通过调节细胞活化状态改变体内免疫细胞的炎症状态的制作方法
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本公开提供了调节体内免疫细胞的活化状态的系统和方法。所述系统和方法可用于将支持癌症生长和转移的免疫抑制性巨噬细胞转化为高度活化的杀肿瘤性巨噬细胞。
发明背景
许多不利的生理疾患都与免疫系统活化(例如自身免疫性病症)或免疫系统抑制(例如癌症)相关。例如，巨噬细胞是大量浸润癌性组织的关键免疫效应细胞。然而，在肿瘤微环境内，巨噬细胞经历从活化的杀肿瘤状态到实际上促进肿瘤生长和转移的免疫抑制表型的转变。pollard,natrevcancer4,71-78(2004)；mantovani等人,natrevclinoncol(2017)。
认识到肿瘤微环境内免疫抑制的巨噬细胞促进癌症生长和转移，因此已经投入了很多精力来开发靶向免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞(tam)的疗法。用于解决tam的许多努力一直集中于杀伤tam以减轻肿瘤微环境中的免疫抑制。然而，通过这种方法，在肿瘤环境中，tam仅被新出现的巨噬细胞替代。此外，即使在成功杀伤一些tam时，迄今为止开发的大多数疗法仍不能充分渗透到肿瘤微环境中。尽管一些小分子药物和抗体已显示出一定的成功，但这些方法抑制了体内所有的巨噬细胞，从而诱导危险的副作用。bowman和joyce,immunotherapy6,663-666(2014)。因此，正如受癌症影响的每个人所理解的那样，迫切需要具有更少副作用的更有效的治疗策略。
技术实现要素：
本公开提供了用于调节体内免疫细胞的功能的系统和方法。在特定实施方案中，所述系统和方法用于使肿瘤相关巨噬细胞(tam)的免疫抑制性肿瘤支持状态逆转，并且将这些tam转变为高度活化的杀伤肿瘤细胞的巨噬细胞。因此，本文公开的系统和方法不仅旨在杀伤tam，而且使它们的活性从肿瘤促进转向肿瘤破坏。在特定实施方案中，所述系统和方法用作治疗剂以诱导杀伤癌细胞和/或减少或预防新的癌细胞的生长或发育。本文公开的数据表明，这些系统和方法能够完全根除并抑制卵巢癌，卵巢癌是非常难以控制的癌症类型。
本文公开的系统和方法可用于改变肿瘤中的免疫抑制状态，从而提供重构肿瘤微环境的机制。在这些实施方案中，重构的肿瘤微环境可使肿瘤对于伴随治疗，如疫苗、嵌合抗原受体(car)疗法和/或化学疗法更敏感。
重要的是，本文公开的系统和方法可在肿瘤微环境局部使用，从而无需依靠整体破坏免疫系统稳态的全身治疗。此外，已经优化了特定实施方案以成功地浸润肿瘤微环境。
特定实施方案通过利用颗粒来递送编码活化调控因子如转录因子的核苷酸来改变体内免疫细胞的活化状态。特别有用的颗粒具有正核和中性或带负电荷的表面，并且与激酶ikkβ组合递送编码转录因子干扰素调控因子5(irf5)的核苷酸。<130nm的粒度确保肿瘤浸润。此外，颗粒可包括tam靶向配体，以指导tam更选择性地吸收所述颗粒。作为一个实例，tam表达cd206，所述cd206是可通过在颗粒表面上包括甘露糖来靶向的细胞表面受体。
附图简述
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图1a、图1b.使用靶向mrna纳米颗粒将肿瘤相关巨噬细胞(tam)遗传转化为杀肿瘤性细胞的方案。(图1a)开发了可注射的纳米载体以用于递送编码m1极化转录因子的体外转录的mrna，作为出于治疗目的使tam合理地重编程而不会引起全身毒性的新方法。示出第一计划的临床应用，旨在通过重复腹膜内输注mrna纳米颗粒来治疗卵巢癌患者。(图1b)使用靶向mrna纳米颗粒将颅内tam遗传上重编程为杀肿瘤性巨噬细胞的方案。
图2a-2k.携带编码irf5和ikkβ的mrna的纳米颗粒可压印促炎性m1样表型。(图2a)用编码巨噬细胞极化的关键调控因子的mrna配制的靶向巨噬细胞的聚合物np的设计。所述颗粒由涂有pga-二-甘露糖层的pbae-mrna聚合复合物核心组成，所述pga-二-甘露糖层使颗粒靶向m2类巨噬细胞表达的甘露糖受体(cd206)。还描绘了封装在np中的合成mrna，其经工程改造以编码重编程转录因子。(图2b)np群体(比例尺200nm)和单个np(插图，比例尺50nm)的透射电子显微术。(图2c)使用nanosightns300仪器测量的np的粒度分布。(图2d)在1h暴露后显示出高骨髓源性巨噬细胞(bmdm)转染率(46％)的np。(图2e)纳米颗粒转染后24小时，通过流式细胞术测量的基因转移至骨髓源性巨噬细胞(bmdm)中的效率。(图2f)np转染的和未转染的巨噬细胞的相对存活力(通过用膜联蛋白v和pi染色评估)。n.s.：不显著。(图2g)通过qrt-pcr测量的密码子优化的irf5mrna(蓝色，左y轴)和内源性irf5mrna(黑色，右y轴)的表达动力学，对于每个时间点n＝3。(图2h)描绘用于图2i-2k中使用的bmdm的np转染方案和培养条件的时间线(图2i)与用toll样受体6激动剂mpla刺激的标签m1细胞相比，irf5/ikkβnp转染的巨噬细胞的基因表达谱。结果以火山图描绘，所述火山图示出基因表达的倍数变化的分布。指示m1标签基因。通过gsea确定irf5/ikkβnp转染的巨噬细胞与m1标签基因集之间的重叠的p值。(图2j)在il-4中培养的巨噬细胞对比在il-4中培养并用irf5/ikkβnp转染的细胞中m1标签基因表达的热图。(图2k)示出所指示基因的平均计数和s.e.m的盒形图。
图3.体外筛选干扰素调控因子(irf)家族的不同成员(结合或不结合它们的活化激酶递送)对小鼠巨噬细胞的表型的影响。将来自c57bl/6小鼠的bmdm在m-csf条件培养基中孵育，并用携带合成mrna的mrna-pbaenp转染，所述合成mrna编码(1)对照gfp，(2)鼠irf5，(3)鼠irf5和磷酸化irf5的ikkβ，(4)鼠irf8和ikkβ激酶，(5)鼠irf8k310r，其是irf8的突变体，具有lys-310至arg(k310r)转化(white等人,jbiolchem.2016年6月24日)，或(6)鼠irf7/3(5d)。这种融合蛋白包括irf-7的dna结合结构域(dbd)和组成型活性结构域(cad)以及irf3的核输出信号(nes)和irf缔合结构域(lin等人,molecularandcellularbiology.18.5,1998)。在np转染后两天，收获细胞用于tam相关巨噬细胞标志物egr2和活化的巨噬细胞标志物cd38的流式细胞术分析。基于这种体外筛选，选择共递送编码mirf5和ikkβ激酶的mrna的np用于本文所述的体外实验和治疗性体内实验的剩余部分。
图4a-4j.重复腹膜内注射将irf5和ikkβ基因递送到巨噬细胞中的mrna纳米载体使患有播散性卵巢癌的小鼠的平均存活率提高一倍以上。(图4a)时间线和给药方案。箭头指示腹膜内注射的时间。(图4b)在对照小鼠和经处理的小鼠中肿瘤生长的依序生物发光成像。(图4c)经处理的小鼠对比对照小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线(kaplan-meiersurvivalcurve)。使用对数秩检验进行统计分析。(图4d)在作为对照的携带gfpmrna的d-甘露糖包被的np的单次腹膜内剂量后48小时，测量了不同免疫细胞亚群的体内转染率的流式细胞术定量：巨噬细胞(cd45+、cd11b+、mhcii+、cd11c-、ly6c-/低、ly6g-)、单核细胞(cd45+、cd11b+、mhcii+、cd11c-、ly6c+、ly6g-)、嗜中性粒细胞(cd45+、cd11b+、mhcii+、cd11c-、ly6g+)、cd4+t细胞(cd45+、tcr-β链+、cd4+、cd8-)、cd8+t细胞(cd45+、tcr-β链+、cd4-、cd8+)以及自然杀伤细胞(cd45+、tcr-β链-、cd49b+)。(图4e)患有播散性id8卵巢癌的小鼠的腹膜中巨噬细胞表型的流式细胞术分析。用4个剂量的irf5/ikkβnp或pbs处理动物。(图4f)总结ly6c-、f4/80+和cd206+(m2样)巨噬细胞的相对百分比(左图)和绝对数量(右图)的盒形图。(图4g)ly6c-、f4/80+和cd206-(m1样)巨噬细胞的相应数量。(图4h)从pbs对照(上图)或irf5/ikkβnp处理的动物(下图；比例尺100μm)分离出的卵巢肿瘤浸润的肠系膜的代表性苏木精和曙红染色的切片。代表性恶性病变的10倍放大图在右侧显示(比例尺50μm)。(图4i)测量来自每个处理组的分离的腹膜巨噬细胞产生的细胞因子的luminex测定。通过荧光活化细胞分选分离cd11b+、f4/80+腹膜巨噬细胞，并离体培养。在24小时后，收集细胞培养上清液。在平行实验中，通过prt-pcr直接分析facs分选的cd11b+、f4/80+腹膜巨噬细胞，以确定巨噬细胞表型的四种主调控因子(serpinb2、retnla、ccl11和ccl5)的表达水平。结果总结为图4j中的盒形图。
图5a-5f.巨噬细胞编程性mrna纳米载体对于重复给药是高度生物相容的且安全的。(图5a)在腹膜内施用后巨噬细胞靶向的irf5/ikkβnp的体内生物分布。在单次注射含50μgmrna的颗粒后24小时，通过qpcr检测到np递送的(密码子优化的)mrna。(图5b)实验时间线的示意图。*最后一次剂量后二十四小时，通过co2吸入使小鼠安乐死。通过眼眶后放血将血液收集到肝素涂覆的管中，以进行血清化学分析和全血细胞计数。进行尸检用于肝、脾、胰腺、肠系膜和网膜、胃和膀胱的组织学分析。(图5c)从对照或np处理的动物分离的各种器官的代表性苏木精和曙红染色的切片。比例尺，100μm。基于比较病理学家的分析，此处示出并描述了在np处理的动物中发现的病变。每个编号图像的相关发现是：[1]细胞浸润物的离散病灶主要由与少量粒细胞混合的单核细胞组成；轻度髓外造血。[2]在一些局部广泛区域，肝细胞轻度至中度肿胀。[3]红髓内中度髓样(主要)、类红细胞和巨核细胞增生。[4]白髓的轻度低细胞性。[5]肠系膜内，存在巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞和粒细胞的中度多灶性浸润物。[6]与淋巴细胞、浆细胞和粒细胞混合的巨噬细胞的轻度至中度浸润物；腺泡轻度解离和腺泡丢失；来自腺泡细胞的酶原颗粒的轻度弥漫性损失。[7]淋巴细胞的密集聚集体与脂肪组织周围的巨噬细胞混合。[8]胃粘膜内主细胞和顶细胞轻度多灶性液泡变性。(图5d)血清化学和血细胞计数。(图5e，图5f)在单次腹膜内注射irf5/ikkβnp后4或8天血清il-6(图5e)和tnf-α(图5f)细胞因子的luminex测定测量。
图6a-6i.静脉内输注的irf5/ikkβ纳米颗粒可控制肺部的肿瘤转移。(图6a)在静脉内施用后巨噬细胞靶向的irf5/ikkβnp的体内生物分布。在单次静脉注射含50μgmrna的颗粒后24小时，通过qpcr测量密码子优化的mrna。(图6b-6h)经由尾静脉向c57bl/6患白化病的小鼠注射1×106个表达b16f10萤火虫荧光素酶的黑素瘤细胞，以建立肺转移。在7天后，将动物随机分为irf5/ikkβnp处理组、对照gfpnp组或pbs对照。(图6b)时间线和给药方案。(图6c)健康肺(左图)和b16f10肿瘤浸润的肺(右图)的共聚焦显微镜检查。浸润性巨噬细胞群体发出绿色荧光。(图6d)依序生物发光肿瘤成像。(图6e)每个处理组的卡普兰-迈耶存活曲线。ms指示中值存活期。使用对数秩检验进行统计分析，并且p<0.05被认为是显著的。(图6f)在处理2周后代表每个组的含b16f10黑素瘤转移的肺的代表性照片(上排)和显微照片。(图6g)肺肿瘤病灶的计数。(图6h)来自每个处理组的支气管肺泡灌洗液中单核细胞/巨噬细胞群体的表型表征。(图6i)抑制性和活化的巨噬细胞的相对百分比的总结。
图7a-7f.巨噬细胞重编程改善神经胶质瘤的放射疗法的效果。(图7a)在诱导后第21天rcas-pdgf-b/nestin-tv-a；ink4a/arf-/-；pten-/-转基因小鼠中在pdgfβ驱动的神经胶质瘤起始后的t2mri扫描和组织学染色。(图7b)浸润神经胶质瘤边缘的cd68+tam的共聚焦显微术。比例尺300μm。(图7c)健康脑组织对比神经胶质瘤中巨噬细胞(f4/80+，cd11b+)群体的流式细胞术分析。(图7d-7e)作为单一疗法(图7d)或与脑肿瘤放射疗法组合(图7e)接受irf5/ikkβ处理的具有已建立的神经胶质瘤的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。时间线和给药方案在顶部示出。ms，中值存活期。使用对数秩检验进行统计分析，并且p<0.05被认为是统计上显著的。(图7f)肿瘤进展的依序生物发光成像。
图8a-8e.编码人irf5/ikkβ的携带ivtmrna的纳米颗粒使人巨噬细胞高效地重编程。(图8a)用于将人thp-1单核细胞系分化成抑制性m2样巨噬细胞的时间线和培养条件。(图8b)在24孔中培养并用所指示浓度的携带人irf5/ikkβmrna对比对照gfpmrna的np转染的m2分化的thp1-lucia细胞的生物发光成像。在转染后24小时使用quanti-luc测定irf诱导的lucia荧光素酶的水平。(图8c)生物发光计数的总结。(图8d-8e)il-1β细胞因子分泌(图8d)和m1-巨噬细胞标志物cd80的表面表达(图8e)的差异。
图9.实施例1中描述的骨髓样和淋巴样免疫分型小组中使用的抗体的列表。
图10提供支持本公开的示例性序列(seqidno:1-44、110和111)。seqidno:1-44、110和111的身份描述于图11中。特别是关于seqidno:15，融合蛋白包含鼠irf7的dbd(dna结合结构域)和cad(组成型活性结构域)以及鼠irf3的nes(核输出信号)和irf缔合结构域。irf缔合结构域在n末端区域中的四个丝氨酸和一个苏氨酸残基处包括asp突变，从而赋予所述融合蛋白组成型活化和易位(linr等人(1998)同上)。特别是关于seqidno:17，鼠irf8中的sumo(小泛素样修饰因子)结合位点位于赖氨酸(k)310处。sumo2/3的结合阻止irf-8接合和活化irf8应答基因。k310残基的突变阻止sumo与irf8的结合，从而导致irf8特异性基因转录增加2-5倍(changt-h等人，thejournalofimmunology(2012)189(7):3548-3556)。
图11提供示例性蛋白质序列和编码核苷酸序列的seqidno:密匙。
具体实施方式
许多不利的生理疾患都与免疫系统活化(例如自身免疫性病症)或免疫系统抑制(例如癌症)相关。例如，巨噬细胞是大量浸润癌性组织的关键免疫效应细胞。然而，在免疫抑制性肿瘤环境中，它们经历从活化的杀肿瘤状态到免疫抑制性表型的转变，这促进肿瘤生长和转移。这些肿瘤相关的免疫抑制巨噬细胞(tam)与不良预后相关(komoharay等人，(2014)cancerscience105(1):1-8)。它们诱导血管生成、淋巴生成和基质重塑。它们还在通过分泌酶纤溶酶、upa、基质金属蛋白酶(mmp)和组织蛋白酶b来促进肿瘤侵袭和转移中起关键作用(komohara,y等人(2016)advanceddrugdeliveryreviews99:180-185；gochevav等人(2010)genesdev24:241-255；wangr等人(2011)lungcancer74:188-196)。除了介导肿瘤生长和进展外，tam还可与其他免疫细胞相互作用，并且抑制先天性和适应性抗肿瘤免疫应答。
若干小分子药物致力于通过靶向参与细胞募集或扩增的途径(即csf-1/csf-1r途径的抑制剂)(pyon；teck等人natmed19,1264-1272(2013)；tap等人nengljmed373,428-437(2015))或ccl2途径(nywening等人lancetoncol17，651-662(2016))来阻断tam前体细胞定位至肿瘤。这些方法需要重复全身暴露于大剂量的小分子药物。此外，这些药物的临床试验显示，除非将它们与细胞减灭疗法组合使用，否则反应较低。nywening等人lancetoncol17,651-662(2016)；butowski等人neurooncol18,557-564(2016)。此外，这些小分子方法不能积极地促进巨噬细胞抗肿瘤活性。
常规纳米载体如脂质体已与双膦酸盐或其他抗增殖剂一起配制，以全身性地破坏肿瘤内的巨噬细胞(即氯膦酸二钠脂质体(liposomal-clodronate))(fritz等人,frontimmunol5,587(2014))。溶瘤病毒也已用于递送sirna，以使肿瘤内的免疫逃避途径沉默，并间接促进tam的吞噬作用。(chao等人,curropinimmunol24,225-232(2012))。然而，使用这些方法破坏的巨噬细胞自然地被新出现的巨噬细胞替代，所述新出现的巨噬细胞类似地变得免疫抑制性。
已经开发出用于诱导tam的功能活化的抗体。这些方法利用抗体来靶向肿瘤内的限定抗原类型。mantovani,等人,natrevclinoncol(2017)然而，这些抗体的成功受到它们的低肿瘤渗透和不均匀分布的限制。thurber等人,advdrugdelivrev60,1421-1434(2008)。它们也没有解决缺乏由抗体靶向的抗原的肿瘤逃逸变体。
如本文所公开的，所描述的方法中没有一种直接且有效地使tam重编程来成为活化的杀肿瘤巨噬细胞。本文公开的系统和方法是显著创新的，因为它们允许tam的重编程以成为清除肿瘤的巨噬细胞，同时减少促进肿瘤的tam负担。当前，其他方法均不允许医师为了这些治疗目的合理地使tam重编程。mantovani等人,natrevclinoncol(2017)；gabrilovich和nagaraj,natrevimmunol9,162-174(2009)。这本身可在肿瘤的治疗中提供治疗益处。通过调节或重构肿瘤微环境，本公开还使肿瘤更易受其他治疗类型(如疫苗、免疫疗法(例如，car)和/或化学疗法)的影响。
特定实施方案利用颗粒来为细胞提供编码活化调控因子如转录因子(例如，干扰素调控因子(irf))和/或激酶(例如，ikkβ)的核苷酸编码基因。这些活化调控因子调控巨噬细胞极化(图1)。巨噬细胞极化是高度动态的过程，通过所述过程巨噬细胞的生理活性发生变化。如所指出的，在大多数肿瘤中，tam表现出免疫抑制表型，其可以是“m2”表型。相比之下，活化的巨噬细胞可表现出“m1”表型，其导致肿瘤细胞杀伤。本文公开的特定实施方案将促进肿瘤的tam的极化逆转为杀伤肿瘤的巨噬细胞。这种作用通过诱导炎症性细胞因子、活化其他免疫细胞和吞噬肿瘤细胞来改善肿瘤内的免疫抑制环境。
“巨噬细胞活化”是指将巨噬细胞的表型或功能(i)从失活状态改变为活化的状态；(ii)从非活化状态为活化的状态；(iii)从活化的状态改变为更活化的状态；或(iv)从失活状态改变为非活化状态的过程。失活状态是指促进肿瘤生长和转移的免疫抑制表型。非活化状态意味着巨噬细胞既不促进肿瘤生长或转移，也不促进肿瘤细胞杀伤。活化是指巨噬细胞表现出杀肿瘤活性。在特定实施方案中，活化的状态产生m1表型，如下文更全面地描述。在特定实施方案中，失活状态产生m2表型，也如下文更全面地描述。
“巨噬细胞失活”是指将巨噬细胞的表型或功能(i)从活化的状态改变为较不活化的状态；(ii)从活化的状态改变为非活化状态；(iii)从活化的状态改变为失活状态；或(iv)从非活化状态改变为失活状态的过程。在特定实施方案中，失活状态是m2。在特定实施方案中，活化的状态是m1。
在特定实施方案中，所公开的系统和方法的一个益处是患者可免于全身毒性，因为由治疗诱导的炎症仍位于治疗部位。为了实现这一益处，局部输注的颗粒靶向肿瘤环境中的tam，(2)递送选择性地对控制巨噬细胞极化的信号传导途径进行重编程的核苷酸，以及(3)通过生理途径局部可完全降解(sahin等人,natrevdrugdiscov13,759-780(2014))。
在实体瘤中实现外源性核苷酸的高表达在体内具有挑战性。在当前公开之前，基于病毒或常规纳米载体如脂质体的核苷酸递送系统受到它们在肿瘤组织内的受限扩散的限制。jain和stylianopoulos,natrevclinoncol7,653-664(2010)。为了回避此障碍，特定实施方案利用扩散性增强的纳米颗粒(np)，以使得所述np将核苷酸递送至肿瘤内的大量tam。特定实施方案利用大小＜130nm的np，所述np携带中性表面电荷。特定实施方案还可包括附着于np表面的靶向配体。例如，可将二-甘露糖附着于np表面，从而能够更选择性地靶向tam细胞表面上表达的甘露糖受体(cd206)。可靶向的其他tam细胞表面受体包括早期生长应答蛋白2(egr2)、cd163、cd23、白介素(il)27ra、clec4a、cd1a、cd1b、cd93、cd226、il13-ra1、il-4r、il-1rii型、诱饵il-1rii型、il-10r、巨噬细胞清道夫受体a和b、ym-1、ym-2、低密度受体相关蛋白1(lrp1)、il-6r、cxcr1/2和pd-l1。
