蛋白质印迹杂交，硝酸纤维素膜类似地用封闭缓冲液封闭1小时。然后将硝酸纤维素膜在含有1ml稀释于封闭缓冲液中的5μg/ml 2D4的热密封塑料袋中保温。用PBST洗硝酸纤维素膜3次，然后与1μg/ml缀合了驴抗人IgG(重链和轻链特异、交叉吸附牛、小鸡、山羊、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、兔子、绵羊血清蛋白质，Jackson Immunoreasearch，目录号709-035-149)的HRP 10ml一起室温保温1小时。最后用PBST洗硝酸纤维素膜三次，再用DAB底物呈色显现。对于用来自Santa Cruz(sc-8548和sc-8549)的多克隆抗ALCAM抗体进行的蛋白质印迹杂交而言，类似地用封闭缓冲液将硝酸纤维素膜封闭1小时。然后将硝酸纤维素膜在热密封塑料袋中保温，袋中含有按供应商说明书稀释于封闭缓冲液中的一抗1ml。用PBST洗硝酸纤维素膜3次，然后与1μg/ml缀合了驴抗山羊IgG(重链和轻链特异，Jackson Immunoreasearch，目录号705-035-147)的HRP 10ml一起室温温育1小时。最后用PBST洗硝酸纤维素膜三次，再用DAB底物呈色显现。
结果显示2D4和3A6均免疫沉淀了112kDa的生物素化细胞表面蛋白质，这是用HRP-链霉亲和素检测到的。被2D4或3A6免疫沉淀的同一蛋白质带在蛋白质印迹中也被抗ALCAM单克隆抗体2D4及sc-8548和sc-8549所识别。这些结果证实所有这些抗体都结合共同的抗原-ALCAM，ALCAM存在于前列腺癌细胞系LNCAP中。
实施例2用生物素化的抗ALCAM一抗进行组织切片中ALCAM的免疫组织化学染色用Leica CM3050切10微米厚的冰冻切片并解冻-贴(thaw-mounted)在载玻片上。将切片在室温空气干燥至少30分钟。通过将载玻片浸入乙醇(在-20℃预冷)中随后空气干燥过夜来固定切片，或用4％的多聚甲醛固定5分钟。固定后的载玻片可立即使用或保存于-80℃的冰箱中待用。为了灭活内源性的过氧化物酶活性，将载玻片在甲醇中的1％过氧化氢中室温保温30分钟。在与一抗进行保温前，将载玻片与在含0.1％Tween20的PBS中的5％山羊血清一起室温保温60分钟，以封闭非特异结合位点。
生物素化的抗ALCAM抗体制备如下已纯化的单克隆抗体用NaHCO3缓冲液，pH9.0透析过夜。加入50μl生物素标记试剂(于DMSO中的N-羟基琥珀酰亚胺生物素2mg/ml，Pierce目录号20217)并混合。将反应混合物在摇动平台上室温轻摇反应过夜，然后用PBS透析去除过量的游离生物素。混合物稀释于含5％山羊血清和0.1％Tween20的PBS中至终浓度约1μg/ml，然后以足够覆盖整个组织切片的量加到载玻片上，通常为0.5ml/片。将载玻片密封于用PBS饱和的潮湿室中于4℃保温过夜。在保温结束的时候，用PBS洗载玻片3次，5分钟/次，以去除过量的一抗。然后，将载玻片于室温于链霉亲和素-HRP溶液(Sigma，目录号S-5512，10μg/ml，于含5％山羊血清和0.1％Tween20的PBS中)中保温1小时。重复用PBS洗载玻片3次，5分钟/次，去除过量的链霉亲和素-HRP。最后，用过氧化物酶底物缓冲液，pH5.00的醋酸钠缓冲液洗载玻片2次，然后在室温下于过氧化物酶底物DAB/H2O2中显色直至达到合适的反差，通常在几分钟内。通过在水中洗去除未反应的底物以终止反应。用苏木精复染载玻片并在显微镜检查前将盖玻片放到载玻片上。在Nikon显微镜(Model E800)下检查染色结果并照相。对于表1和2中的结果，弱阳性染色记录为‘+’，中等阳性染色记录为‘2+’，强阳性染色记录为‘3+’，阴性染色记录为‘- 。表1显示抗ALCAM抗体与多种卵巢癌和前列腺癌组织的结合。1#至21#组织样品是卵巢癌细胞组织，而22#至27#样品是前列腺癌组织样品。表2显示了抗ALCAM抗体与多种正常人组织的结合。
