一种结直肠癌症治疗试剂盒的制作方法

1.本发明属于医疗诊断领域，更具体地，涉及一种结直肠癌症治疗试剂盒。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer，crc)是结肠癌(colon cancer)和直肠癌(rectal cancer)的合称，它是一类高发病率和高死亡率的消化道恶性肿瘤。近年来，结直肠癌的发病率和死亡率总体上呈现出逐渐下降的趋势，但它依然是威胁人类健康的一大公共疾病。在我国，近年来直肠癌发病率比较稳定，而结肠癌的发病率上升显著，多数患者发现时已是中晚期。仔细发掘结直肠癌背后的致病因素，改进结直肠癌的预防、诊断、治疗和预后措施，是研究者们面临的一大严峻课题。
3.泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,ups)是细胞内清除错误折叠蛋白的主要降解途径。ups在降解错误折叠蛋白过程中，需首先将底物泛素化。泛素连接酶(ubiquitin ligase)e3通过特异性识别底物，介导活化的泛素从泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme)e2转移到底物活化的赖氨酸(lys)残基，是泛素化过程的关键酶之一。e3主要有hect结构域家族、ring-finger结构域家族和u-box结构域家族，其中hect家族e3自身具有延长多聚泛素化链作用。含ww结构域的e3泛素蛋白连接酶1(ww domain-containing e3 ubiquitin protein ligase 1,wwp1)是hect结构域家族中的一种e3，可以决定多聚泛素化链的连接形式，对不同的底物，进行不同形式的泛素化修饰，包括单泛素化、切s-48及切s-63多聚泛素化等。在多种疾病中的表达具有明显的上升，例如肺癌、胃癌、亨廷顿舞蹈症以及结直肠癌，降低wwp1基因的表达水平可以明显抑制癌细胞的增值与迁移能力，增加癌症细胞的凋亡，并抑制癌症组织的生长。从目前对本病与wwp1基因的研究结果来看，尚无明确的药物针对这一靶点。


技术实现要素：

4.针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种结直肠癌症治疗试剂盒，其目的在于由于明确了wwp1基因与结直肠癌症之间确切的关联关系，采用抑制wwp1蛋白表达试剂用于结直肠癌症治疗试剂的制备，由此解决目前结直肠癌症缺乏有效的临床治疗手段的技术问题。
5.为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种结直肠癌症治疗试剂盒，其包括抑制wwp1基因试剂。
6.优选地，所述结直肠癌症治疗试剂盒，其包括抑制wwp1基因蛋白表达水平的试剂。
7.更优选地，所述结直肠癌症治疗试剂盒，其所述抑制wwp1基因蛋白水平表达试剂由下列核苷酸组成：
8.si-wwp1:5
’-
gaccaaagcuuuccuugautt-3’9.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
10.本发明通过明确wwp1基因蛋白水平表达与结直肠癌症之间的关联关系，提供了一种结直肠癌症治疗试剂盒以及抑制wwp1基因蛋白水平表达试剂的应用，为结直肠癌症的治疗，提供了全新的手段。
附图说明
11.图1抑制wwp1基因蛋白水平表达试剂(siwwp1)对癌症细胞增殖能力的影响。
12.图2抑制wwp1基因蛋白水平表达试剂(siwwp1)对癌症细胞迁移能力的影响。
13.图3抑制wwp1基因蛋白水平表达试剂(siwwp1)对小鼠肿瘤生长情况的影响。
具体实施方式
14.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
15.此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
16.实施例1
17.一种结直肠癌症治疗试剂盒，包括：lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒以及抑制wwp1基因蛋白水平表达的sirna试剂：si-wwp1:5
’-
gaccaaagcuuuccuugautt-3’18.实施例2
19.细胞转染：
20.使用lipofectamine 2000作为转染试剂。以6孔板的转染为例。细胞先均匀铺到6孔板里，待长到60％-90％时进行转染。先用opti-mem培液稀释适量lipo 2000(5-7.5μl/孔)，然后静置5分钟。在5分钟里，用opti-mem稀释待转染核酸。sirna每孔用量100-200pmol，质粒用量0.5-1.0μg/孔。5分钟时间到，将稀释好的lipo 2000和核酸混匀，并静置20分钟。在20分钟快到时，从培养箱取出6孔板，吸弃其中的培液，换成2ml无血清opti-mem培液。当20分钟结束时，将包裹好核酸的lipo 2000加入6孔板，轻轻摇晃混匀。然后放入培养箱培养。自放入培养箱4-6小时，需将无血清opti-mem换成事先配好的含2％fbs的培液。
21.动物实验：
22.a、sw480细胞均匀种在100mm培养皿里；b、待细胞密度长到60-80％时，转染siwwp；c、转染48小时，用胰蛋白酶消化细胞，pbs洗两遍后用pbs重悬细胞，调整浓度为1.5x107个/ml；d、在裸小鼠balb/c
–
nu腋下植入pbs重悬的细胞，200μl/鼠。然后正常饲养小鼠；定期测量肿瘤体积；e、在第24天，当最大的肿瘤长到直径约1厘米时，断颈处死小鼠，取出肿瘤拍照并称重。结果见图3。