在特定实施方案中，本文公开的系统和方法包括向有需要的受试者施用颗粒。所述颗粒针对存在于受试者肿瘤中的巨噬细胞，并且被设计为被巨噬细胞内在化。一旦被内化，所述颗粒便进一步递送一种或多种具有编码irf5和ikkβ的序列的核苷酸。所述一种或多种核苷酸修饰巨噬细胞以表达irf5和ikkβ。不受理论的束缚，ikkβ激酶通过磷酸化活化irf5转录因子。活化的irf5然后引起i型干扰素(ifn)基因、炎症性细胞因子(包括肿瘤坏死因子(tnf)、il-6、il-12和il-23)以及肿瘤抑制因子的表达。在已经内化了一种或多种编码irf5和ikkβ的核苷酸的m2巨噬细胞中，上述基因通过irf5作用的表达导致巨噬细胞从m2表型向m1表型的表型或功能转变，这使巨噬细胞能够杀伤或以其他方式触发肿瘤细胞的破坏，从而治疗癌症。在特定实施方案中，通过吞噬作用将颗粒内化在巨噬细胞中。在特定实施方案中，通过配体介导的内吞作用(例如cd-206介导的内吞作用)将颗粒内化在巨噬细胞中。在特定实施方案中，将包括irf5和ikkβ基因的颗粒递送至巨噬细胞可包括例如(1)结合至巨噬细胞，(2)巨噬细胞对颗粒的内在化，(3)在内化后从胞吞小泡逃逸至细胞质中，(4)释放一种或多种核苷酸，(5)可转运至巨噬细胞的细胞核中，以及(6)转录以递送用于表达irf5和ikkβ的基因。
现在，如下更详细地描述本公开的方面：(1)巨噬细胞和巨噬细胞表型；(2)用于影响巨噬细胞极化的细胞途径；(3)编码活化调控因子的核苷酸；(4)用于递送核苷酸的颗粒；(5)用于更选择性地递送核苷酸的靶向配体；(6)包括颗粒的药物组合物；(7)使用方法；以及(8)实验实施例。
(1)巨噬细胞和巨噬细胞表型。“巨噬细胞”是指免疫系统的从骨髓来源的单核细胞分化的白细胞。巨噬细胞的特征在于它们的吞噬活性和它们的抗原呈递能力。巨噬细胞是先天性和适应性免疫应答两者的关键参与者。在表型上，巨噬细胞表达表面标志物f4/80(ly71)，并且也可表达其他表面标志物，如cdllb(macl)、cdllc、cd14、cd40或cd68。
巨噬细胞通过活化t淋巴细胞在先天性和适应性免疫两者中起重要作用。在癌症中，巨噬细胞是与实体瘤相关的浸润性白细胞的主要群体之一(gordons和taylorpr(2005)naturereviewsimmunology5(12):953-964)。它们可从周围组织或通过趋化分子的分泌被肿瘤本身募集至肿瘤部位。巨噬细胞根据它们的表型以极化方式参与对肿瘤的免疫应答。“表型”在本文中用于指由于其基因型与环境的相互作用而产生的细胞的物理属性或生物化学特征，并且可包括细胞的功能。
活化th1t淋巴细胞的巨噬细胞提供炎症应答，并且通常被表示为具有m1极化的或“经典活化”的表型。处于活化的状态的巨噬细胞(即m1巨噬细胞或具有m1表型的巨噬细胞)(也称为“杀伤巨噬细胞”)抑制细胞增殖、引起组织损伤、介导对病原体的抗性并具有强杀肿瘤活性。这些巨噬细胞可增加负责抗原呈递和共刺激的介体的表达；从而促进嗜中性粒细胞向肿瘤区域的浸润，使得嗜中性粒细胞靶向的肿瘤消退。与相关的对照条件相比，抗原呈递增加也可证明m1型。在特定实施方案中，可通过m1巨噬细胞产生活性氧物质(ros)和一氧化氮(no)来证明m1表型。no具有对于保护免受病原体和异常细胞(如肿瘤细胞)而言所必需的抗增殖作用。在特定实施方案中，m1表型可通过促炎性状态来证明，所述促炎状态通过产生细胞因子如il-12来诱导th1免疫。在特定实施方案中，处于活化的状态的巨噬细胞是可吞噬病原体的经典活化的巨噬细胞。
除功能外，m1表型还可由巨噬细胞表达的表面标志物；巨噬细胞在极化时产生的因子、蛋白质或化合物；或巨噬细胞在极化时诱导的基因证明。m1极化可产生由cd80、cd86、inos、细胞因子信号传导抑制因子3(socs3)、tnfα、il-1、il-6、il-12、il-23、i型ifn、cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl5、cxcl8、cxcl9和cxcl10的表达证明的表型。在特定实施方案中，m1表型包括cd80表达的增加。在特定实施方案中，m1表型包括cd206-、mhcii+、cd11c-和cd11b+。
在另一方面，活化th2t淋巴细胞的巨噬细胞提供抗炎应答，并且通常被表示为具有“m2”表型。处于失活状态的巨噬细胞(即m2巨噬细胞或具有m2表型的巨噬细胞)(也称为“修复巨噬细胞”)参与后生动物寄生虫遏制、细胞增殖、组织修复、肿瘤进展、抗炎途径和免疫抑制。与相关对照条件相比，m2表型可减少抗原呈递并减少吞噬作用。m2表型还可通过例如精氨酸酶1(arg1(精氨酸酶活性与促增殖作用和组织修复应答相关))、il-10、tgf-β、pparγ、klf4、cd206(mrc1)、dectin-1(一种信号传导非tlr模式识别受体)、dc-sign(c型凝集素)、清道夫受体a、清道夫受体b-1、cd163(血红蛋白-触珠蛋白复合物的高亲和力清道夫受体)、趋化因子受体ccr2、cxcr1和cxcr2、ym1(几丁质酶3样3)和fizz1中的一者或多者的表达；以及趋化因子ccl17、ccl22和ccl24的分泌证明。在特定实施方案中，处于失活状态的巨噬细胞促进转移和/或对化学疗法的抗性。在特定实施方案中，m2表型包括cd206+、mhcii-、cd11c+和cd11b低。
表1提供可用于区分m1表型与m2表型(包括指定为m2a、m2b、m2c和m2d的子表型)的标准的特定组合。
表1.用于对巨噬细胞表型进行分类的示例性标准。
改编自
用于评估巨噬细胞表型的分析可利用m1或m2表型特有的不同分子标签。m1巨噬细胞的普遍接受的标志物谱是cd80+，而m2巨噬细胞可被表征为cd163+。因此，可进行流式细胞术以评估这些标志物。也可通过测量il-12/il-10比率或cd163-/cd163+巨噬细胞比率的增加来评估将巨噬细胞驱动朝向m1类型且远离m2类型。在特定实施方案中，可通过光学显微术来评估m1对比m2形态。在特定实施方案中，吞噬作用测定可与其他测定结合使用以评估巨噬细胞是m1型还是m2表型。可通过将待吞噬的实体与巨噬细胞以与其每个细胞的标准化总表面积一致的浓度孵育来进行不同巨噬细胞群体的吞噬作用测定。可将待吞噬的实体添加至巨噬细胞培养物。待吞噬的实体可例如用荧光标记进行标记。吞噬作用指数可通过每个巨噬细胞测量的中值总荧光强度来确定。吞噬作用的定量可通过例如流式细胞术进行。也可使用肿瘤细胞杀伤测定。在特定实施方案中，m1表型包括标签m2巨噬细胞基因的表达降低，所述标签m2巨噬细胞基因包括serpinb2(尿激酶型纤溶酶原活化因子的抑制剂)、ccl2(c-c基序趋化因子配体2)、ccl11(c-c基序趋化因子配体11)和retnla(抵抗素样α；fizz1)。在特定实施方案中，m1表型包括m1分化基因(包括ccl5(c-c基序趋化因子配体5))的表达增加。
基因表达(例如，cd80、cd86和/或上述其他基因的m1表达)可通过熟练的技术人员众所周知的测定来测量。用于测量基因表达的方法包括nanostring
(2)影响巨噬细胞极化的细胞途径。巨噬细胞朝向活化或失活表型的极化由巨噬细胞与许多不同分子或环境的相互作用引起。例如，m1巨噬细胞极化由包括toll样受体(tlr)配体(例如脂多糖(lps)、鼠李二肽、脂磷壁酸、咪喹莫特、cpg)、ifnγ、tnfα和巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)的刺激物触发。m2极化的巨噬细胞可根据引发极化的刺激物分为子集：m2a亚型由il-4、il-13或真菌和蠕虫感染引起；m2b由il-1受体配体、免疫复合物和lps引起；m2c由il-10、tgf-β和糖皮质激素引起；并且m2d由il-6和腺苷引起。il-21、gm-csf、补体组分和凋亡细胞也可触发m2巨噬细胞极化。巨噬细胞极化也受到局部微环境条件如缺氧的调节。
前述分子和环境通过触发涉及转录因子的不同细胞内信号传导途径来影响巨噬细胞极化。参与m1和m2极化的转录因子包括irf、信号转导子和转录活化因子(stat)、socs3蛋白以及活化的b细胞的核因子κ轻链增强子(nfκb)。丝裂原活化的蛋白激酶(mapk)在将巨噬细胞功能导向m1或m2表型中也起作用。
通过诸如如上所述的ifn和tlr信号传导等的刺激物活化的irf/stat途径使巨噬细胞经由stat1极化至m1活化状态。另一方面，诸如il-4和il-13的刺激物经由stat6使巨噬细胞偏向m2活化状态(sicaa和brontev(2007)jclininvest117:1155-1166)。这些信号传导事件因此导致促进炎症性免疫应答和杀肿瘤活性(如在m1巨噬细胞极化的情况下)或促进免疫抑制性肿瘤应答(如在m2巨噬细胞极化的情况下)。
牵涉于m1表型的诱导中的一些细胞内分子包括g蛋白偶联受体p2y(2)r，它在经由nos2诱导no方面发挥作用(eunsy等人(2014)intimmunopharmacol18:270-276)；socs3，其活化nfκb/pi-3激酶途径以产生no(arnoldce等人(2014)immunology141:96-110)；以及生长和分化因子活化素a，其促进m1标志物并下调il-10(sierra-filardie等人(2011)blood117:5092-5101)。
参与诱导m1表型的其他细胞内分子包括irf。irf是一组具有多种作用的转录因子，包括病毒介导的ifn活化、细胞生长、分化、细胞凋亡和免疫系统活性的调节。irf家族的成员的特征在于含有色氨酸(w)重复序列的保守n-末端dna结合结构域。
irf5是具有螺旋-转角-螺旋dna结合基序并介导病毒和ifn诱导的信号传导途径的转录因子。它充当控制巨噬细胞是将促进还是抑制炎症的分子开关。irf5活化i型ifn基因、炎症性细胞因子，包括tnf、il-6、il-12和il-23，和肿瘤抑制因子以及th1和th17应答。它由位于染色体7q32的人irf5基因(omimid607218)编码。应当了解，存在irf5的若干同种型/转录变体。在特定实施方案中，人irf5的同种型包括同种型1(uniprot登录号q13568-1，seqidno:1)，同种型2(uniprot登录号q13568-2，seqidno:2)，同种型3(uniprot登录号q13568-3,，seqidno:3)，同种型4(uniprot登录号q13568-4，seqidno:4)，同种型5(uniprot登录号q13568-5，seqidno:5)和同种型6(uniprot登录号q13568-6，seqidno:6)。在特定实施方案中，人irf5的同种型包括由seqidno:23中所示的核苷酸序列编码的同种型1，由seqidno:24中所示的核苷酸序列编码的同种型2，由seqidno:25中所示的核苷酸序列编码的同种型3，由seqidno:26中所示的核苷酸序列编码的同种型4，由seqidno:27中所示的核苷酸序列编码的同种型5，以及由seqidno:28中所示的核苷酸序列编码的同种型6。在特定实施方案中，鼠irf5包括seqidno:7中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，鼠irf5由seqidno:29中所示的核苷酸序列编码。已显示m1巨噬细胞上调irf5。
irf1和irf8在骨髓样细胞的发育和功能中也起关键作用，包括通过促炎性信号(如ifn-γ)活化巨噬细胞。drorn等人(2007)molimmunol.44(4):338-346。在特定实施方案中，人irf1包括seqidno:8中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，人irf1由seqidno:30中所示的核苷酸序列编码。在特定实施方案中，鼠irf1包括seqidno:12中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，鼠irf1由seqidno:34中所示的核苷酸序列编码。在特定实施方案中，人irf8包括seqidno:11中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，人irf8由seqidno:33中所示的核苷酸序列编码。在特定实施方案中，鼠irf8包括seqidno:16中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，鼠irf8由seqidno:38中所示的核苷酸序列编码。
irf3是irf1和irf2的同源物。它含有若干功能结构域，包括nes、dbd、c-末端irf缔合结构域和若干调控性磷酸化位点。发现irf3呈无活性的细胞质形式，其在丝氨酸/苏氨酸磷酸化后与creb结合蛋白(一种转录共活化因子)形成复合物。这种复合物易位至细胞核并活化ifn-α和-β以及其他干扰素诱导的基因的转录。在特定实施方案中，人irf3的同种型包括同种型1(uniprot登录号q14653-1)、同种型2(uniprot登录号q14653-2)、同种型3(uniprot登录号q14653-3)、同种型4(uniprot登录号q14653-4)和同种型5(uniprot登录号q14653-5)。在特定实施方案中，人irf3同种型1包括seqidno:9中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，人irf3同种型1由seqidno:31中所示的核苷酸序列编码。在特定实施方案中，鼠irf3包括seqidno:13中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，鼠irf3由seqidno:35中所示的核苷酸序列编码。
已经显示irf7在i型ifn基因的转录活化中起作用。在特定实施方案中，人irf7的同种型包括同种型a(uniprot登录号q92985-1)、同种型b(uniprot登录号q92985-2)、同种型c(uniprot登录号q92985-3)和同种型d(uniprot登录号q92985-4)。在特定实施方案中，人irf7同种型a包括seqidno:10中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，人irf7同种型a由seqidno:32中所示的核苷酸序列编码。在特定实施方案中，鼠irf7包括seqidno:14中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，鼠irf7由seqidno:36中所示的核苷酸序列编码。
也可使用有助于irf活化的一种或多种irf突变体。例如：irf5的人变体3/变体4的拟磷酸突变体(同种型4，seqidno:4)，其用模拟磷酸化的残基(如天冬氨酸残基)取代氨基酸残基s425、s427、s430、s436(chenw等人(2008)natstructmolbiol.15(11):1213–1220)；irf5的人变体5的拟磷酸突变体(同种型2，seqidno:2)，其用模拟磷酸化的残基(如天冬氨酸残基)取代氨基酸残基t10、s158、s309、s317、s451和/或s462(changforemanh-c等人下文)；irf5同种型a(变体1，同种型3，seqidno:3)和同种型b(变体2，同种型1，seqidno:1)残基s156、s158和t160突变为模拟磷酸化的残基，如天冬氨酸残基，用于irf5的组成型核聚集(linr等人(2005)jbiolchem280(4):3088-3095)；以及irf3拟磷酸酶突变体，其用模拟磷酸化的残基如天冬氨酸取代irf3的氨基酸残基s396(chenw等人，见下文)。在特定实施方案中，鼠irf7/irf3的融合蛋白在irf3缔合结构域中的四个丝氨酸和一个苏氨酸残基处包括asp(d)突变(seqidno:15)，从而赋予融合蛋白的组成型活化和易位(linr等人(1998)，见上文；lin等人(2000)molecularandcellularbiology20:6342-6353)。在特定实施方案中，在irf3缔合结构域中的四个丝氨酸和一个苏氨酸残基处包括d突变的鼠irf7/irf3的融合蛋白由seqidno:37中所示的核苷酸序列编码。在特定实施方案中，鼠irf8突变体包括在氨基酸残基310的赖氨酸(k)被精氨酸(r)取代(seqidno:17)。在特定实施方案中，包括在氨基酸残基310处的k被r取代的鼠irf8突变体由seqidno:39中所示的核苷酸序列编码。主要在k310与irf8结合的小泛素样修饰因子(sumo)抑制irf8应答基因的活化。sentrin特异性蛋白酶1(senp1)靶向sumo2/3。senp1的活性使irf8(和其他蛋白质)“脱sumo化”，并且导致irf8从m1巨噬细胞分化的阻遏因子变成活化因子(直接和通过反式活化活性)。通过k310残基的突变防止sumo与irf8的结合使irf8特异性基因转录增加2-5倍(参见changt-h等人(2012)，见上文)。
本公开的特定实施方案包括工程改造的irf转录因子。在特定实施方案中，工程改造的irf转录因子包括缺乏功能性自抑制结构域的irf，并且因此对反馈失活不敏感(thompson等人(2018)frontimmunol9:2622)。例如，可通过缺失人irf5蛋白的aa489-539来获得活性增加2至3倍的人irf5(barnes等人(2002)molcellbiol22:5721-5740)。在特定实施方案中，在治疗自身免疫性疾病的情况下，irf4的自抑制结构域(一种促进m2表型的转录因子)可缺失或突变以产生更具活性的irf4。在特定实施方案中，在irf蛋白的羧基末端发现irf的自抑制结构域。在特定实施方案中，工程改造的irf转录因子包括缺乏一个或多个功能性核输出信号(nes)以将irf截留在细胞核中并因此增强转录的irf。例如，可通过用丙氨酸取代两个亮氨酸残基(l157a/l159a)来使人irf5的nes突变而实现人irf5的核聚集(lin等人(2000)molecularandcellularbiology20:6342-6353)。在特定实施方案中，工程改造的irf转录因子包括一种或多种irf的融合物、一种或多种irf的片段的融合物以及突变的irf的融合物。
nfκb也是与巨噬细胞m1活化有关的关键转录因子。nfκb调控大量炎症基因，包括tnfα、il1b、环氧合酶2(cox-2)、il-6和il12p40的表达。经由活化κb激酶(ikk)三聚体复合物(两种激酶ikkα、ikkβ和调控蛋白ikkγ)的抑制剂来调节nfκb活性。当上游信号在ikk复合物处汇聚时，它们首先经由磷酸化活化ikkβ激酶，并且活化的ikkβ进一步磷酸化抑制性分子，即κb(i-κb)的抑制剂。这导致i-κb的蛋白酶体降解和从nfκb/i-κb复合物释放nfκbp65/p50异二聚体。nfκbp65/p50异二聚体然后易位至细胞核，并与炎症基因的启动子结合。
ikkβ是nfκb以及其他转录因子(如irf5)的活化激酶。ikkβ类似地磷酸化若干其他信号传导途径组分，包括foxo3、ncoa3、bcl10、irs1、nemo/ikbkg、nfκb亚基rela和nfkb1以及ikk有关的激酶tbk1和ikbke。在特定实施方案中，人ikkβ的同种型包括同种型1(uniprot登录号o14920-1，seqidno:18)、同种型2(uniprot登录号o14920-2seqidno:19)、同种型3(uniprot登录号o14920-3seqidno:20)和同种型4(uniprot登录号o14920-4seqidno:21)。在特定实施方案中，人ikkβ的同种型包括由seqidno:40中所示的核苷酸序列编码的同种型1、由seqidno:41中所示的核苷酸序列编码的同种型2、由seqidno:42中所示的核苷酸序列编码的同种型3以及由seqidno:43中所示核苷酸序列编码的同种型4。在特定实施方案中，鼠ikkβ包括seqidno:22中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，鼠ikkβ由seqidno:44中所示的核苷酸序列编码。
本公开提供irf转录因子与一种或多种分子的共表达，所述一种或多种分子可活化irf以实现tam重编程为活化的状态以杀伤肿瘤。在特定实施方案中，共表达策略包括：irf5和ikkβ的共表达；irf5和tank结合激酶1(tbk-1)、tnf受体相关因子6(traf6)衔接子、受体相互作用蛋白2(rip2)激酶和/或nfκb激酶-ε(ikkε)的共表达(changforemanh-c等人(2012)plosone7(3):e33098)；irf5和蛋白激酶dna-pk的共表达(ryzhakovg等人(2015)jofinterferon&cytokineres35(2):71-78)；irf5和蛋白激酶酪氨酸激酶bcr-abl的共表达(massimom等人(2014)carcinogenesis35(5):1132–1143)；以及irf5或irf8与cop9信号体的一种或多种组分的共表达(korczeniewskaj等人(2013)molcellbiol33(6):1124–1138；cohenh等人(2000)jbiolchem275(50):39081–39089)。
在特定实施方案中，本公开的教义可应用于由超免疫活化触发的疾患(例如自身免疫性疾病)的管理。巨噬细胞在诸如全身性红斑狼疮、多发性硬化症、类风湿性关节炎和薛格连氏综合征(
牵涉于m2表型的诱导中的活化调控因子是krüppel样因子4(klf-4)。klf-4与stat6协同作用以诱导m2基因，如arg-1、cd206(mrc1，甘露糖受体)、fizz1(抵抗素样α)和过氧化物酶体增殖物活化受体γ(pparγ)，并且抑制m1基因，如tnfα、cox-2、ccl5和inos。已显示核受体pparγ调控参与氧化代谢和m2表型的活化的基因(odegaardji等人(2007)nature447:1116-1120)。
细胞因子il-21通过降低nos2表达和增加stat3磷酸化来介导m2极化(lisn等人(2013)mediatorsinflamm2013,548073)。