实施例3 抗ALCAM与胰腺癌的结合用荧光激活细胞分选仪在活细胞中分析抗ALCAM单克隆抗体2D4与胰腺癌细胞系(AsPC-1(ATCC#CRL-1682)、Capan-1(ATCC#HTB-79)、CFPAC-1(ATCC#CRL-1918)、HPAF-II(ATCC#CRL-1997)、HS700T(ATCC#HTB-147)、HS766T(ATCC#HTB-134)、PANC1(ATCC#CRL-1469)、SU.86.86(ATCC#CRL-1837)和Rav9926(专利性胰腺癌细胞系))的结合。如图1中所示，在各个矩形图中，灰色填充的曲线代表荧光标记的抗人IgG Fc与各细胞系在无一抗的情况下的非特异性结合。黑色曲线显示的是与抗ALCAM抗体结合的细胞的FACS分选。黑色曲线从灰色曲线向右边的移动表明抗ALCAM抗体与相应细胞系的特异结合，因此意味着该细胞系在细胞表面表达ALCAM。所测试的9个胰腺细胞系中有8个表达ALCAM(Capan-1、CFPAC-1、HPAF-II、HS700T、HS766T、PANC1、SU-86-86和Rav9926)。
实施例4抗ALCAM与肺癌的结合用活细胞酶联免疫测定法分析抗ALCAM抗体与肺癌细胞系SK-MES-1(一种原发性鳞状细胞癌)(ATCC#HTB 58)的结合。在用组织培养液处理过的96孔组织培养板(Falcon目录号354075)中在补充了10％胎牛血清的F12/DMEM培养基中培养SK-MES-1细胞系至汇合。用组织培养基洗细胞，然后在存在或不存在10μg/ml抗ALCAM抗体(MAb2D4)的情况下室温保温于含1％BSA和0.1％叠氮化钠的Hank氏平衡盐缓冲液(HBSS)中1小时。然后用100μl/孔的HBSS洗细胞3次，之后将细胞与用HBSS稀释、浓度为0.8μg/ml、缀合了驴抗人IgG重链和轻链特异抗体的辣根过氧化物酶(HRP)50μl/孔一起室温保温30分钟。最后用HBSS洗细胞3次并在100μlTMB底物(KPL目录号50-65-00和50-76-01)中保温5分钟，添加100μl/孔的1M磷酸终止反应。读取显色后的平板在450nm波长的O.D.值。结果显示，当将对照(无MAb 2D4)的O.D.450值设为空白时，MAb 2D4产生的O.D.450值为0.356，标准误差值为0.064，表明SK-MES-1细胞在细胞表面表达ALCAM。
实施例5抗ALCAM抗体增强裸鼠体内ALCAM阳性细胞移植物中的血管形成Rav9926细胞(专利性人胰腺肿瘤细胞系)被移植至裸鼠(nu/nu)的肾囊下。让移植物生长1周。每两天一次以100mg/kg的剂量腹膜内注射ALCAM单克隆抗体克隆2D4，共3次。对照小鼠则注射赋形剂。在第10天，无痛处死动物，并检查带移植物的肾。图2显示了在对照小鼠中的细胞移植物是白色半透明的，而在注射了2D4单克隆抗体的小鼠中的细胞移植物则被密集的脉管系统所缠绕(如箭头所示)。结果显示了2D4单克隆抗体增强了组织移植物细胞中的血管生成。
因为ALCAM可呈递于内皮细胞表面，所以检测了抗ALCAM抗体添加至内皮细胞的效果。人脐静脉(目录号CC2519)、成人主动脉(目录号CC2535)和新生儿皮肤(目录号CC-2516)微血管内皮细胞获自BioWhittaker的Clonetics分部并在早期传代时进行测试。将细胞以约1500个细胞/孔的密度铺于96孔平板中并在加入或未加入50μg/ml 2D4的情况下保温4天，通过结晶紫染色并读取光密度来检查生长状况。ALCAM抗体的存在对这些内皮细胞的生长均无影响。因此可以推断用ALCAM抗体处理后在体内观察到的血管形成增加极有可能不是由于对内皮细胞生长的直接作用所致。另外的实验已显示了2D4 MAb展示了物种特异性且不与小鼠ALCAM结合。在本发明的某些实施方案中，并不局限于特定的作用机制，在体内观察到的新血管形成是由于肿瘤细胞以ALCAM抗体依赖性方式释放促血管形成物质所致，所说的释放继发引起新血管形成。
实施例6用生物素化的抗ALCAM抗体mKID2进行组织切片中ALCAM的免疫组织化学染色按实施例2描述的方法制备组织切片并用抗ALCAM抗体mKID2进行染色。抗ALCAM抗体mKID2产生自杂交瘤，该杂交瘤保藏于美国典型培养物收藏中心(ATCC)10801 University Blvd.，Manassas VA20110-2209，保藏日为2002年6月21日，专利保藏号PTA-4478。在Nikon显微镜(ModelE800)下检查染色结果并照相。对于表1和2中的结果，弱阳性染色记录为‘+’，中等阳性染色记录为‘2+’，强阳性染色记录为‘3+’，阴性染色记录为‘- 。表3显示了抗ALCAM抗体mkID2与多种结肠癌、肺癌、前列腺癌和乳癌组织的结合。
表3ALCAM在肿瘤中的分布(mKID2抗体)
+/-表示染色不明确实施例7抗ALCAM抗体和缀合了毒素的抗小鼠IgG的内在化MAb-ZAP(Advanced Targeting Systems，San Diego，CA)是缀合了皂草素的抗小鼠IgG，皂草素是一种抑制蛋白质合成的毒素。这种毒素不能透过细胞膜。如果单克隆抗体与可内在化的细胞表面抗原结合，此毒素缀合物就可以与已结合的单克隆结合而被内在化，最终杀死细胞。由于依赖于内在化来证明毒性，MAb-ZAP可用于评估是否某一给出的表面抗原可以用作任何如下毒素的合适靶子，所说的毒素依赖于内在化来表现细胞毒性作用。由此，MAb-ZAP可用作诸如美登木素生物碱和加利车霉素之类内在化依赖型毒素的模型。
为了检测抗ALCAM抗体和缀合了皂草素的抗小鼠IgG的内在化以及皂草素内在化后抑制肿瘤细胞生长的作用，在测定中使用了单克隆抗ALCAM抗体mKID2。从含10mM EDTA的储存烧瓶中取出人卵巢癌细胞SKOV3(ATCC#HTB 77)并离心。细胞以50000个/ml的密度重悬于合适的培养基中并以100μl/孔的密度铺于96孔板中。立即将mKID2抗体以10倍浓缩物形式加入合适的孔中至终浓度为10μg/ml。室温放置15分钟后以10X浓度将MAb-ZAP(目录号IT-04，Advanced Targeting Systems，SanDiego CA)加入合适的孔中至终浓度为0.001pM至104pM。培养4天后，加入MTT(贮液为5mg/ml PBS，1∶10稀释于孔中)，在37℃保温4小时。然后从各孔中除去培养基并加入100μl/孔的DMSO。将平板轻轻转动使蓝色的MTT沉淀溶解，然后在平板读数器上读取540nm处的数值。
如图3中所示，当MAb-ZAP加到高于100pM时，与缺乏mKID2的染色情况相比，存在mKID2时SKOV3细胞中的MTT染色减少了，这表明在mKID2和MAb-ZAP存在下人卵巢细胞SKOV3的生长被抑制，且mKID2和缀合了毒素的抗小鼠IgG被内在化进入SKOV3中。
在人卵巢癌细胞SKOV3中用不同的mKID2浓度进行了类似的试验。如图4中所示，在存在与10nM MAb-ZAP组合的1μg/ml、10μg/ml和20μg/ml mKID2的情况下，SKOV3细胞中的MTT染色减少。
可以理解为本文所述的实施例和实施方案只是为了达到举例说明的目的，本领域的技术人员可以根据它们提出多种修饰或改变，但这些修饰和改变也包括在本说明书的精神和范围内。为了所有的目的，此处引用的所有出版物、专利和专利申请文件均全文收编于此作为参考，就如同特异和单独地指明各个出版物、专利或专利申请文件收编作为参考一样。
权利要求
1.基本纯化的免疫球蛋白多肽或其抗原结合片段，其特异结合活化的白细胞粘附分子(ALCAM)，且具有至少一项或多项以下特征a)结合癌细胞上的ALCAM的能力；b)在体外或在体内与暴露于活细胞表面的ALCAM部分结合的能力；c)将治疗剂或可检测标记递送至表达ALCAM的癌细胞的能力；d)将治疗剂或可检测标记递送入表达ALCAM的癌细胞内的能力；e)在个体中增强血管生成的能力；和f)在个体中减弱血管生成的能力。
2.权利要求1的纯化的免疫球蛋白多肽或抗原结合片段，其中所述癌细胞选自卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、和乳癌细胞。
3.编码权利要求1的免疫球蛋白多肽或其抗原结合片段的分离的核酸序列。
4.权利要求3的核酸，其中核酸与启动子可操作连接。