irf4以myd88独立性方式负调控tlr信号传导，以驱动m2表型(satoht等人(2010)natimmunol11,936-944)。在特定实施方案中，人irf4是uniprot登录号q15306。bmp-7还经由活化smad-pi3k-akt-mtor途径在体外诱导m2极化(rocherc等人(2013)plosone8:e84009)。
转录因子糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链(gilz)。gilz是在多种细胞类型中介导糖皮质激素(gc)作用的地塞米松诱导型基因，并且它可诱导抑制性m2巨噬细胞表型。gilz表达通过gc快速且普遍地诱导，并且蛋白质产物与已知的转录因子(如nf-κb、raf-1、torc2、ap-1、ras和c/ebp)相互作用，从而抑制促炎性基因的表达。因此，gilz可模拟gc的治疗性抗炎作用，同时避免害作用(ronchetti,s.等人frontendocrinol(lausanne)2015；6:170)。在特定实施方案中，gilz是具有seqidno:110中所示的氨基酸序列的人gilz。在特定实施方案中，gilz是由seqidno:111中所示的核苷酸序列编码的人gilz。
如所示，缺氧也通过缺氧诱导型因子hif-1α和hif-2α影响巨噬细胞极化。hif-1α调控nos2表达并支持m1表型的出现，而hif-2α调控arg1表达并支持m2表型的出现(takedan等人(2010)genesdev24:491-501)。
表2.参与巨噬细胞极化的信号传导分子和基因。
改编自sicaa和mantovania2012(见上文)以及chávez-galánl等人(2015)frontimmunol6,253。arg-1，精氨酸酶-1；fizz1，抵抗素样分子-α(retnl-alpha)；stat，信号转导子和转录活化子因子；irf，干扰素调控因子；socs3，细胞因子信号传导抑制因子3；btk，布鲁顿酪氨酸激酶；hif-1α，缺氧诱导因子1；klf-4，krüppel样因子4；tnfα，肿瘤坏死因子-α；bmp-7，骨形态发生蛋白7；p2y(2)r，p2y嘌呤受体2；pparγ，过氧化物酶体增殖物活化受体γ；nfκb，核因子κb；fabp4，脂肪酸结合蛋白4；lxrα；肝x受体α。
(3)核苷酸。在当前公开内容内，编码调控活化状态的基因的核苷酸被递送至免疫细胞。“基因”是指编码活化调控因子的核苷酸序列。此定义包括各种序列多态性、突变和/或序列变体，其中此类改变不影响活化调控因子的功能。术语“基因”不仅可包括编码序列，而且包括调控区，如启动子、增强子和终止区。所述术语还可包括从mrna转录物剪接的所有内含子和其他dna序列，连同由可变剪接位点产生的变体。编码活化调控因子的核苷酸序列可以是指导所述活化调控因子的表达的rna。这些核苷酸序列包括在特定实施方案中翻译成蛋白质的rna序列。在特定实施方案中，本领域普通技术人员可了解，包括胸腺嘧啶(t)碱基的dna序列可等效于除了t碱基被尿嘧啶(u)碱基替代外具有相同序列的mrna序列。核苷酸序列包括全长核苷酸序列以及源自全长蛋白质的非全长序列两者。所述序列还可包括天然序列的简并密码子或可被引入以在特定免疫细胞中提供密码子偏好的序列。编码本文所述的活化调控因子的基因序列可在公开可获得的数据库和出版物中获得。“编码”是指核苷酸序列如质粒、基因、cdna、mrna充当合成活化调控因子的模板的性质。
在特定实施方案中，核苷酸包括合成mrna。在特定实施方案中，使用5'-加帽对合成mrna进行工程改造以增加细胞内稳定性。可使用多个不同的5'-帽结构来生成合成mrna分子的5'-帽。例如，抗反向帽类似物(arca)帽含有5'-5'-三磷酸鸟嘌呤-鸟嘌呤连键，其中一个鸟嘌呤含有n7甲基以及3'-o-甲基。合成mrna分子也可使用负责产生5'-帽结构的酶在转录后加帽。例如，重组牛痘病毒加帽酶和重组2'-o-甲基转移酶可在mrna的最5'-端核苷酸与鸟嘌呤核苷酸(其中鸟嘌呤含有n7甲基化)之间建立规范的5'-5'-三磷酸连键，并且最终的5'-核苷酸含有2'-o-甲基，从而生成帽1结构。这使得帽具有更高的翻译能力和细胞稳定性以及减少的细胞促炎性细胞因子活化。
在特定实施方案中，合成mrna用于降低免疫原性、促进mrna稳定性和/或促进mrna翻译的其他修饰可包括5'-和3'-末端非翻译区(utr)、5'utr中的kozak翻译起始序列、经修饰的核糖核苷和/或polya尾。在特定实施方案中，经修饰的核糖核苷可包括假尿苷(ψ)、5-甲基胞苷(5mc)、n6-甲基腺苷(m6a)、2-硫尿苷(2su)、5-甲氧基尿苷(5mou)和n-1-甲基假尿苷(m1ψ)。在特定实施方案中，utr可包括α-和/或β-珠蛋白utr。产生合成mrna的特定实施方案包括通过从相应dna质粒pcr扩增来产生dna模板，所述dna模板含有带5't100-250突出端的所需蛋白质的编码dna序列。然后可将所述dna模板用于通过体外转录反应产生mrna。在体外转录过程中，可并入5'帽结构(例如arca)、经修饰的核糖核苷和/或3'poly(a)尾。许多体外转录系统可商购，包括例如megascriptt7转录试剂盒(thermofisherscientific,waltham,ma)、riboprobetm系统t7(promega,madison,wi)、ampliscribetmt7高产率转录试剂盒(epicentre,madison,wi)和hiscribetmt7体外转录试剂盒(newenglandbiolabs,ipswich,ma)。在特定实施方案中，合成mrna可由合成核酸的公司(例如，trilinkbiotechnologies,sandiego,ca)合成。
合成mrna或其他核苷酸可制成环状。可使此类核苷酸环化或连环化(concatemerized)，以产生有翻译能力的分子来帮助poly-a结合蛋白与5’端结合蛋白之间的相互作用。环化或连环化的机制可通过至少3种不同的途径发生：1)化学，2)酶，或3)核酶催化。新形成的5’-/3’-连键可以是分子内或分子间的。
在第一途径中，核苷酸的5’端和3’端可含有当靠近时在分子的5’端与3’端之间形成新的共价连键的化学反应性基团。5’端可含有nhs-酯反应性基团并且3’端可含有3’-氨基封端的核苷酸，以使得在有机溶剂中核苷酸分子的3’端上的3’-氨基封端的核苷酸将经历5’-nhs-酯部分上的亲核攻击，从而形成新的5’-/3’-酰胺键。
在第二途径中，t4rna连接酶可用于将5’-磷酸化的核苷酸分子酶连接至核酸的3’-羟基，从而形成新的磷酸二酯连键。在示例反应中，可根据制造商的方案将1μg核酸分子与1-10单位的t4rna连接酶(newenglandbiolabs,ipswich,ma)一起在37℃下孵育1小时。连接反应可在存在能够与并列的5′-和3′-区两者碱基配对以帮助酶连接反应的分离寡核苷酸的情况下发生。
在第三途径中，cdna模板的5’-或3’-端编码连接酶核酶序列，以使得在体外转录过程中，所得核苷酸分子可含有能够将核酸分子的5’端连接至核酸分子的3’端的活性核酶序列。连接酶核酶可源自i组内含子、丁型肝炎病毒、发夹状核酶或可通过selex(指数富集的配体系统进化技术)选择。核酶连接酶反应可在0℃与37℃之间的温度下进行1至24小时。
在特定实施方案中，核苷酸包括质粒、cdna或mrna，所述质粒、cdna或mrna可包括例如用于表达活化调控因子的序列(例如基因)。合适的质粒包括可用于将基因转移至淋巴细胞的标准质粒载体和小环质粒。核苷酸(例如小环质粒)还可包括任何另外的序列信息，以促进在经修饰的细胞中的瞬时表达。例如，核苷酸可包括启动子，如通用启动子、组织特异性启动子、细胞特异性启动子和/或对细胞质具有特异性的启动子。如所指示的，启动子和质粒(例如小环质粒)在本领域中通常是众所周知的，并且可使用常规技术来制备。
在特定实施方案中，将编码irf的核苷酸与编码其他irf的一种或多种另外的核苷酸组合使用。在特定实施方案中，将编码irf的核苷酸与编码其他irf的一种或多种另外的核苷酸以及与编码ikkβ的核苷酸组合使用。在特定实施方案中，编码irf的核苷酸与编码ikkβ的核苷酸以0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1或5:1的比例组合使用。在特定实施方案中，编码irf的核苷酸与编码ikkβ的核苷酸以3:1的比例组合使用。
特定实施方案可在基因编辑系统内递送核苷酸。基因编辑系统修改或影响细胞内源性基因组的特定序列。基因编辑系统可用于靶向基因组编辑，例如基因破坏、通过同源重组进行的基因编辑以及将治疗性基因插入人基因组的适当染色体靶位点的基因疗法。
特定实施方案利用转录活化因子样效应子核酸酶(talen)作为基因编辑系统。talen是指包括转录活化因子样效应子(tale)dna结合蛋白和dna裂解结构域的融合蛋白。talen通过在dna中诱导双链断裂(dsb)来编辑基因和基因组，从而诱导细胞中的修复机制。一般来说，两个talen必须结合并侧接在靶dna位点的每一侧，以使dna裂解结构域二聚化并诱导dsb。dsb通过非同源末端连接(nhej)或通过与外源性双链供体dna片段的同源重组(hr)在细胞中进行修复。
如所指示，talen已被工程改造以结合例如内源性基因组的靶序列，并在所述靶序列的位置切割dna。talen的tale是由黄杆菌属细菌分泌的dna结合蛋白。tale的dna结合结构域包括高度保守的33或34个氨基酸的重复序列，每个重复序列的第12和13位具有不同的残基。这两个位置(称为重复可变双残基(rvd))显示出与特定核苷酸识别的强相关性。因此，可通过改变rvd中的氨基酸且并入非常规rvd氨基酸来改善靶向特异性。
可用于talen融合体中的dna裂解结构域的实例是野生型和变体foki核酸内切酶。foki结构域起着二聚体的作用，从而对于靶序列上的位点需要两种具有独特dna结合结构域的构建体。foki裂解结构域在分离两个反向半位点的五或六个碱基对的间隔序列内裂解。
特定实施方案利用megatal作为基因编辑系统。megatal具有单链稀有裂解核酸酶结构，其中tale与大范围核酸酶的dna裂解结构域融合。大范围核酸酶(也称为归巢核酸内切酶)是在同一结构域中具有dna识别和核酸酶功能两者的单肽链。与talen相比，megatal仅需要递送单一肽链来获得功能活性。
特定实施方案利用锌指核酸酶(zfn)作为基因编辑系统。zfn是一类被工程改造以在特定位置结合并裂解dna的位点特异性核酸酶。zfn用于在dna序列的特定位点引入dsb，这使得zfn能够靶向多种不同细胞中的基因组内的独特序列。此外，在双链断裂之后，发生同源重组或非同源末端连接以修复dsb，从而能够进行基因组编辑。
通过将锌指dna结合结构域融合至dna裂解结构域来合成zfn。dna结合结构域包括三至六种为转录因子的锌指蛋白。dna裂解结构域包括例如foki核酸内切酶的催化结构域。
向导rna可例如与诸如crispr-cas系统的基因编辑系统一起使用。crispr-cas系统包括crispr重复序列和一组crispr相关基因(cas)。
一般来说，在本公开内可使用能够引起递送的核苷酸的功能性表达的任何系统。然而，在特定实施方案中，排除了利用病毒载体的递送。
(4)颗粒。本文公开的系统和方法中使用的颗粒可起到缩合和保护核苷酸免受酶促降解的作用。为此目的在颗粒内使用的特别有用的材料包括带正电荷的脂质和/或聚合物，包括聚(β-氨基酯)(pbae)。
带正电荷的脂质的实例包括磷脂酸与氨基醇的酯，如二棕榈酰基磷脂酸或二硬脂酰基磷脂酸与羟基乙二胺的酯。带正电荷的脂质的更具体实例包括3β-[n--(n',n'-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基)胆固醇(dc-chol)；n,n'-二甲基-n,n'-二辛酰基溴化铵(ddab)；n,n'-二甲基-n,n'-二辛酰基氯化铵(ddac)；1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基氯化铵(dori)；1,2-二油酰基氧基-3-[三甲基铵基]-丙烷(dotap)；n-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)；二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)；1,2-双十八烷基氧基-3-[三甲基铵基]-丙烷(dstap)；以及在例如martin等人,currentpharmaceuticaldesign2005,11,375-394中描述的阳离子脂质。
可在本公开的颗粒内使用的带正电荷的聚合物的实例包括多胺；聚有机胺(例如，聚乙烯亚胺(pei)、聚乙烯亚胺纤维素)；聚(酰胺基胺)(pamam)；聚氨基酸(例如，聚赖氨酸(pll)、聚精氨酸)；多糖(例如，纤维素、葡聚糖、deae葡聚糖、淀粉)；精胺、亚精胺、聚(乙烯基苄基三烷基铵)、聚(4-乙烯基-n-烷基-吡啶鎓)、聚(丙烯酰基-三烷基铵)和tat蛋白。
也可使用任何浓度和任何比例的脂质与聚合物的混合物。使用各种等级以不同比例共混不同聚合物类型可导致从每种贡献聚合物中借用的特征。也可采用各种末端基团化学。
本文公开的特定实施方案还可利用由能够形成多孔网络的任何材料构造的多孔颗粒。示例性材料包括金属、过渡金属和准金属。示例性的金属、过渡金属和准金属包括锂、镁、锌、铝和二氧化硅。在特定实施方案中，多孔颗粒包括二氧化硅。介孔二氧化硅的超高表面积(超过1,000m2/g)使核苷酸负载水平能够超过常规dna载体(如脂质体)。
颗粒可以各种不同的形状形成，所述性状包括球形、立方形、锥形、椭圆形、圆柱形、螺旋管形等。核苷酸可以各种方式包括在颗粒的孔中。例如，核苷酸可被包封在多孔颗粒中。在其他方面，核苷酸可与多孔颗粒的表面或表面附近紧密缔合(例如，共价和/或非共价)。在特定实施方案中，核苷酸可并入多孔颗粒中，例如整合在多孔颗粒的材料中。例如，可将核苷酸并入聚合物颗粒的聚合物基质中。
在特定实施方案中，本文公开的颗粒包括包衣。包衣可用来屏蔽包封的核苷酸和/或减少或防止脱靶结合。通过将颗粒的表面电荷降低至中性或负性来减少或防止脱靶结合。如本文其他地方更详细地公开的，包衣可包括基于中性或带负电的聚合物和/或脂质体的包衣。在特定实施方案中，包衣是亲水性和/或带中性电荷的亲水性聚合物的致密表面包衣，其足以防止所包封的核苷酸在释放到免疫细胞中之前暴露于环境。在特定实施方案中，所述包衣覆盖颗粒表面的至少80％或至少90％。在特定实施方案中，包衣包括聚谷氨酸(pga)。在特定实施方案中，pga可充当将靶向配体连接至颗粒的接头。在特定实施方案中，pga可充当将二-甘露糖连接至颗粒的接头。在特定实施方案中，包衣包括透明质酸。
可在本公开的实施方案中用作包衣的带中性电荷的聚合物的实例包括聚乙二醇(peg)；聚丙二醇；和聚环氧烷共聚物(
带中性电荷的聚合物还包括两性离子聚合物。两性离子是指总体电荷中性、同时具有正电荷和负电荷的性质。两性离子聚合物的行为可类似于抵抗细胞和蛋白质粘附的细胞膜区域。
两性离子聚合物包括两性离子结构单元，所述两性离子结构单元包括具有两性离子基团的侧基(即，从聚合物主链悬垂的基团)。示例性两性离子侧基包括羧基甜菜碱基团(例如，-ra-n+(rb)(rc)-rd-co2-，其中ra是将聚合物主链共价偶联至羧基甜菜碱基团的阳离子氮中心的接头基团，rb和rc是氮取代基，并且rd是将阳离子氮中心共价偶联至羧基甜菜碱的羧基的接头基团)。
带负电的聚合物的实例包括海藻酸；羧酸多糖；羧甲基纤维素；羧甲基纤维素-半胱氨酸；角叉菜胶(例如，
在特定实施方案中，本文公开的聚合物可包括“星形聚合物”，其是指其中两个或更多个聚合物分支从核心延伸的支化聚合物。核心是具有两个或更多个官能团的原子团，通过聚合可从其延伸支链。在特定实施方案中，本公开的纳米颗粒包括星形聚合物。在特定实施方案中，本公开的纳米颗粒包括星形聚合物和包衣。在特定实施方案中，本公开的纳米颗粒包括星形聚合物和含有pga的包衣。在特定实施方案中，本公开的纳米颗粒包括星形聚合物和含有透明质酸的包衣。
在特定实施方案中，分支是两性离子或带负电的聚合物分支。对于星形聚合物，可经由水解、紫外线照射或加热将支链前体转化为两性离子或带负电的聚合物。也可通过对不饱和单体的聚合有效的任何聚合方法来获得聚合物，所述方法包括原子转移自由基聚合(atrp)、可逆加成-断裂链转移聚合(raft)、光聚合、开环聚合(rop)、缩合、迈克尔加成反应、支链生成/繁殖反应或其他反应。
脂质体是包括至少一个同心脂质双层的微观囊泡。选择形成囊泡的脂质以实现最终复合物的指定程度的流动性或刚性。在特定实施方案中，脂质体提供脂质组合物，所述脂质组合物是围绕多孔颗粒的外层。在特定实施方案中，本公开的纳米颗粒包括脂质体纳米颗粒。
脂质体可以是中性的(胆固醇)或双极性的，并且包括磷脂，如磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇(pi)和鞘磷脂(sm)以及其他类型的双极性脂质，包括具有长度在14-22范围内的烃链并且饱和或具有一个或多个双c＝c键的二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)。能够单独或与其他脂质组分组合产生稳定脂质体的脂质的实例是磷脂，如氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(pope)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-甲酸酯(dope-mal)。可并入脂质体的另外不含磷的脂质包括硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、肉豆蔻酸异丙酯、十二烷基硫酸三乙醇胺、烷基-芳基硫酸酯、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻油酸酯、十六烷基硬脂酸酯、两性丙烯酸聚合物、聚乙氧基化脂肪酸酰胺、ddab、双十八烷基二甲基氯化铵(dodac)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、dotap、dotma、dc-chol、磷脂酸(pa)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(dppg)、二油酰基磷脂酰甘油、dopg和磷酸二鲸蜡酯。在特定实施方案中，用于产生本文公开的脂质体的脂质包括胆固醇、氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)和衍生的形成囊泡的脂质peg-dspe。
形成脂质体的方法描述于，例如，美国专利号4,229,360；4,224,179；4,241,046；4,737,323；4,078,052；4,235,871；4,501,728；和4,837,028以及szoka等人,ann.rev.biophys.bioeng.9:467(1980)和hope等人,chem.phys.lip.40:89(1986)中。
颗粒的大小可在广泛范围内变化，并且可以不同的方式进行测量。在优选的实施方案中，所述颗粒是大小<130nm的np。然而，本公开的np也可具有等于或小于500nm、小于150nm、小于140nm、小于120nm、小于110nm、小于100nm、小于90nm、小于80nm、小于70nm、小于60nm、小于50nm、小于40nm、小于30nm、小于20nm或小于10nm的最小尺寸。在特定实施方案中，所述颗粒是大小为90至130nm的np。
在特定实施方案中，np可具有介于5nm与500nm之间、介于10nm与100nm之间、介于20nm与90nm之间、介于30nm与80nm之间、介于40nm与70nm之间以及介于40nm与60nm之间范围内的最小尺寸。在特定实施方案中，尺寸是np或包衣的np的直径。在特定实施方案中，本公开的颗粒群体可具有等于或小于500nm、小于100nm、小于90nm、小于80nm、小于70nm、小于60nm、小于50nm、小于40nm、小于30nm、小于20nm或小于10nm的平均最小尺寸。在特定实施方案中，本公开的组合物中的np群体可具有介于5nm与500nm之间、介于10nm与100nm之间、介于20nm与90nm之间、介于30nm与80nm之间、介于40nm与70nm之间和介于40nm与60nm之间、介于70nm与130nm之间或介于75nm与125nm之间范围内的平均直径。可使用例如常规技术，如动态光散射和/或电子显微术来确定颗粒的尺寸。尽管不是优选的，但在特定实施方案中，也可使用微颗粒。
在特定实施方案中，pbae聚合物与核苷酸(例如体外转录的mrna)以20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或更高的比率混合以生成pbae-核苷酸聚合复合物。在特定实施方案中，pbae聚合物与核苷酸(例如，体外转录的mrna)以60:1的比率混合以生成pbae-核苷酸聚合复合物。在特定实施方案中，pbae-核苷酸聚合复合物可与pga/二-甘露糖组合以形成最终np。
(5)靶向配体。靶向配体可在颗粒表面上使用，并且可导致异质细胞群体内的目标免疫细胞的更具选择性的结合。
在特定实施方案中，靶向配体包括源自细胞标志物配体、受体配体、抗体、肽、肽适体、核酸、核酸适体、镜像异构体(spiegelmer)或其组合的结合结构域。在特定实施方案中，在细胞靶向配体的背景内，结合结构域包括与另一种物质结合以形成能够介导内吞作用的复合物的任何物质。
在特定实施方案中，结合结构域源自抗体。源自抗体的结合结构域可包括完整抗体，或者可包括抗体的结合片段，例如fv、fab、fab'、f(ab')2、fc和单链fv片段(scfv)或与免疫细胞表达的靶向基序特异性结合的免疫球蛋白的任何生物学有效的片段。抗体或抗原结合片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微型抗体和线性抗体的全部或一部分。
与非人抗体相比，来自人起源的抗体或人源化抗体在人体内具有降低的免疫原性或没有免疫原性，并且具有较低数量的非免疫原性表位。通常将选择抗体及其片段以在人受试者中具有降低水平的抗原性或没有抗原性。
如本领域普通技术人员所已知，可使用获得单克隆抗体的方法、噬菌体展示的方法、产生人或人源化抗体的方法或使用经工程改造以产生抗体的转基因动物或植物的方法来制备特异性地结合由免疫细胞表达的基序的抗体(参见例如，us6,291,161和us6,291,158)。部分或完全合成的抗体的噬菌体展示文库是可用的，并且可筛选能够结合至免疫细胞基序的抗体或其片段。例如，可通过筛选fab噬菌体文库中的与目标靶标特异性结合的fab片段来鉴定结合结构域(参见hoet等人,nat.biotechnol.23:344,2005)。人抗体的噬菌体展示文库也是可用的。此外，在方便的系统(例如，小鼠、humab
完整抗体可包括通过二硫键相互连接的至少两条重链(h)和两条轻链(l)。每条重链由重链可变区(本文中缩写为vh或vh)和重链恒定区组成。重链恒定区包括三个结构域，ch1、ch2和ch3。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为vl或vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区包括一个结构域cl。vh区和vl区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间散布着较保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，所述cdr和fr按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。所述抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(clq)。在特定实施方案中，抗体包括完整抗体的保留结合能力的抗原结合部分。保留结合能力的片段的实例包括：(i)fab片段，其是包括vl、vh、cl和ch1结构域的单价片段；(ii)f(ab’)2片段，其是在铰链区包括由二硫桥键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)包括vh和ch1结构域的fd片段；(iv)包括抗体的单臂的vl和vh结构域的fv片段；(v)dab片段(ward等人,nature,341:544-546(1989))，其包括vh结构域；以及(vi)分离的互补决定区(cdr)。
给定cdr或fr的精确氨基酸序列边界可使用许多众所周知的方案中的任一种容易地确定，包括以下描述的那些方案：kabat等人(1991)"sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,"第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(kabat编号方案)；al-lazikani等人(1997)jmolbiol273:927-948(chothia编号方案)；maccallum等人(1996)jmolbiol262:732-745(contact编号方案)；martin等人(1989)proc.natl.acad.sci.,86:9268-9272(abm编号方案)；lefrancmp等人(2003)devcompimmunol27(1):55-77(imgt编号方案)；以及honegger和pluckthun(2001)jmolbiol309(3):657-670("aho"编号方案)。给定cdr或fr的边界可根据用于鉴定的方案而变化。例如，kabat方案是基于结构比对，而chothia方案是基于结构信息。kabat和chothia方案两者的编号均是基于最常见的抗体区域序列长度，并通过插入字母(例如“30a”)进行插入，并且一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。contact方案是基于复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与chothia编号方案相似。在特定实施方案中，本文公开的抗体cdr序列是根据kabat编号。在特定实施方案中，在抗体区域内发现cdr区域，所述cdr区域通过kabat编号如下：对于轻链：cdrl1是氨基酸24-34；cdrl2是氨基酸50-56；cdrl3是氨基酸89-97，并且对于重链：cdrh1是氨基酸31-35；cdrh2是氨基酸50-65；并且cdrh3是氨基酸95-102。
肽适体包括在两端连接至蛋白质支架的肽环(其对靶蛋白具有特异性)。这种双重结构限制极大地提高了肽适体的结合亲和力，使其达到与抗体相当的水平。可变环长度典型地为8至20个氨基酸(例如8至12个氨基酸)，并且支架可以是为稳定、可溶性、小的且无毒的任何蛋白质(例如，硫氧还蛋白-a、stefina三联体突变体、绿色荧光蛋白、eglinc和细胞转录因子spl)。可使用不同的系统进行肽适体选择，如酵母双杂交系统(例如gal4酵母双杂交系统)或lexa相互作用陷阱系统。
核酸适体是通过折叠成特定的球形结构来发挥功能的单链核苷酸序列(dna或rna)配体，所述球形结构导致以高亲和力和特异性与靶蛋白或其他分子结合，如以下所描述：osborne等人,curr.opin.chem.biol.1:5-9,1997；以及cerchia等人,febsletters528:12-16,2002。在特定实施方案中，适体较小(15kd；或介于15-80个核苷酸之间或20-50个核苷酸之间)。通常通过称为selex的程序从包括1014-1015个随机寡核苷酸序列的文库中分离适体(参见例如，tuerk等人,science,249:505-510,1990；green等人,methodsenzymology.75-86,1991；以及gold等人,annu.rev.biochem.,64:763-797,1995)。产生适体的其他方法描述于例如美国专利号6,344,318；6,331,398；6,110,900；5,817,785；5,756,291；5,696,249；5,670,637；5,637,461；5,595,877；5,527,894；5,496,938；5,475,096；以及5,270,16中。镜像异构体类似于核酸适体，只是至少一个β-核糖单元被β-d-脱氧核糖或选自例如β-d-核糖、α-d-核糖、β-l-核糖的经修饰的糖单元替代。
在特定实施方案中，靶向细胞是tam。靶向细胞还可包括调控性t细胞(treg)。treg是t细胞的亚群，其调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性并消除自身免疫性疾病。treg表达cd25、ctla-4、gitr、garp和lap。本文公开的选择的靶向细胞的配体可结合cd25、ctla-4、gitr、garp和/或lap，以实现核苷酸的选择性递送至初始treg。可靶向的其他细胞类型包括骨髓样来源的抑制细胞(mdsc)、调控性树突细胞(dcreg)、嗜中性粒细胞、t辅助17细胞(th17)、调控性b细胞(breg)和/或间充质基质细胞(msc)。本领域普通技术人员可利用如本文公开的靶向配体来鉴定适当的细胞标志物以靶向这些细胞类型。
m2结合结构域。在特定实施方案中，egr2在m2巨噬细胞上被靶向。针对egr2的可商购的抗体可从thermofisher,waltham,ma；abcam,cambridge,ma；milliporesigma,burlington,ma；miltenyibiotec,bergischgladbach,germany；lifespanbiosciences,inc.,seattle,wa；以及novusbiologicals,littleton,co获得。抗egr2抗体的产生在例如murakamik等人(1993)oncogene8(6):1559-1566中进行了论述。抗egr2抗体包括：兔单克隆抗egr2抗体克隆epr4004；小鼠单克隆抗egr2抗体克隆1g5；小鼠单克隆抗egr2抗体克隆oti1b12；识别人egr2的aa残基200-300的兔多克隆抗egr2抗体；识别人egr2的aa残基340-420的兔多克隆抗egr2抗体；以及识别人egr2的aa残基370-420的兔多克隆抗egr2抗体。结合结构域可源自这些抗体和本文公开的其他抗体。
在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变重链的人或人源化结合结构域(例如，纳米抗体)，所述可变重链包括含有sgnifsinaig(seqidno:45)的cdrh1序列、含有titlsgstn(seqidno:46)的cdrh2序列以及含有ntysdsdvygy(seqidno:47)的cdrh3序列。这些反映结合cd206的cdr序列。
在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变重链的人或人源化结合结构域(例如，纳米抗体)，所述可变重链包括含有pgfkldyyaia(seqidno:48)的cdrh1序列、含有sinssggst(seqidno:49)的cdrh2序列和含有lrryyglnldpgsydy(seqidno:50)的cdrh3序列。这些反映结合cd206的cdr序列。
在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变重链的人或人源化结合结构域(例如，纳米抗体)，所述可变重链包括含有gfpfniypms(seqidno:51)的cdrh1序列、含有yishggttt(seqidno:52)的cdrh2序列和含有gyarlmtdselv(seqidno:53)的cdrh3序列。这些反映结合cd206的cdr序列。
对cd206具有特异性的许多另外抗体是本领域技术人员已知的，并且可容易地针对序列、表位结合和亲和力进行表征。参见例如，wo2014/140376、wo2013/174537和us7,560,534。针对cd206的可商购的抗体可从thermofisher,waltham,ma；proteintech,rosemont,il；biolegend,sandiego,ca；r&dsystems,minneapolis,mn；lifespanbiosciences,inc.,seattle,wa；novusbiologicals,littleton,co；以及bio-rad,hercules,ca获得。在特定实施方案中，抗cd206抗体包括大鼠单克隆抗小鼠cd206单克隆抗体克隆c068c2(目录号141732，biolegend,sandiego,ca)。
在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变轻链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变轻链包括含有asqsvshdv(seqidno:54)的cdrl1序列、含有yts的cdrl2序列和含有qdyssprt(seqidno:56)的cdrl3序列。在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变重链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变重链包括含有gysitsdy(seqidno:57)的cdrh1序列、含有ysg的cdrh2序列和含有cvsgtyyfdywg(seqidno:59)的cdrh3序列。这些反映结合cd163的mac2-48抗体的cdr序列。
在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变轻链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变轻链包括含有asqsvssdv(seqidno:60)的cdrl1序列、含有yas的cdrl2序列和含有qdytsprt(seqidno:62)的cdrl3序列。在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变重链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变重链包括含有gysitsdy(seqidno:63)的cdrh1序列、含有ysg的cdrh2序列和含有cvsgtyyfdywg(seqidno:65)的cdrh3序列。这些反映结合cd163的mac2-158抗体的cdr序列。
对cd163具有特异性的许多另外的抗体或结合结构域是本领域技术人员已知的，并且可容易地针对序列、表位结合和亲和力进行表征。参见例如，wo2011/039510、wo2002/032941、wo2002/076501和us2005/0214871。针对cd163的可商购的抗体可从thermofisher,waltham,ma；enzolifesciences,inc.,farmingdale,ny；biolegend,sandiego,ca；r&dsystems,minneapolis,mn；lifespanbiosciences,inc.,seattle,wa；以及rdiresearchdiagnostics,flanders,nj获得。在特定实施方案中，抗cd163抗体可包括：小鼠单克隆抗cd163抗体克隆3d4；小鼠单克隆抗cd163抗体克隆ber-mac3；小鼠单克隆抗cd163抗体克隆edhu-1；以及小鼠单克隆抗cd163抗体克隆ghi/61。
在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变轻链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变轻链包括含有rssksllykdgktyln(seqidno:66)的cdrl1序列、含有lmstras(seqidno:67)的cdrl2序列和含有qqlveypft(seqidno:68)的cdrl3序列。在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变重链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变重链包括含有gywms(seqidno:69)的cdrh1序列、含有eirlksdnyathyaesvkg(seqidno:70)的cdrh2序列和含有fid的cdrh3序列。这些反映结合cd23的cdr序列。
对cd23具有特异性的许多抗体或结合结构域是本领域技术人员已知的，并且可容易地针对序列、表位结合和亲和力进行表征。参见例如，us7,008,623、us6,011,138a(包括5e8、6g5、2c8，b3b1和3g12的抗体)、us2009/0252725、rector等人(1985)j.immunol.55:481-488；flores-rumeo等人(1993)science241:1038-1046；sherr等人(1989)j.immunol.142:481-489；以及pene等人,(1988)pnas85:6820-6824。针对cd23的可商购的抗体可从thermofisher,waltham,ma；abcam,cambridge,ma；biossantibodies,inc.,woburn,ma；bio-rad,hercules,ca；lifespanbiosciences,inc.,seattle,wa；以及bosterbiologicaltechnology,pleasanton,ca获得。在特定实施方案中，抗cd23抗体可包括：小鼠单克隆抗cd23抗体克隆tu1；兔单克隆抗cd23抗体克隆sp23；兔单克隆抗cd23抗体克隆epr3617；小鼠单克隆抗cd23抗体克隆5b5；小鼠单克隆抗cd23抗体克隆1b12；小鼠单克隆抗cd23抗体克隆m-l23.4；和小鼠单克隆抗cd23抗体克隆3a2。
m1结合结构。在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变轻链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变轻链包括含有ssnigdny(seqidno:72)的cdrl1序列、含有rds的cdrl2序列和含有qsydsslsgs(seqidno:74)的cdrl3序列。在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变重链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变重链包括含有gftfddyg(seqidno:75)的cdrh1序列、含有iswnggkt(seqidno:76)的cdrh2序列和含有argslfhdssgfyfgh(seqidno:77)的cdrh3序列。这些反映结合cd38的ab79抗体的cdr序列。
在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变轻链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变轻链包括含有nsnigsnt(seqidno:78)的cdrl1序列、含有sds的cdrl2序列和含有qsydsslsgsr(seqidno:80)的cdrl3序列。在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变重链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变重链包括含有gftfnnyg(seqidno:81)的cdrh1序列、含有isydgsdk(seqidno:82)的cdrh2序列和含有arvyyygfsgpsmdv(seqidno:83)的cdrh3序列。这些反映结合cd38的ab19抗体的cdr序列。
在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变轻链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变轻链包括含有rasqsvssyla(seqidno:84)的cdrl1序列、含有dasnrat(seqidno:85)的cdrl2序列和含有qqrsnwpptf(seqidno:86)的cdrl3序列。在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变重链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变重链包括含有sfams(seqidno:87)的cdrh1序列、含有aisgsgggtyyadsvkg(seqidno:88)的cdrh2序列和含有dkilwfgepvfdy(seqidno:89)的cdrh3序列。这些反映结合在us7,829,693中描述的cd38的达雷木单抗(daratumumab)抗体的cdr序列。
对cd38具有特异性的许多抗体是本领域技术人员已知的，并且可容易地针对序列、表位结合和亲和力进行表征。参见例如，wo2005/103083、wo2006/125640、wo2007/042309、wo2008/047242、wo2012/092612、wo2006/099875、wo2011/154453、wo2015/130728、us7,829,693以及us2016/0200828。针对cd38的可商购的抗体可从thermofisher,waltham,ma；abcam,cambridge,ma；和milliporesigma,burlington,ma获得。在特定实施方案中，抗cd23抗体可包括：兔单克隆抗cd38抗体克隆gad-3；小鼠单克隆抗cd38抗体克隆hit2；小鼠单克隆抗cd38抗体克隆at1；小鼠单克隆抗cd38抗体克隆at13/5；大鼠单克隆抗cd38抗体克隆nimr-5；和大鼠单克隆igg2a,κ抗cd38抗体克隆90/cd38(cat#bdbiosciences,sanjose,ca)。
在特定实施方案中，g蛋白偶联受体18(gpr18)在m1巨噬细胞上被靶向。针对gpr18的可商购的抗体可从assaybiotechnologycompanyinc.,sunnyvale,ca；thermofisher,waltham,ma；abcam,cambridge,ma；genetex,inc.,irvine,ca；和novusbiologicals,littleton,co获得。在特定实施方案中，抗gpr18抗体包括：识别人gpr18的氨基酸1-50的一部分的兔多克隆抗gpr18抗体；识别包括人gpr18的氨基酸160-240的区域的兔多克隆抗gpr18抗体；识别包括人gpr18的氨基酸100-180的区域的兔多克隆抗gpr18抗体；兔单克隆抗gpr18抗体克隆epr12359；和识别包括人gpr18的氨基酸140-190的区域的兔多克隆抗gpr18抗体。