5.权利要求4的核酸，其中启动子和核酸包含于表达载体中。
6.权利要求3的核酸，其中多肽是单克隆抗体。
7.用包含权利要求3的核酸的载体转染、转化、或感染的细胞系。
8.生产基本纯化的免疫球蛋白多肽或其抗原结合片段的方法，包括以下步骤a)在表达免疫球蛋白多肽或抗原结合片段的条件下培养经过权利要求3的核酸转化的细胞系；和b)收获所表达的免疫球蛋白多肽或片段。
9.权利要求8的方法，其中细胞系是杂交瘤。
10.权利要求9的方法，其中杂交瘤是ATCC NO.PTA-4478。
11.权利要求8的方法，其中免疫球蛋白多肽是单克隆抗体。
12.包含治疗有效剂量的权利要求1或15-16之任一项的纯化的免疫球蛋白或抗原结合片段以及制药学可接受载体的药物组合物。
13.包含治疗有效剂量的单克隆抗体或其抗原结合片段以及制药学可接受载体的药物组合物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异结合ALCAM，且具有至少一项或多项以下特征a)结合癌细胞上的ALCAM的能力；b)在体外或在体内与暴露于活细胞表面的ALCAM部分结合的能力；c)将治疗剂或可检测标记递送至表达ALCAM的癌细胞的能力；d)将治疗剂或可检测标记递送入表达ALCAM的癌细胞内的能力；e)在个体中增强血管生成的能力；和f)在个体中减弱血管生成的能力。
14.权利要求13的药物组合物，其中组合物包含额外的治疗性部分。
15.特异结合ALCAM并减少新血管形成的纯化的免疫球蛋白多肽或其抗原结合片段。
16.特异结合ALCAM并增强新血管形成的纯化的免疫球蛋白多肽或其抗原结合片段。
17.保藏号ATCC PTA-4478的分离的细胞系或其后代。
18.将化学治疗剂递送至癌细胞的方法，包括施用含有与化学治疗剂缔合的抗ALCAM抗体的组合物，其中癌细胞选自卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和乳癌细胞。
19.权利要求18的方法，其中将化学治疗剂施用给个体。
20.权利要求18的方法，其中抗ALCAM抗体是细胞系ATCC NO.PTA-4478或其后代表达的抗体。
21.抑制个体中癌细胞生长的方法，包括给个体施用有效量的组合物，所述组合物包含与化学治疗剂缔合的抗ALCAM抗体，其中癌细胞选自卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和乳癌细胞。
22.权利要求21的方法，其中将化学治疗剂递送到癌细胞内。
23.权利要求21的方法，其中抗ALCAM抗体是细胞系ATCC NO.PTA-4478或其后代表达的单克隆抗体。
24.检测个体中癌细胞存在与否的方法，包括将来自个体的细胞与抗ALCAM抗体接触，并检测，如果存在的话，来自细胞的ALCAM与抗体的复合物，其中癌细胞选自卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和乳癌细胞。
25.阻断ALCAM结合配偶体与ALCAM间的至少一种如下相互作用的药剂a)结合癌细胞上的ALCAM的能力；b)在体外或在体内与暴露于活细胞表面的ALCAM部分结合的能力；c)将治疗剂或可检测标记递送至表达ALCAM的癌细胞的能力；d)将治疗剂或可检测标记递送入表达ALCAM的癌细胞内的能力；e)在个体中增强血管生成的能力；和f)在个体中减弱血管生成的能力。
26.包含治疗有效剂量的依照权利要求25的药剂以及制药学可接受载体的药物组合物。
全文摘要
本发明公开了关于已知抗原ALCAM的新发现，即，ALCAM除了与正在转移的恶性黑素瘤有关外还存在于多种人类癌症中。此外还公开了通过使用抗ALCAM的抗体诊断和治疗表达ALCAM的癌症的方法。本发明还公开了用于调节ALCAM介导的新血管形成的组合物和方法。
文档编号C07K16/18GK1662254SQ03814688
公开日2005年8月31日 申请日期2003年5月2日 优先权日2002年5月3日
发明者J·P·马瑟, 李荣豪, M·C·察索, D·T·洛 申请人:雷文生物技术公司