在特定实施方案中，甲酰基肽受体2(fpr2)在m1巨噬细胞上被靶向。针对fpr2的可商购的抗体可从atlasantibodies,bromma,sweden；biorbyt,llc,sanfrancisco,ca；cloud-clonecorp.,katy,tx；usbiologicallifesciences,salem,ma；和novusbiologicals,littleton,co获得。在特定实施方案中，抗fpr2抗体包括：小鼠单克隆抗fpr2抗体克隆gm1d6；小鼠单克隆抗fpr2抗体克隆304405；重组抗fpr2抗体克隆rea663；和识别包括fpr2的氨基酸300-350的区域的兔多克隆抗fpr2抗体。
在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变轻链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变轻链包括含有rasqsvssyla(seqidno:90)的cdrl1序列、含有dassrat(seqidno:91)的cdrl2序列和含有qlrsnwppyt(seqidno:92)的cdrl3序列。在特定实施方案中，靶向配体包括含有可变重链的人或人源化结合结构域(例如，scfv)，所述可变重链包括含有gygmh(seqidno:93)的cdrh1序列、含有viwydgsnkyyadsvkg(seqidno:94)的cdrh2序列和含有dtgdrffdy(seqidno:95)的cdrh3序列。这些反映结合cd64的cdr序列。
对cd64具有特异性的许多抗体是本领域技术人员已知的，并且可容易地针对序列、表位结合和亲和力进行表征。参见例如，us7,378,504、wo2006/131953和wo2008/074867。针对cd64的可商购的抗体可从ancell,bayport,mn；thermofisher,waltham,ma；abcam,cambridge,ma；lifespanbiosciences,inc.,seattle,wa；和novusbiologicals,littleton,co获得。在特定实施方案中，抗cd64抗体包括：小鼠单克隆抗cd64抗体克隆32-2；小鼠单克隆抗cd64抗体克隆umab74；大鼠单克隆抗cd64抗体克隆290322；小鼠单克隆抗cd64抗体克隆10.1；和小鼠单克隆抗cd64抗体克隆1d3。
在特定实施方案中，cd86在m1巨噬细胞上被靶向。对cd86具有特异性的许多抗体是本领域技术人员已知的，并且可容易地针对序列、表位结合和亲和力进行表征。参见例如，wo2004/076488、us8,378,082(mab2d4)和us6,346,248(ig10h6d10)。针对cd86的可商购的抗体可从thermofisher,waltham,ma；miltenyibiotec,bergischgladbach,germany；lifespanbiosciences,inc.,seattle,wa；bio-rad,hercules,ca；和novusbiologicals,littleton,co获得。在特定实施方案中，抗cd86抗体包括：小鼠单克隆抗cd86抗体克隆bu63；识别包括人cd86的ala23至his244的区域的多克隆山羊抗cd86抗体；小鼠单克隆抗cd86抗体克隆it2.2；兔单克隆抗cd86抗体克隆bff-3；和小鼠单克隆抗cd86抗体克隆c86/1146。
也可使用其他可促进淋巴细胞内化和/或转染的剂，如聚(乙烯亚胺)/dna(pe1/dna)复合物。
(6)组合物。本文公开的颗粒可作为被配制用于向受试者施用的组合物的一部分提供。组合物包括本文公开的颗粒和药学上可接受的载体。
常用的示例性药学上可接受的载体包括任何和所有增积剂或填充剂、溶剂或助溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素e)、防腐剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、稳定剂、缓冲剂、螯合剂(例如，edta)、凝胶、粘合剂、崩解剂和/或润滑剂。
示例性缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲胺盐。
示例性防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵、氯化六烃季铵、对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
示例性等渗剂包括多元糖醇，包括三元或更高级的糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。
示例性稳定剂包括有机糖、多元糖醇、聚乙二醇、含硫还原剂、氨基酸、低分子量多肽、蛋白质、免疫球蛋白、亲水性聚合物或多糖。
在特定实施方案中，将组合物配制用于腹膜内、静脉内或颅内注射。本文公开的组合物可进一步配制用于动脉内、结内、淋巴内、肿瘤内、肌内、口服和/或皮下施用，且更特别地通过动脉内、结内、淋巴内、肿瘤内、肌内和/或皮下注射施用。可将本文公开的组合物配制成用于通过输注、灌注或摄入来施用。
对于注射，可将组合物配制成水溶液，如在包括汉克斯氏溶液(hanks'solution)、林格氏溶液(ringer'ssolution)或生理盐水的缓冲液中。水溶液可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述制剂可呈冻干和/或粉末形式，以便在使用前用合适的媒介物(例如无菌的无热原水)复原。
组合物也可配制成贮库制剂。贮库制剂可用合适的聚合或疏水性材料(例如，配制为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制为微溶性衍生物，例如配制为微溶性盐。
另外，可利用含有颗粒的固体聚合物的半透性基质将组合物配制成持续释放系统。各种持续释放材料已经建立并且是本领域普通技术人员所熟知的。取决于其化学性质，持续释放系统可在施用数周后长达超过100天释放颗粒。
对于口服施用，组合物可配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。
当配制以用于治疗癌症时，所公开的组合物还可包括携带一种或多种选自以下的抗癌基因的核苷酸：p53、rb、brca1、e1a、bcl-2、mdr-1、p21、p16、bax、bcl-xs、e2f、igf-ivegf、血管抑素、制瘤素、内皮抑素、gm-csf、il-12、il-2、il-4、il-7、ifn-γ、tnfα和/或hsv-tk。
本文公开的任何组合物制剂可有利地包括任何其他药学上可接受的载体，所述载体包括不会产生显著不利的、过敏或其他不合宜反应的那些载体，所述反应无论是用于研究、防治和/或治疗性治疗均超过施用益处。示例性药学上可接受的载体和制剂公开于remington'spharmaceuticalsciences,第18版mackprintingcompany,1990中。此外，可按照美国fda生物标准办公室和/或其他相关外国监管机构的要求，制备制剂以满足无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
在特定实施方案中，所述颗粒作为组合物的一部分提供，所述组合物可包括例如至少0.1％w/v或w/w颗粒；至少1％w/v或w/w颗粒；至少10％w/v或w/w颗粒；至少20％w/v或w/w颗粒；至少30％w/v或w/w颗粒；至少40％w/v或w/w颗粒；至少50％w/v或w/w颗粒；至少60％w/v或w/w颗粒；至少70％w/v或w/w颗粒；至少80％w/v或w/w颗粒；至少90％w/v或w/w颗粒；至少95％w/v或w/w颗粒；或至少99％w/v或w/w颗粒。
使用方法。本文公开的方法包括通过将包括编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸的纳米颗粒并入巨噬细胞中来将巨噬细胞的活化状态从失活状态改变为活化的状态。在特定实施方案中，所述改变导致与未用包括编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸的纳米颗粒处理的处于失活状态的巨噬细胞的百分比相比，用包括编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸的纳米颗粒处理的巨噬细胞群中失活状态的巨噬细胞(例如，m2巨噬细胞)的百分比降低5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。在特定实施方案中，所述改变导致与未用包括编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸的纳米颗粒处理的处于失活状态的巨噬细胞的数量相比，用包括编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸的纳米颗粒处理的巨噬细胞群体中处于失活状态的巨噬细胞(例如，m2巨噬细胞)的数量降低5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。在特定实施方案中，所述改变导致与未用包括编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸的纳米颗粒处理的处于活化的状态的巨噬细胞的百分比相比，用包括编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸的纳米颗粒处理的巨噬细胞群中处于活化的状态的巨噬细胞(例如，m1巨噬细胞)的百分比增加5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。在特定实施方案中，所述改变导致与未用包括编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸的纳米颗粒处理的处于活化的状态的巨噬细胞的数量相比，用包括编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸的纳米颗粒处理的巨噬细胞群体中处于活化的状态的巨噬细胞的数量增加5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
在特定实施方案中，通过将包括编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸的纳米颗粒引入巨噬细胞中来将巨噬细胞的活化状态从失活状态改变为活化的状态导致：恢复淋巴细胞迁移和浸润至实体瘤中；使包括il-1β、il-12、ifnγ和/或tnfα的促炎性(抗肿瘤)细胞因子的释放增加1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍或更多倍；使与m2巨噬细胞表型相关的细胞因子(包括il-6)的释放降低1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。
在特定实施方案中，将巨噬细胞的活化状态从失活状态改变为活化的状态包括将包括编码irf5和irf8的核苷酸的纳米颗粒引入巨噬细胞中。在特定实施方案中，将巨噬细胞的活化从失活状态改变为活化的状态包括将包括编码突变型irf的核苷酸的纳米颗粒引入巨噬细胞中，所述突变型irf具有组成性活性或比其野生型对应irf更具活性。
本文公开的方法包括用本文公开的组合物治疗受试者(人、兽医动物、牲畜和研究动物)。治疗受试者包括递送治疗有效量。治疗有效量可提供有效量、防治性治疗和/或治疗性治疗。
“有效量”是引起受试者的所需生理变化所必需的化合物的量。通常施用有效量用于研究目的。本文公开的有效量免疫调节受试者的细胞。在特定实施方案中，待免疫调节的细胞是免疫抑制的细胞。在特定实施方案中，待免疫调节的细胞是巨噬细胞。在特定实施方案中，巨噬细胞的免疫调节包括将免疫抑制的巨噬细胞转变为活化的巨噬细胞。在特定实施方案中，巨噬细胞的免疫调节包括将m2巨噬细胞转变为m1巨噬细胞。在特定实施方案中，待免疫调节的细胞包括免疫抑制的细胞，包括mdsc、treg、dcreg、嗜中性粒细胞、th17、breg和/或msc。在特定实施方案中，免疫抑制细胞的免疫调节包括免疫抑制细胞从促肿瘤至抗肿瘤的表型和/或功能转变。
“防治性治疗”包括如下治疗：施用至不展示疾病或疾患的体征或症状或仅展示疾病或疾患的早期体征或症状的受试者，以使得施用治疗是为了减轻、预防所述疾病或疾患或降低进一步发展所述疾病或疾患的风险。因此，防治性治疗用作针对疾病或病症的预防性治疗。在特定实施方案中，防治性治疗包括向患有癌症但处于缓解状态的受试者施用本文公开的组合物，以使得施用治疗是为了减少或延迟复发的发生。
“治疗性治疗”包括施用至展示疾病或疾患的症状或体征的受试者的治疗，并且施用至受试者是为了减轻或消除所述疾病或疾患的那些体征或症状。在特定实施方案中，治疗性治疗包括向患有癌症的受试者施用本文公开的组合物以减轻或消除肿瘤和/或转移。
在特定实施方案中，治疗有效量在受试者中提供抗癌作用。癌症(医学术语：恶性赘瘤)是指一组细胞展示不受控制的生长(超出正常限值的分裂)、侵袭(侵入相邻组织上并破坏相邻组织)且有时转移的一类疾病。“转移”是指癌细胞从其原始增殖位点扩散到身体的另一部分。转移的形成是非常复杂的过程，并且取决于恶性细胞从原发肿瘤的分离、细胞外基质的侵袭、内皮基底膜的渗透从而进入体腔和血管，然后经血液运输、浸润目标器官。最后，在目标部位的新肿瘤，即继发性肿瘤或转移性肿瘤的生长取决于血管生成。即使在除去原发肿瘤之后，肿瘤转移也经常发生，因为肿瘤细胞或组分可能保留并发展转移潜力。
在特定实施方案中，治疗有效量在受试者中提供抗肿瘤作用。“肿瘤”是由细胞(称为赘瘤性细胞或肿瘤细胞)的异常生长形成的肿胀或病变。“肿瘤细胞”是通过快速不受控制的细胞增殖分裂并在引发新分裂的刺激停止后继续分裂的异常细胞。肿瘤显示出部分或完全缺乏正常组织的结构组构和与正常组织的功能协调，并且通常形成明显的组织块，其可以是良性、恶性前或恶性的。
抗肿瘤作用是指生物学作用，其可表现为肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、肿瘤体积减小、预期寿命增加、诱导的癌细胞凋亡、诱导癌细胞死亡、诱导的癌细胞的化学敏感性或放射敏感性、抑制癌细胞附近的血管生成、抑制癌细胞增殖、抑制肿瘤生长、预防转移、延长受试者的生命、减轻癌症相关的疼痛、减少转移数量和/或减少治疗后癌症的复发或重现。因此，本文公开的组合物可用于治疗多种癌症，可预防或显著延迟转移，和/或可预防或显著延迟复发。在特定实施方案中，用本文公开的纳米颗粒组合物治疗的患有癌症的受试者的总体存活与未用所述纳米颗粒组合物治疗的患有相同癌症的对照受试者相比提高1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍或更多倍。在特定实施方案中，用本文公开的纳米颗粒组合物治疗的患有癌症的受试者的转移的数量与未用所述纳米颗粒组合物治疗的患有相同癌症的对照受试者相比减少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
在特定实施方案中，治疗性治疗包括将本文公开的组合物与另一种疗法组合施用至患有癌症的受试者以减少或消除肿瘤。在特定实施方案中，与本文公开的组合物组合使用的疗法包括癌症疫苗、car免疫疗法(例如，car-t免疫疗法)、化学疗法、放射疗法、激素疗法、信号转导抑制剂、基因表达调节剂、凋亡诱导剂、血管生成抑制剂以及递送有毒分子的单克隆抗体。在特定实施方案中，将本文公开的纳米颗粒组合物与放射疗法组合施用至患有癌症的受试者与未施用所述纳米颗粒组合物与放射疗法的组合的患有相同癌症的对照受试者相比使总体存活提高1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍或更多倍。
可用本文公开的系统和方法治疗的癌症包括卵巢癌、乳腺癌、脑癌、黑素瘤、肺转移、精原细胞瘤、畸胎瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、头颈癌、胃肠道癌、淋巴结癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ent)癌、前列腺癌、子宫癌、肺癌以及它们转移。
如所指示，本公开的教义还可用于调节免疫细胞的活化状态以在诸如自身免疫性疾病的条件下使免疫系统失活的方法。在特定实施方案中，在自身免疫性疾病中将巨噬细胞的活化状态从活化的状态改变为失活状态包括将包括编码诱导m2表型的irf的核苷酸的纳米颗粒引入巨噬细胞中。诱导m2表型的irf的特定实施方案包括irf3和/或irf4。在特定实施方案中，在自身免疫性疾病中将巨噬细胞的活化状态从活化的状态改变为失活状态包括将包括编码gilz(糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链)转录因子的核苷酸的纳米颗粒引入巨噬细胞中，所述gilz转录因子介导糖皮质激素抗炎作用并可诱导m2表型。在特定实施方案中，在自身免疫性疾病中将巨噬细胞的活化状态从活化的状态改变为失活状态包括将包括编码gilz和irf4的核苷酸的纳米颗粒引入巨噬细胞中。示例性自身免疫性疾病包括急性坏死性出血性脑病、变应性哮喘、斑秃、贫血、口疮性溃疡、关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎)、哮喘、自身免疫性甲状腺炎、结膜炎、克隆氏病(crohn'sdisease)、皮肤型红斑狼疮、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、糖尿病(diabetes)、糖尿病(diabetesmellitus)、麻风结节性红斑、角膜结膜炎、多发性硬化症、重症肌无力、银屑病、硬皮病、薛格连氏综合征(包括继发于薛格连氏综合征的干燥性角膜结膜炎)、史蒂文斯—约翰逊综合征(stevens-johnsonsyndrome)、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、阴道炎和韦格纳氏肉芽肿病(wegener'sgranulomatosis)。
对于施用，可基于体外测定和/或动物模型研究的结果初始估计治疗有效量(本文中也称为剂量)。例如，可在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养物中针对特定靶标确定的ic50的循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定目标受试者的可用剂量。
施用至特定受试者的实际剂量的量可由医师、兽医或研究人员在考虑诸如包括受试者的目标、体重、疾患的严重程度、疾病类型、先前或同时的治疗干预、特发性疾病在内的身体和生理因素以及施用途径的参数的情况下确定。
有用剂量通常在0.1至5μg/kg或0.5至1μg/kg的范围内。在特定实施方案中，剂量可包括1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、350μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、650μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、850μg/kg、900μg/kg、950μg/kg、1000μg/kg、0.1至5mg/kg或0.5至1mg/kg。在特定实施方案中，剂量可包括1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、1000mg/kg或更多。
治疗有效量可通过在治疗方案的过程期间(例如每天、每隔一天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每3周、每月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或每年)施用单个或多个剂量来实现。在特定实施方案中，治疗有效量可通过在治疗方案过程期间施用重复剂量来实现。
本文所述的纳米颗粒组合物可通过注射、吸入、输注、灌注、灌洗或摄入来施用。施用途径可包括静脉内、真皮内、动脉内、肠胃外、鼻内、结节内、淋巴管内、腹膜内、颅内、病变内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、肿瘤内、肌肉内、膀胱内、口服、皮下和/或舌下施用，并且更特别地通过静脉内、肿瘤内、腹膜内和/或颅内注射施用。局部施用包括将治疗有效量的本文公开的组合物施用至身体的特定区域、器官或腔。例如，腹膜内注射可用于递送治疗卵巢癌的治疗剂，或颅内注射可用于递送治疗神经胶质瘤的治疗剂。在肿瘤部位施用治疗剂可包括使用如上所述的靶向配体将配体介导的治疗剂(例如，纳米颗粒组合物)靶向肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞而不靶向健康组织。在肿瘤部位施用治疗剂可包括使治疗剂(例如，纳米颗粒组合物)被动靶向肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞而不是健康组织。被动靶向的具体实施方案可包括基于纳米颗粒的大小范围以及肿瘤组织的渗漏血管系统和受损的淋巴引流的高渗透长滞留(enhancedpermeabilityandretention，epr)现象。相比之下，全身性施用是全身的，并且典型地通过将组合物或治疗剂静脉内注射到循环中来实现。治疗剂的全身性施用可用于癌症如已转移的癌症的较不局部化的形式。
图5提供支持本公开的示例性序列(seqidno:1-44、110和111)。cdr序列也在本文中进行了描述。本公开包括这些序列的变体。蛋白质序列的变体可包括具有一个或多个保守氨基酸取代或一个或多个非保守取代的序列的那些变体，所述取代不会不利地影响蛋白质的功能。“保守取代”涉及在以下保守取代组中的一个中发现的取代：第1组：丙氨酸(ala)、甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)；第2组：天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)；第3组：天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gln)；第4组：精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)、组氨酸(his)；第5组：异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、甲硫氨酸(met)、缬氨酸(val)；和第6组：苯丙氨酸(phe)、酪氨酸(tyr)、色氨酸(trp)。
另外，氨基酸可通过类似的功能或化学结构或组成(例如，酸性、碱性、脂族、芳香族、含硫的)来分组为保守取代组。例如，出于取代的目的，脂族组可包括gly、ala、val、leu和ile。含有被认为是彼此为保守取代的氨基酸的其他组包括：含硫的：met和半胱氨酸(cys)；酸性：asp、glu、asn和gln；小的脂族非极性或轻微极性的残基：ala、ser、thr、pro和gly；极性、带负电荷的残基及其酰胺：asp、asn、glu和gln；极性、带正电荷的残基：his、arg和lys；大的脂族非极性残基：met、leu、ile、val和cys；以及大的芳香族残基：phe、tyr和trp。另外的信息见于creighton(1984)proteins,w.h.freemanandcompany。
蛋白质的片段由少于相应蛋白质的完整氨基酸序列组成，但保留全长蛋白质的功能。
核苷酸序列的变体可包括简并密码子、序列多态性和突变中的一者或多者，其中此类改变不影响所编码的活化调控因子的功能或基本上不影响所编码的活化调控因子的功能。
在特定实施方案中，序列的变体包括与本文描述或公开的序列具有至少70％序列同一性、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
“序列同一性％”是指如通过比较序列所确定的两种或更多种序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还意指如通过此类序列串之间的匹配所确定的序列之间的序列相关性程度。“同一性”(经常称为“相似性”)可通过已知方法来容易地计算，所述方法包括在以下中描述的那些：computationalmolecularbiology(lesk,a.m.编辑)oxforduniversitypress,ny(1988)；biocomputing:informaticsandgenomeprojects(smith,d.w.编辑)academicpress,ny(1994)；computeranalysisofsequencedata,parti(griffin,a.m.,andgriffin,h.g.编辑)humanapress,nj(1994)；sequenceanalysisinmolecularbiology(vonheijne,g.编辑)academicpress(1987)；以及sequenceanalysisprimer(gribskov,m.anddevereux,j.编辑)oxforduniversitypress,ny(1992)。确定序列同一性％的优选方法经设计以得到所测试序列之间的最佳匹配。确定序列同一性和相似性％的方法编写于可公开获得的计算机程序中。序列比对和序列同一性％计算可使用lasergene生物信息学计算套件(dnastar,inc.,madison,wisconsin)的megalign程序来执行。序列的多重比对还可使用clustal比对方法(higgins和sharpcabios,5,151-153(1989)以默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)来执行。相关程序还包括gcg程序套件(威斯康星软件包9.0版，geneticscomputergroup(gcg),madison,wisconsin)；blastp、blastn、blastx(altschul等人,j.mol.biol.215:403-410(1990)；dnastar(dnastar,inc.,madison,wisconsin)；以及并入smith-waterman算法的fasta程序(pearson,comput.methodsgenomeres.,[proc.int.symp.](1994),会议日期1992,111-20.编辑：suhai,sandor.publisher:plenum,newyork,ny。在本公开的上下文内，将了解在将序列分析软件用于分析的情况下，分析的结果是基于所引用的程序的“默认值”。“默认值”将意指在首次初始化时用软件最初加载的值或参数的任何集合。
包括以下示例性实施方案和实施例以说明本公开的特定实施方案。鉴于本公开，本领域普通技术人员应认识到，在不脱离本公开的精神和范围的情况下可对本文所公开的特定实施方案作出许多改变并且仍获得相似或类似结果。
示例性实施方案。
1.一种改变体内免疫细胞的活化状态的方法，所述方法包括：
施用包括编码一种或多种干扰素调控因子(irf)的核苷酸的纳米颗粒，从而改变体内免疫细胞的所述活化状态。
2.如实施方案1所述的方法，其中所述免疫细胞是巨噬细胞、调控性t细胞(treg)、骨髓来源的抑制细胞(mdsc)、调控性树突细胞(dcreg)、嗜中性粒细胞、t辅助17细胞(th17)、调控性b细胞(breg)和/或间充质基质细胞(msc)。
3.如实施方案1或2所述的方法，其中所述纳米颗粒包括带正电荷的核心、聚(β)-氨基酯核心、星形聚合物、聚谷氨酸包衣、透明质酸包衣、带中性电荷的包衣和/或脂质体纳米颗粒。
4.如实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒<130nm。
5.如实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述核苷酸包括体外转录的mrna。
6.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述核苷酸被包封在核心内。
7.如实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf缺乏功能性自抑制结构域。
8.如实施方案1至7中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf缺乏功能性核输出信号(nes)。
9.如实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述施用是局部施用。
10.如实施方案9所述的方法，其中所述局部施用是腹膜内或颅内施用。
11.如实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述施用是全身性施用。
12.如实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒还包括靶向配体。
13.如实施方案12所述的方法，其中所述靶向配体连接至包衣。
14.如实施方案1至13中任一项所述的方法，其中将所述活化状态从失活状态改变为活化的状态。
15.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包括巨噬细胞。
16.如实施方案15所述的方法，其中所述巨噬细胞在肿瘤内。
17.如实施方案16所述的方法，其中所述肿瘤是卵巢癌肿瘤、成胶质细胞瘤肿瘤或转移性肺癌肿瘤。
18.如实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf选自irf1、irf3、irf5、irf7、irf8和/或irf7和irf3的融合体。
19.如实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf选自与seqidno:1-17具有>90％、>95％或大于98％同一性的序列。
20.如实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf是选自seqidno:1-7的irf5。
21.如实施方案20所述的方法，其中irf5是seqidno:1。
22.如实施方案20或21所述的方法，其中irf5是具有选自s156d、s158d和t160d的一个或多个突变的seqidno:1或seqidno:3。
23.如实施方案20-22中任一项所述的方法，其中irf5是具有选自t10d、s158d、s309d、s317d、s451d和s462d的一个或多个突变的seqidno:2。
24.如实施方案20-23中任一项所述的方法，其中irf5是具有选自s425d、s427d、s430d和s436d的一个或多个突变的seqidno:4。
25.如实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf是选自seqidno:8和12的irf1。
26.如实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf是选自seqidno:11、16和17的irf8。
27.如实施方案26所述的方法，其中irf8是具有k310r突变的seqidno:11。
28.如实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf包括irf7/irf3融合蛋白，所述irf7/irf3融合蛋白包括n-末端irf7dna结合结构域(dbd)和组成型活性结构域(cad)以及c-末端irf3nes(核输出信号)和缔合结构域。
29.如实施方案28所述的方法，其中所述irf7/irf3融合蛋白还包括模拟所述irf3缔合结构域中的磷酸化的突变。
30.如实施方案28或29所述的方法，其中所述irf7/irf3融合蛋白列于seqidno:15中。
31.如实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒还包括编码ikkβ的核苷酸。
32.如实施方案31所述的方法，其中所述编码的ikkβ选自与seqidno:18-22具有>90％、>95％或大于98％同一性的序列。
33.如实施方案31或32所述的方法，其中所述编码的ikkβ选自seqidno:18-22。
34.如实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述核苷酸包括选自seqidno:23-44的序列。
35.如实施方案12-34中任一项所述的方法，其中所述靶向配体结合cd206、cd163或cd23。
36.如实施方案12-35中任一项所述的方法，其中所述靶向配体是二-甘露糖。
37.如实施方案31-36中任一项所述的方法，其中将所述编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸包封在同一纳米颗粒中。
38.如实施方案31-37中任一项所述的方法，其中将所述编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸包封在不同的纳米颗粒中。
39.如实施方案1-38中任一项所述的方法，其中改变免疫细胞的所述活化状态包括使免疫细胞群体中处于所述失活状态的免疫细胞的百分比降低5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。
40.如实施方案1-39中任一项所述的方法，其中改变免疫细胞的所述活化状态包括使免疫细胞群体中处于所述失活状态的免疫细胞的数量减少5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
41.如实施方案1-40中任一项所述的方法，其中改变免疫细胞的所述活化状态包括使免疫细胞群体中处于所述活化的状态的免疫细胞的百分比增加5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。
42.如实施方案1-41中任一项所述的方法，其中改变免疫细胞的所述活化状态包括使免疫细胞群体中处于所述活化的状态的免疫细胞的数量增加5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
43.如实施方案1至13中任一项所述的方法，其中将所述活化状态从活化的状态改变为失活状态。
44.如实施方案1-13和43中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包括巨噬细胞。
45.如实施方案1-13、43和44中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf是irf4。
46.如实施方案1-13和43-45中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒还包括编码糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链(gilz)的核苷酸。
47.如实施方案12和43-46中任一项所述的方法，其中所述靶向配体结合cd38、g蛋白偶联受体18(gpr18)、甲酰基肽受体2(fpr2)、cd64或cd68。
48.如实施方案1-13和43-47中任一项所述的方法，其中改变免疫细胞的所述活化状态包括使免疫细胞群体中处于所述活化的状态的免疫细胞的百分比降低5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。
49.如实施方案1-13和43-48中任一项所述的方法，其中改变免疫细胞的所述活化状态包括使免疫细胞群体中处于所述活化的状态的免疫细胞的数量减少5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
50.如实施方案1-13和43-49中任一项所述的方法，其中改变免疫细胞的所述活化状态包括使免疫细胞群体中处于所述失活状态的免疫细胞的百分比增加5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。
51.如实施方案1-13和43-50中任一项所述的方法，其中改变免疫细胞的所述活化状态包括使免疫细胞群体中处于所述失活状态的免疫细胞的数量增加5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
52.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括使所述受试者内肿瘤中的肿瘤相关巨噬细胞的活化状态从失活改变为活化的，从而治疗所述有需要的受试者的癌症。
53.如实施方案52所述的方法，其中所述肿瘤是卵巢癌肿瘤、成胶质细胞瘤肿瘤或转移性肺癌肿瘤。
54.如实施方案52或53所述的方法，其中所述改变在施用治疗有效量的纳米颗粒之后，所述纳米颗粒包括编码一种或多种转录因子的核苷酸，所述一种或多种转录因子将肿瘤相关巨噬细胞的所述活化状态从失活改变为活化的。
55.如实施方案54所述的方法，其中所述纳米颗粒包括带正电荷的核心、聚(β)-氨基酯核心、星形聚合物、聚谷氨酸包衣、透明质酸包衣、带中性电荷的包衣和/或脂质体纳米颗粒。
56.如实施方案54或55所述的方法，其中所述纳米颗粒<130nm。
57.如实施方案54-56中任一项所述的方法，其中所述核苷酸包括体外转录的mrna。
58.如实施方案54-57中任一项所述的方法，其中所述核苷酸被包封在核心内。
59.如实施方案54-58中任一项所述的方法，其中所述施用是局部施用。
60.如实施方案59所述的方法，其中所述局部施用是腹膜内或颅内施用。
61.如实施方案54-59中任一项所述的方法，其中所述施用是全身性施用。
62.如实施方案54-61中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种转录因子包括一种或多种干扰素调控因子(irf)。
63.如实施方案62所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf缺乏功能性自抑制结构域。
64.如实施方案62或63所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf缺乏功能性核输出信号(nes)。
65.如实施方案62-64中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf选自irf1、irf3、irf5、irf7、irf8和/或irf7和irf3的融合体。
66.如实施方案62-65中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf选自与seqidno:1-17具有>90％、>95％或大于98％同一性的序列。
67.如实施方案62-66中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf是选自seqidno:1-7的irf5。
68.如实施方案67所述的方法，其中irf5是seqidno:1。
69.如实施方案67或68所述的方法，其中irf5是具有选自s156d、s158d和t160d的一个或多个突变的seqidno:1或seqidno:3。
70.如实施方案67-69中任一项所述的方法，其中irf5是具有选自t10d、s158d、s309d、s317d、s451d和s462d的一个或多个突变的seqidno:2。
71.如实施方案67-70中任一项所述的方法，其中irf5是具有选自s425d、s427d、s430d和s436d的一个或多个突变的seqidno:4。
72.如实施方案62-71中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf是选自seqidno:8和12的irf1。
73.如实施方案62-72中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf是选自seqidno:11、16和17的irf8。
74.如实施方案73所述的方法，其中irf8是具有k310r突变的seqidno:11。
75.如实施方案62-74中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf包括irf7/irf3融合蛋白，所述irf7/irf3融合蛋白包括n-末端irf7dna结合结构域(dbd)和组成型活性结构域(cad)以及c-末端irf3nes(核输出信号)和缔合结构域。
76.如实施方案75所述的方法，其中所述irf7/irf3融合蛋白还包括模拟所述irf3缔合结构域中的磷酸化的突变。
77.如实施方案75或76所述的方法，其中所述irf7/irf3融合蛋白列于seqidno:15中。
78.如实施方案54-77中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒还包括编码ikkβ的核苷酸。
79.如实施方案78所述的方法，其中所述编码的ikkβ选自与seqidno:18-22具有>90％、>95％或大于98％同一性的序列。
80.如实施方案78或79所述的方法，其中所述编码的ikkβ选自seqidno:18-22。
81.如实施方案54-79中任一项所述的方法，其中所述核苷酸包括选自seqidno:23-44的序列。
82.如实施方案54-81中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒还包括靶向配体。
83.如实施方案82所述的方法，其中所述靶向配体连接至包衣。
84.如实施方案82或83所述的方法，其中所述靶向配体结合cd206、cd163或cd23。
85.如实施方案82-84中任一项所述的方法，其中所述靶向配体是二-甘露糖。
86.如实施方案54-85中任一项所述的方法，其中将所述编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸包封在同一纳米颗粒中。
87.如实施方案54-86中任一项所述的方法，其中将所述编码一种或多种irf和ikkβ的核苷酸包封在不同的纳米颗粒中。
88.如实施方案54-87中任一项所述的方法，其中改变巨噬细胞的所述活化状态包括使所述肿瘤内的巨噬细胞群体中处于所述失活状态的巨噬细胞的百分比降低5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。
89.如实施方案54-88中任一项所述的方法，其中改变巨噬细胞的所述活化状态包括使所述肿瘤内的巨噬细胞群体中处于所述失活状态的巨噬细胞的数量减少5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
90.如实施方案54-89中任一项所述的方法，其中改变巨噬细胞的所述活化状态包括使所述肿瘤内的巨噬细胞群体中处于所述活化的状态的巨噬细胞的百分比增加5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。
91.如实施方案54-90中任一项所述的方法，其中改变巨噬细胞的所述活化状态包括使所述肿瘤内的巨噬细胞群体中处于所述活化的状态的巨噬细胞的数量增加5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
92.如实施方案54-91中任一项所述的方法，所述方法还包括与治疗有效量的纳米颗粒组合施用选自以下的疗法：癌症疫苗、嵌合抗原受体(car)免疫疗法、化学疗法、放射疗法、激素疗法、信号转导抑制剂、基因表达调节剂、细胞凋亡诱导剂、血管生成抑制剂和递送毒性分子的单克隆抗体。
93.一种治疗有需要的受试者的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括使所述受试者内的巨噬细胞的活化状态从活化的改变为失活的，从而治疗有需要的受试者的自身免疫性疾病。
94.如实施方案93所述的方法，其中所述自身免疫性疾病包括急性坏死性出血性脑病、变应性哮喘、斑秃、贫血、口疮性溃疡、关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎)、哮喘、自身免疫性甲状腺炎、结膜炎、克隆氏病、皮肤型红斑狼疮、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、糖尿病(diabetes)、糖尿病(diabetesmellitus)、麻风结节性红斑、角膜结膜炎、多发性硬化症、重症肌无力、银屑病、硬皮病、薛格连氏综合征(包括继发于薛格连氏综合征的干燥性角膜结膜炎)、史蒂文斯—约翰逊综合征、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、阴道炎和韦格纳氏肉芽肿病。
95.如实施方案93或94所述的方法，其中所述改变在施用治疗有效量的纳米颗粒之后，所述纳米颗粒包括编码一种或多种转录因子的核苷酸，所述一种或多种转录因子将巨噬细胞的所述活化状态从活化的改变为失活的。
96.如实施方案94所述的方法，其中所述纳米颗粒包括带正电荷的核心、聚(β)-氨基酯核心、星形聚合物、聚谷氨酸包衣、透明质酸包衣、带中性电荷的包衣和/或脂质体纳米颗粒。
97.如实施方案94或95所述的方法，其中所述纳米颗粒<130nm。
98.如实施方案95-97中任一项所述的方法，其中所述核苷酸包括体外转录的mrna。
99.如实施方案95-98中任一项所述的方法，其中所述核苷酸被包封在核心内。
100.如实施方案95-99中任一项所述的方法，其中所述施用是局部施用。
101.如实施方案100所述的方法，其中所述局部施用是腹膜内或颅内施用。
102.如实施方案92-99中任一项所述的方法，其中所述施用是全身性施用。
103.如实施方案95-102中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种转录因子包括一种或多种干扰素调控因子(irf)。
104.如实施方案103所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf缺乏功能性自抑制结构域。
105.如实施方案103或104所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf缺乏功能性核输出信号(nes)。
106.如实施方案103-105中任一项所述的方法，其中所述编码的一种或多种irf是irf4。
107.如实施方案95-106中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒还包括编码糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链(gilz)的核苷酸。
108.如实施方案85-107中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒还包括靶向配体。
109.如实施方案108所述的方法，其中所述靶向配体连接至包衣。
110.如实施方案108或109所述的方法，其中所述靶向配体结合cd38、g蛋白偶联受体18(gpr18)、甲酰基肽受体2(fpr2)、cd64或cd68。
111.如实施方案93-110中任一项所述的方法，其中改变巨噬细胞的所述活化状态包括使巨噬细胞群体中处于所述活化的状态的巨噬细胞的百分比降低5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。
112.如实施方案93-111中任一项所述的方法，其中改变巨噬细胞的所述活化状态包括使巨噬细胞群体中处于所述活化的状态的巨噬细胞的数量减少5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
113.如实施方案95-112中任一项所述的方法，其中改变巨噬细胞的所述活化状态包括使巨噬细胞群体中处于所述失活状态的巨噬细胞的百分比增加5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。
114.如实施方案95-113中任一项所述的方法，其中改变巨噬细胞的所述活化状态包括使巨噬细胞群体中处于所述失活状态的巨噬细胞的数量增加5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
115.一种包括纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括编码一种或多种干扰素调控因子(irf)的核苷酸。
116.如实施方案115所述的组合物，所述组合物还包括药学上可接受的载体。
117.如实施方案115或116所述的组合物，其中所述纳米颗粒包括带正电荷的核心、聚(β)-氨基酯核心、星形聚合物、聚谷氨酸包衣、透明质酸包衣、带中性电荷的包衣和/或脂质体纳米颗粒。
118.如实施方案115-117中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒<130nm。
119.如实施方案115-118中任一项所述的组合物，其中所述核苷酸包括体外转录的mrna。
120.如实施方案115-119中任一项所述的组合物，其中所述核苷酸被包封在核心内。
121.如实施方案115-120中任一项所述的组合物，其中所述编码的一种或多种irf缺乏功能性自抑制结构域。
122.如实施方案115-121中任一项所述的组合物，其中所述编码的一种或多种irf缺乏功能性核输出信号(nes)。
123.如实施方案115-122中任一项所述的组合物，其中所述编码的一种或多种irf选自irf1、irf3、irf5、irf7、irf8和/或irf7和irf3的融合体。
124.如实施方案115-123中任一项所述的组合物，其中所述编码的一种或多种irf选自与seqidno:1-17具有>90％、>95％或大于98％同一性的序列。
125.如实施方案115-124中任一项所述的组合物，其中所述编码的一种或多种irf是选自seqidno:1-7的irf5。
126.如实施方案125所述的组合物，其中irf5是seqidno:1。
127.如实施方案125或126所述的组合物，其中irf5是具有选自s156d、s158d和t160d的一个或多个突变的seqidno:1或seqidno:3。
128.如实施方案125-127中任一项所述的组合物，其中irf5是具有选自t10d、s158d、s309d、s317d、s451d和s462d的一个或多个突变的seqidno:2。
129.如实施方案125-128中任一项所述的组合物，其中irf5是具有选自s425d、s427d、s430d和s436d的一个或多个突变的seqidno:4。
130.如实施方案115-129中任一项所述的组合物，其中所述编码的一种或多种irf是选自seqidno:8和12的irf1。
131.如实施方案115-130中任一项所述的组合物，其中所述编码的一种或多种irf是选自seqidno:11、16和17的irf8。
132.如实施方案131所述的组合物，其中irf8是具有k310r突变的seqidno:11。
133.如实施方案115-132中任一项所述的组合物，其中所述编码的一种或多种irf包括irf7/irf3融合蛋白，所述irf7/irf3融合蛋白包括n-末端irf7dna结合结构域(dbd)和组成型活性结构域(cad)以及c-末端irf3nes(核输出信号)和缔合结构域。
134.如实施方案133所述的组合物，其中所述irf7/irf3融合蛋白还包括模拟所述irf3缔合结构域中的磷酸化的突变。
135.如实施方案133或134所述的组合物，其中所述irf7/irf3融合蛋白列于seqidno:15中。
136.如实施方案115-135中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒还包括编码ikkβ的核苷酸。
137.如实施方案136所述的组合物，其中所述编码的ikkβ选自与seqidno:18-22具有>90％、>95％或大于98％同一性的序列。
138.如实施方案136或137所述的组合物，其中所述编码的ikkβ选自seqidno:18-22。
139.如实施方案115-138中任一项所述的组合物，其中所述核苷酸包括选自seqidno:23-44的序列。
140.如实施方案115-139中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒还包括携带一种或多种选自以下的抗癌基因的核苷酸：p53、rb、brca1、e1a、bcl-2、mdr-1、p21、p16、bax、bcl-xs、e2f、igf-ivegf、血管抑素、制瘤素、内皮抑素、gm-csf、il-12、il-2、il-4、il-7、ifn-γ、tnfα和/或hsv-tk。
141.如实施方案115-122中任一项所述的组合物，其中所述编码的一种或多种irf是irf4。
142.如实施方案115-122和141中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒还包括编码糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链(gilz)的核苷酸。
143.如实施方案115-142中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒还包括靶向配体。
144.如实施方案143所述的组合物，其中所述靶向配体连接至包衣。
145.如实施方案143或144所述的组合物，其中所述靶向配体结合cd206、cd163或cd23。
146.如实施方案145所述的组合物，其中所述靶向配体是二-甘露糖。
147.如实施方案143或144所述的组合物，其中所述靶向配体结合cd38、g蛋白偶联受体18(gpr18)、甲酰基肽受体2(fpr2)、cd64或cd68。
148.如实施方案115-147中任一项所述的组合物，其中所述编码一种或多种irf、ikkβ和/或gilz的核苷酸被包封在同一纳米颗粒中。
149.如实施方案115-148中任一项所述的组合物，其中所述编码一种或多种irf、ikkβ和/或gilz的核苷酸被包封在不同的纳米颗粒中。
实施例1.材料和方法。pbae合成。先前描述了用于合成聚合物的方法(mangravitia等人(2015)acsnano9:1236-1249)。将1,4-丁二醇二丙烯酸酯与4-氨基-1-丁醇以二丙烯酸酯与胺单体的1:1摩尔比混合。通过在搅拌下将混合物加热至90℃持续24小时来形成丙烯酸酯封端的聚(4-氨基-1-丁醇-共-1,4-丁二醇二丙烯酸酯)。将2.3g的这种聚合物溶解在2ml四氢呋喃(thf)中。为了形成哌嗪-封端的447聚合物，将在13mlthf中的786mg1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪添加至聚合物/thf溶液中，并在室温(rt)下搅拌2小时。用5体积的二乙醚使封端的聚合物沉淀，用2体积的新鲜醚洗涤，并在真空下干燥1天。将纯净的聚合物溶解在二甲亚砜(dmso)中至100mg/ml的浓度，并在-20℃下储存。
pga与二-甘露糖缀合。将α-d-甘露吡喃糖基-(1→2)-α-d-甘露吡喃糖(二-甘露糖，omicronbiochemicalsinc.)修饰成糖胺，然后与聚谷氨酸(pga)缀合。首先，将二-甘露糖(157mg)溶解于10.5ml饱和碳酸铵水溶液中，然后在rt下搅拌24小时。在第二天，添加更多的固体碳酸铵，直到二-甘露糖从反应溶液中沉淀出来。搅拌混合物直至如通过tlc测量完成，然后冻干以除去过量的碳酸铵。通过将固体重新溶解在甲醇中来完全除去挥发性盐。这些程序在异头碳上生成胺，以备将来与pga缀合。
为了将胺化的二-甘露糖缀合至pga，将底物溶解于水中至30mgm/l，然后超声处理10分钟。添加乙基-n’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·hcl水溶液(4mg/ml，30当量)，在rt下混合4min。将n-羟基磺基琥珀酰亚胺水溶液(30mg/ml，35当量)与pga/edc溶液一起孵育1分钟。将磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的胺化二甘露糖与所得的活化pga以44:1摩尔比合并，并在rt下混合6h。通过用水透析24小时除去过量试剂。
mrna合成。将egfp、irf5和ikk(trilinkbiotechnologies)的密码子优化的mrna用抗反向帽类似物3′-o-me-m7g(5')ppp(5')g(arca)加帽，并用经修饰的核糖核苷酸假尿苷(ψ)和5-甲基胞苷(m5c)完全取代。
纳米颗粒制备。将irf5和ikkβmrna以3:1(w:w)的比率合并，并在25mm乙酸钠(naoac)缓冲液(ph＝5.2)中稀释至100μg/ml。同样在naoac缓冲液中，将dmso中的聚(β-氨基酯)-447(pbae-447)聚合物(如上所述制备)从100μg/μl稀释至6μg/μl。为了形成纳米颗粒，将pbae-447聚合物以60:1(w:w)的比率添加至mrna中，并立即以中等速度涡旋15秒，然后将混合物在rt下孵育5min以允许形成pbae-mrna聚合复合物。在下一步骤中，将naoac缓冲液中的100μg/mlpga/二-甘露糖添加至所述聚合复合物溶液，以中等速度涡旋15秒，且在室温下孵育5min。在此过程中，pga/二-甘露糖包被pbae-mrna聚合复合物的表面以形成最终的np。为了长期储存，将d-蔗糖(60mg/ml)作为防冻剂添加到np溶液中。将纳米颗粒在干冰中速冻，然后冻干。将干燥的np储存在-20℃或-80℃下直至使用。对于体内实验，将冻干的np以1:20(w:v)的比率重新悬浮在水中。
纳米颗粒粒度分布和ζ电位的表征。在25℃下使用zetapals仪器(brookhaveninstrumentcorporation)对np的物理化学性质(包括流体动力学半径、多分散性、ζ电位和稳定性)进行了表征。为了基于动态光散射测量流体力学半径和多分散性，将np在25mmnaoac(ph＝5.2)中稀释5倍。为了测量ζ电位，将np在10mmpbs(ph＝7.0)中稀释10倍。为了评估np的稳定性，将刚刚制备的颗粒在10mmpbs缓冲液(ph＝7.4)中稀释。每10分钟一次测量np的流体动力学半径和多分散性持续5小时，并使用nanosite300仪器(malvern)从颗粒追踪分析中得出它们的大小和颗粒浓度。为了使用透射电子显微镜表征np，遵循先前描述的方案(smithtt等人(2017)natnanotechnol12:813-820)。将刚刚制备的np(25μl，含0.83μg的mrna)沉积在辉光放电处理的200目碳/formvar涂覆的铜网格上。在30秒后，依次用50％karnovsky固定剂、0.1m椰油酸酯缓冲液、dh2o、然后1％(w/v)乙酸双氧铀处理网格。将样品用在120kv下操作的jeoljem-1400透射电子显微镜(jeolusa)成像。
骨髓来源的巨噬细胞(bmdm)和其他细胞系。为了制备bmdm，按照既定方案从小鼠股骨收获骨髓祖细胞(zhangx等人(2008)currprotocimmunol第14章:第1411单元)。将这些细胞以0.5–1.0e6/ml的接种密度在完全培养基[dmem，补充有4.5g/ld-葡萄糖、l-谷氨酰胺、10％热失活的胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素和100μg/ml、glutamax50ml/500ml，补充有20ng/mlm-csf(peprotech，目录号315-02)]中培养。使细胞在37℃、5％co2下离体分化为bmdm持续7天。接下来，将它们用巨噬细胞条件培养基[补充有20ng/mlmpla(sigma，目录号l6895)或20ng/mlil4(ebioscience，目录号34-8041)的巨噬细胞完全培养基]进行调理。bmdm在离体7-21天之间使用。将鼠卵巢癌细胞系id8(来自katherineroby博士(universityofkansasmedicalcenter,kansascity,ks)的赠予)在补充有10％fbs、100u/ml青霉素、5μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白和5ng/ml亚硒酸钠(全部sigma-aldrich)的dmem中培养。为了产生更具侵袭性的表达血管内皮生长因子(vegf)的id8菌株，将id8肿瘤细胞用编码鼠vegf的puno1质粒(invivogen)和杀稻瘟菌素抗性基因进行转染。为了获得稳定的转染子，将肿瘤细胞在含有10μg/ml杀稻瘟素(invivogen)的完全培养基中培养3周。将b16f10黑素瘤细胞系(美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection))在具有10％fbs,100u/ml青霉素、2mm/l-谷氨酰胺、1.5g/l碳酸氢钠、4.5g/l葡萄糖、10mmhepes、1.0mm丙酮酸钠和0.05mm2-巯基乙醇的完全rpmi1640培养基中培养。对于体内生物发光成像，使用萤火虫荧光素酶逆转录病毒转导id8-vegf和b16f10细胞系两者。在39℃、5％co2下，将携带racs-pdgfβ或rcas-cre逆转录病毒的df-1细胞系在补充有10％fbs和100u/ml青霉素的完全培养基中培养。
bmdm的mrna转染。在转染前一天，将bmdm以250,000个/孔的浓度在24孔板上重新接种于巨噬细胞完全培养基中。在转染前，将完全培养基替换为300μl未补充的dmem。为了转染这些细胞，将含有2μgmrna的np添加到基础培养基中，并与bmdm一起在37℃下共培养。在1小时后，除去含有np的培养基，并将细胞再培养24小时，之后评价转染效率和细胞存活力。
转染bmdm用于巨噬细胞标签基因分析。在转染前24小时，将bmdm在24孔板上重新接种于条件培养基中，从而使细胞转化为它们的表型。然后按照上述转染方案，然后将m2样巨噬细胞暴露于携带25％egfpmrna作为报告基因的irf5/ikkβnp或含有2μgmrna的egfpnp(对照)。在24小时后，在转染后24小时对前10％高度转染的bmdm(如通过egfp表达所测量)进行分选，并在低剂量(10ng/ml)il4培养基中再次激发48小时，之后分离rna。将从这些细胞提取的rna与来自标准m1或m2样巨噬细胞的那些rna进行比较，以使得能够鉴定与irf5-np处理相关的标签基因。
rna分离和制备。为了收获rna，将bmdm溶解在trizol试剂(ambion)中，并使用
通过nanostring技术进行的巨噬细胞标签基因分析。使用
流式细胞术和细胞分选。使用图9中列出的抗小鼠抗体探针，通过流式细胞术用骨髓样和淋巴样免疫分型小组对从脾、血液、腹膜灌洗液和支气管肺泡灌洗液获得的细胞进行分析。使用运行facsdiva软件的bdlsrfortessa分析仪(becktondickinson)收集数据。使用bdfacsariaii对cd11b+和f4/80+腹膜巨噬细胞进行分选。使用flowjo10.0软件分析所有收集的数据。
细胞因子分析。在fhcrc免疫监测共享资源中心使用luminex200系统(luminex)评价了细胞因子水平。对于离体研究，收集细胞培养上清液以测量il-6、il-12p70、infγ和tnfα浓度。对于体内研究，测量了gm-csf、infγ、il-12p70、il-2、il-6和tnfα的血浆浓度。
qrt-pcr分析。通过qrt-pcr确定基因表达水平。为了测量选定的巨噬细胞标签基因(serpinb2、retnla、ccl5、ccl11、密码子优化的irf5、内源性irf5和管家gapd基因)，根据制造商的说明书，使用rneasy微型柱(qiagen)分离了总rna。使用qscriptcdna合成试剂盒(quanta)合成了cdna。对于每个样品，使用来自roche通用探针库(upl)的基因特异性探针和通过probefinder(roche)优化的pcr引物，经由perfectaqpcrsupermixlowrox(quanta)一式三份进行qrt-pcr：serpinb2、upl-049、f-actggggcagttatgacagg(seqidno:96)、r-gatgatcggccacaaactg(seqidno:97)；retnla、upl-078、f-ttgttcccttctcatctgcat(seqidno:98)、r-ccttgaccttattctccacga(seqidno:99)；ccl5、upl-105、f-cctactcccactcggtcct(seqidno:100)、r-ctgatttcttgggtttgctgt(seqidno:101)；ccl11、upl-018、f-agagctccacagcgcttc(seqidno:102)、r-cagcacctgggaggtgaa(seqidno:103)；密码子优化的irf5、upl-022、f-tcttaaagaccacatggtagaacagt(seqidno:104)、r-agctgctgttgggattgc(seqidno:105)；内源性irf5、upl-011、f-gctgtgcccttaacaaaagc(seqidno:106)、r-ggctgaggtggcatgtct(seqidno:107)。将标签基因mrna水平基于gapd、upl-060、f-agccacatcgctcagacac(seqidno:108)和r-gcccaatacgaccaaatcc(seqidno:109)的扩增进行标准化。使用运行quantstudio6软件的quantstudio5rt-pcr机器(appliedbiosystems)进行所有qrt-pcr反应。如果扩增图未跨越阈值且未获得ct值(“未确定”)，则将等于测定中的最高循环数(40个循环)的ct值用于比较相对表达。
小鼠和体内肿瘤模型。除了脑肿瘤模型有关的实验外，这些实验中使用的小鼠是从jacksonlaboratory获得；其他小鼠在fhcrc动物设施中繁殖和圈养。所有小鼠均在所述中心的机构动物护理和使用委员会批准的方案背景下使用。为了对卵巢肿瘤建模，将5×106个表达血管上皮生长因子(vegfp)的id8细胞腹膜内(i.p.)注射到4至6周龄的雌性白化病b6(c57bl/6j-tyr<c-2j>)小鼠中并允许建立2周。对于存活研究，将动物用携带50μgmrna的irf5nps/egfpnp进行腹膜内处理(每周两个剂量，持续9周，或直到健康状况达到安乐死要求为止)。对于机制研究，使用1、2或3周的处理，然后在最后一次剂量后48小时实施安乐死。进行腹膜灌洗以收集腹膜细胞。为了比较irf5/ikkβnp与现状巨噬细胞靶向疗法的疗效，一组小鼠接受携带50μgmrna的irf5/ikkβnp处理且持续3周，每周2个剂量；第二组接受15mg/kg在媒介物(聚乙二醇400中的5％1-甲基-2-吡咯烷酮)中配制的pi3kγ抑制剂ipi-594(medkoobiosciencesinc)的口服管饲且持续3周；第三组接受30mg/kg在同一媒介物中配制的csf1r抑制剂吡昔替尼(pexidartinib)(plx3397，medkoobiosciencesinc)的腹膜内注射，每天一次持续3周。
为了对转移性肺癌进行建模，将用f-luc转导并悬浮在200μlrpmi培养基中的2.5×104个16f10细胞注射到4至6周龄雌性白化病b6(c57bl/6j-tyr<c-2j>)小鼠(jacksonlaboratories)中并允许建立1周。对于存活研究，将小鼠用(或不用)悬浮在pbs中的携带30μgmrna的irf5/ikkβ或egfpnp进行了眼眶后处理。将小鼠用3个剂量/周进行处理且持续3周或直至健康状况达到安乐死的要求。对于机制研究，小鼠接受了相同的处理且持续2周。进行支气管肺泡灌洗以收集肺泡细胞用于分析。
按照公布的方案产生携带神经胶质瘤的小鼠(uhrboml等人(2004)natmed10:1257-1260)。将产生rcas-pdgfβ和rcas-cre逆转录病毒的禽df-1细胞颅内注射到介于4-6周龄之间的nestin-tv-a/ink4a-arf-/-；pten-/-小鼠(c57bl/6)两个脑半球中(坐标：尾侧距前囟1mm，侧面距硬脑膜表面2mm、深度距硬脑膜表面2mm)。允许肿瘤建立2周。在第15天，小鼠一个半球接受10戈瑞(gy)辐射，而未被辐射的半球用铅屏蔽。第二天，小鼠接受携带30μgmrna的irf5/ikkβnp(3个剂量/周，持续3周)的眼眶后注射，或分配给pbs对照组。
体内生物发光成像。pbs(15mg/ml)中的d-荧光素(xenogen)用作萤火虫荧光素酶成像的底物。用xenogenivis光谱成像系统(xenogen)采集生物发光图像。在成像之前和期间，将小鼠用2％异氟烷(forane，baxterhealthcare)麻醉。对于id8-vegf卵巢肿瘤，将每只小鼠腹膜内注射300μg的d-荧光素，并且10分钟后采集图像。对于b16f10肺转移性肿瘤，将小鼠腹膜内注射3mg的d-荧光素，并在15分钟后采集图像。对于脑肿瘤模型，小鼠接受了75mg/kg体重的d-荧光素的眼眶后注射，并在4分钟后采集图像。采集时间在10s至5min的范围内。
生物分布分析。为了确定irf5np在id8-vegf卵巢肿瘤模型中的生物分布，7-8组小鼠接受了腹膜内或眼眶后剂量的携带50μgmrna的np。在注射后二十四小时，收集全血，并用co2对小鼠实施安乐死以取回器官(肝、脾、肺、肾、心脏、肠、胰腺和膈肌)。将所有组织用rnalater稳定，然后在干冰上冷冻。使用rt-qpcr测量每个器官中密码子优化的irf5mrna水平。
毒性分析。为了测量重复输注靶向巨噬细胞的np的潜在体内毒性，在3周的过程中向小鼠(5只/组)静脉内注射了连续6个剂量的携带50μgmrna的irf5/ikkβ或egfpnp。对照没有接受处理。最后一次输注后24小时，将小鼠麻醉并通过眼眶后放血收集血液以测定全血细胞计数。还收集血液用于血清化学和细胞因子谱分析(由phoenixcentrallaboratories,mukilteo,wa进行)。然后用co2使动物安乐死以取回器官，将所述器官用去离子水洗涤，然后固定在4％多聚甲醛中。对组织进行常规处理，并用苏木精和曙红对切片染色。标本由董事会认证的工作人员病理学家dr.smithapillaimvsc博士,dacvp以设盲方式进行解释。
细胞因子测定。在fhcrc免疫监测共享资源中心使用luminex200系统(luminex)评价了细胞因子水平。对于离体研究，收集细胞培养上清液以测量il-6、il12p70、infγ和tnfα浓度。对于体内研究，测量了gm-csf、infγ、il-12p70、il-2、il-6和tnfα的血浆浓度。
统计分析。使用未配对的双尾单向anova检验分析观察到的差异的统计显著性。图或图例中列出了每次测量的p值。使用对数秩检验来表征存活数据。所有统计分析均使用graphpadprism软件6.0版或r软件进行。
结果。设计np以精心设计tam的ivtmrna转染。开发了靶向mrna递送系统，所述系统可通过利用阳离子聚(β-氨基酯)(pbae)聚合物与阴离子mrna之间的静电相互作用在靶向细胞中引入稳健的基因表达(图2a)。为了改进包封在所得纳米载体中的mrna的稳定性和翻译，使用并入经修饰的核糖核苷酸假尿苷(ψ)(karikok等人(2008)molther16:1833-1840)和5-甲基胞苷(m5c)并用arca(抗反向帽类似物)加帽的信使的合成型式(quabiuses等人(2015)nbiotechnol32:229-235)。通过水解裂解pbae主链中的酯键来从mrna-pbae复合物中细胞内释放mrna。使用这种系统先前已证明了高效的体内t细胞转染(smithtt等人(2017)natnanotechnol)。为了将纳米颗粒靶向tam以及使所述纳米颗粒所含的mrna-pbae复合物进一步稳定，使用聚谷氨酸(pga)作为接头将二-甘露糖部分工程改造至所述纳米颗粒的表面上(图2a)。利用简单的两步骤、电荷驱动的自组装过程制造np。首先，将合成mrna与带正电荷的pbae聚合物复合，从而将mrna缩合成纳米级复合物。此步骤之后是添加用二-甘露糖官能化的pga，这屏蔽pbae-mrna颗粒的正电荷并赋予巨噬细胞靶向性。所得的mrna纳米载体具有99.8±24.5nm的大小、0.183的多分散度以及中性表面电荷(3.40±2.15mvζ-电位，图2b-2c)。首先使用由绿色荧光蛋白编码mrna配制的np(gfp-np)在鼠骨髓来源的巨噬细胞(bmdm)中测试转染效率。简言之，将50,000个bmdm暴露于含有1μgmrna的np中达1小时，然后在第二天进行gfp表达的流式细胞术测量。在单次np施加后，常规转染了这些原代巨噬细胞的31.9％(±8.5％)而不降低它们的存活力(图2e-2f)。用二-甘露糖对颗粒进行的表面修饰有重大关系，因为在这种固有吞噬细胞类型中，使用未靶向(但包被有pga)的纳米载体的转染率下降到25％(±2.1％)的平均值。np选择性地靶向cd11b+、f4/80+巨噬细胞群体，其中46％的巨噬细胞已被转染并表达高水平的egfp(图2d)。这种高转染效率证明了所公开的系统和方法在将mrna靶向递送至tam中的效力。基于体外筛选诱导巨噬细胞极化的转录因子候选物的结果，选择了两种mrna用于包括在np中：第一种编码irf5(irf家族的有利于巨噬细胞朝向m1表型极化的关键成员)，并且第二种编码ikkβ(磷酸化并活化irf5的激酶)。
将免疫抑制巨噬细胞编程为促炎性表型。为了诱导巨噬细胞极化，选择了两种mrna用于包括在np中：第一种编码irf5(干扰素调控因子家族的有利于巨噬细胞朝向m1表型极化的关键成员)(krausgrubert等人(2011)natimmunol12:231-238)；第二种编码ikkβ(磷酸化并活化irf5的激酶(renj等人(2014)procnatlacadsciusa111:17438-17443)。使用3个irf5mrna对1个ikkβmrna的比率。使用对np递送(且密码子优化)的irf5mrna具有特异性的实时定量pcr，发现巨噬细胞中的mrna表达在第1天最大，从而导致irf5相对于内源性因子水平增加1,500倍(图2a)。如所预期，基因表达是瞬时的，但irf5水平直至返回基线之前的第3天(增加了581倍)和第5天(增加了87倍)保持明显上调。
为了确定编码irf5/ikkβ的np是否能够将m2巨噬细胞重编程为治疗上令人希望的抗癌m1表型，使用了nanostring基因表达分析。首先在白介素4(il-4)存在下培养bmdm，以诱导抑制性m2表型(图2h)。用对照gfp-mrna纳米颗粒或含irf5/ikkβmrna的np转染后，分析基因表达谱并将其与炎症性巨噬细胞进行比较，所述炎症性巨噬细胞是通过将bmdm暴露于tlr4激动剂单磷酰基脂质a单独产生的。尽管在含抑制性il-4的培养基中培养，但用irf5/ikkβmrnanp转染的巨噬细胞显示出与炎症性巨噬细胞相似的基因表达谱(图2i)。标签m2巨噬细胞基因，如serpinb2和ccl2(jablonskik等人(2015)plosone10:e0145342；vargat等人(2016)jimmunol196:4771-4782)在关键m1分化基因如ccl5(sicaa等人(2012)jclininvest122:787-795)上调时显著下调(图2j，2k)。这些数据确立，np介导的irf5及其激酶的表达使抑制性巨噬细胞偏向促炎性表型。
实施例2.np递送的促m1基因对播散性卵巢癌的治疗作用。为了在临床相关的体内测试系统中评价这种治疗方法，使用了在c57bl/6小鼠中重演晚期、不可切除的卵巢肿瘤的模型；向这些动物注射了id8卵巢癌细胞，所述id8卵巢癌细胞用荧光素酶标记以实现肿瘤生长的系列生物发光成像(liaojb等人(2015)jimmunothercancer3:16；stephansb等人(2015)natbiotechnol33:97-101)。允许肿瘤建立两周。到此阶段，小鼠在整个腹膜壁和肠系膜中都发展出了结节。将动物分为3个组，其接受pbs(对照)、gfpnp(假的)或以100μgmrna/小鼠/周的腹膜内剂量持续9周的irf5/ikkβnp处理(图4a)。观察到在irf5/ikkβnp处理组中，疾病消退并且最终在40％的动物中被清除(中值存活期总体142天，对比对照组的60天；图4b-4c)。为了解irf5/ikkβnp介导的抗肿瘤作用的潜在机制，首先检查了甘露糖受体靶向性限制np与吞噬细胞的相互作用的排他性程度。在第一剂量的用二-甘露糖靶向的np后24小时收集的腹膜灌洗液的流式细胞术揭示优先基因转移到巨噬细胞和单核细胞中(平均值分别为37.1％和15.3％，图4d)，而至脱靶细胞中的转染则很少或检测不到。接下来在3周内(两次每周一次注射)用irf5/ikkβ纳米颗粒或pbs处理后，对患有确立的卵巢癌的小鼠腹膜中巨噬细胞/单核细胞群体进行了详细的表型和功能分析。流式细胞术分析揭示，irf5/ikkβnp将免疫抑制性巨噬细胞群体(ly6c-、f4/80+、cd206+)减少至平均2.6％±2.1％对比对照组43％±15.6％(图4e-4f)。相反，m1样巨噬细胞的分数从0.5％±0.2％增加至10.2％±4.1％(图4e，4g)。irf5基因疗法也影响了其他免疫细胞的群体。特别地，炎症性单核细胞(cd11b+、ly6c+、ly6g-)更丰富(73.4％±3.6％，相比之下未处理的小鼠中为4.5％±1.9％)。在所有用irf5np处理的动物中，令人感兴趣的一个发现是在赘瘤内或周围存在淋巴细胞的多灶性密集簇(图4h)，从而表明免疫刺激性巨噬细胞的遗传编程可恢复淋巴细胞迁移和浸润到实体瘤中。
通过荧光活化细胞分选分离腹膜巨噬细胞以分析它们的细胞因子分泌，并检测到促炎性(抗肿瘤)细胞因子il-12(高3.4倍)、ifn-g(高8.4倍)和tnf-α(高1.5倍)释放的稳健增加，而与朝向交替活化的(m2样)巨噬细胞分化相关的调控性细胞因子il-6的水平降低97倍；图4i)。基因组表达谱分析证实在irf5/ikkβ纳米颗粒处理的小鼠中朝向m1样巨噬细胞表型的分化。包括在mpla或il-4中离体培养的巨噬细胞的基因表达水平，以分别提供经典m1样或m2样巨噬细胞的参考值(图4j)。
生物分布和安全性。接下来在腹膜内注射后24小时，使用被设计为仅检测递送纳米颗粒(密码子优化)的irf5的rt-qpcr测定法对纳米颗粒在各个器官中的分布进行了定量。位于腹膜内的器官(包括肝、脾、肠、胰腺和膈肌)中发现了最高浓度的ivtmrna(图5a)。位于腹膜外部的器官(心脏、肺、肾)中检测到少量的颗粒递送的mrna，从而表明腹膜内注射的纳米载体的一部分进入全身循环。在分布数据的指导下，接下来评估这些纳米试剂是否具有生物相容性以及对于重复给药是否安全。向小鼠注射了总计8个剂量的irf5/ikkβnp(两个50μgmrna剂量/周持续4周，图5b)。在最终剂量后24小时对它们进行安乐死，记录体重，通过眼眶后放血收集血液以进行血清化学分析，并进行完整的大体尸检。组之间没有体重差异。由董事会认证的工作人员病理学家对以下组织进行了评价：肝、脾、肠系膜、胰腺、胃、肾、心脏和肺。组织病理学评价揭示在所有情况下肿瘤病变内或周围的淋巴细胞多灶性致密簇，但在不存在赘瘤性细胞的组织中未观察到炎症或症状明显的坏死的迹象(图5c)。此外，irf5/ikkβnp处理的小鼠的血清化学性质与pbs对照的血清化学性质相当，从而表明没有发生全身性毒性(图5d)。由于在生物分布研究中全身检测到少量irf5-mrna，因此设计了平行实验来定量外周血中的炎症性细胞因子。在单次腹膜内注射irf5/ikkβnp后，测量到白细胞介素6(il-6)的血清水平中等且短暂增加至26.8pg/ml的平均值(图5e)并且肿瘤坏死因子-a(tnf-a)中等且短暂增加至平均94.7pg/ml(图5f)。基于先前报告，这些水平比与病理学发现相关的那些水平低500倍，并且因此可被认为是安全的tarrantj.m.(2010)toxicolsci117:4-16；copelands等人.(2005)clindiagnlabimmunol12:60-67)。
通过静脉内输注irf5/ikkβ纳米颗粒来控制全身性肿瘤转移。基于直接向腹膜腔内施用irf5/ikkβnp以治疗遍布整个腹膜的肿瘤病变所实现的治疗应答，下一个问题是静脉内输注的mrna纳米载体是否能够系统性地使巨噬细胞编程以控制播散性疾病。rt-qpcr生物分布研究揭示，静脉内输注的纳米载体优先将它们的mrna货物递送至具有大量常驻巨噬细胞/吞噬细胞的器官(主要是脾、肝和肺)(图6a)。为了在临床上相关的体内测试系统中测量抗肿瘤应答，将含有irf5/ikkβmrna的颗粒施用至患有播散性肺部黑素瘤转移的小鼠中(图6b)。最近的工作描述单核细胞和巨噬细胞在建立由这种疾病引起的转移中的基础作用(butlerkl等人(2017)scirep7:45593；nielsensr等人(2017)mediatorsinflamm2017:9624760)，并且通过共聚焦显微术证实肿瘤植入与肺中吞噬细胞累积相协调(图6c)。通过生物发光成像确定肿瘤负担，并将具有可检测癌症的小鼠分选为具有匹配水平的组。然后将各组随机分配至处理条件、不接受疗法(pbs)或静脉内注射gfp或irf5/ikkβ包封的纳米颗粒。只有irf/ikkβ纳米颗粒疗法显著减少了肺部肿瘤负担；实际上，它们将整体存活率平均提高了1.3倍(图6d-6e)。在平行实验中，在肿瘤接种22天后处死小鼠，以验证具有肺转移计数的生物发光肿瘤信号并通过流式细胞术评估巨噬细胞极化。irf5/ikknp处理的动物的肺中转移的总数与pbs对照(平均419±139个转移)相比，减少了8.7倍(平均40±16个转移)(图6f-6g)。支气管肺泡灌洗液细胞的流式细胞术揭示从免疫抑制性(cd206+、mhcii-、cd11c+、cd11b低)巨噬细胞朝向活化的(cd206-、mhcii+、cd11c-、cd11b+)吞噬细胞的明显转变(图6h-6i)。
使肿瘤抑制性吞噬细胞编程以治疗神经胶质瘤。对于第三体内测试系统，对神经胶质瘤进行了检查，所述神经胶质瘤是难以控制的癌症类型，其中m2样巨噬细胞代表了大多数非赘瘤细胞并促进肿瘤生长和侵袭(hambardzumyand等人(2016)natneurosci19:20-27)。目前，这种疾病的护理标准是放射疗法，不幸的是，所述放射疗法仅提供暂时的稳定或症状减轻，并将中值存活期延长3个月(mannj等人(2017)frontneurol8:748)。为了重演疾病的遗传事件和随后的分子进化，使用了pdgfβ驱动的神经胶质瘤的rcas-pdgf-b/nestin-tv-a；ink4a/arf-/-；pten-/-转基因小鼠模型(pdg小鼠(hambardzumyand等人(2009)transloncol2:89-95；quaildf等人(2016)science352:aad3018))。向脑组织立体定向注射用rcas-pdgfβ或rcas-cre逆转录病毒转染的df-1细胞混合物(1:1混合物，2μl)。在神经胶质瘤祖细胞中pdgfβ致癌基因的过表达以及肿瘤抑制基因ink4a-arf和pten的不存在导致直径4-5mm的肿瘤形成(图7a)，且在21天内几乎完全渗透(如先前所确立(hambardzumyand等人(2009)transloncol2:89-95))。使用免疫荧光，在已建立的神经胶质瘤(在从左侧第三图中指示)中证实肿瘤浸润性(cd68+)巨噬细胞的存在(图7b，在从左侧第三图中指示)。流式细胞术揭示f4/80+、cd11b+巨噬细胞群体占肿瘤中总细胞的32.8％，其为年龄匹配的健康对照小鼠中观察到者(3.7％)的9倍(图7c)。实验中的pdg小鼠表达与关键癌症基因启动子连接的萤火虫荧光素酶基因。已经证明来自这种报告基因的生物发光与肿瘤等级呈正相关(uhrboml等人(2004)natmed10:1257-1260)，因此将其用于监测在处理开始后每四天肿瘤的发展。首先测试了作为单一疗法的irf/ikkβnp：在对照组中，pdg小鼠接受了9个剂量的负载有irf5/ikkβmrna的np或pbs(3个剂量/周持续3周)的静脉内输注。irf/ikkβnp处理仅中等抑制了肿瘤进展(与未处理的对照相比，平均仅产生5天存活期优势；图7d)。然而，与pbs对照组相比，将作为护理标准的放射疗法与irf5/ikkβnp注射相结合显著降低了肿瘤生长，并且使经处理小鼠的存活期提高一倍以上(分别52天对比25天；图7e-7f)。
总之，来自三种临床前实体瘤模型的体内结果表明，局部或全身施用的纳米颗粒可递送编码巨噬细胞极化的主调控因子的基因，以将免疫抑制性巨噬细胞重编程为肿瘤清除性表型。
从鼠至人巨噬细胞的翻译。为了证实在小鼠中获得的数据与治疗人疾病具有相关性，制备了递送编码人irf5和ikkβ的ivtmrna的np(huirf5np)。人单核细胞系thp-1用作公认的m1和m2巨噬细胞极化模型来测试这些纳米载体(lic等人(2016)scirep6:21044；surdziele等人(2017)plosone12:e0183679)。通过用pma处理thp-1细胞并用il-4和il-13将它们极化来产生m2型巨噬细胞(图8a)。为了证实huirf5np具有功能并活化irf途径，用负载有huirf5/ikkβ或gfp对照mrna的纳米颗粒转染thp1-luciatmisg细胞。thp1-luciatmisg细胞在irf诱导型启动子的控制下分泌荧光lucia报告基因。这种复合启动子包括与isg54最小启动子融合的五个ifn刺激应答元件(isre)，isg54最小启动子对nf-κb或ap-1途径的活化因子无应答。结果，thp1-luciatmisg细胞允许通过确定lucia荧光素酶的活性来监测irf途径。已经发现，huirf5np明显上调了m2极化的thp-1细胞中的荧光素酶表达，从而表明mrna构建体在人细胞中是有功能的(图8b-8c)。为了确定irf5途径活化是否能够将m2极化的thp-1细胞重编程为m1样表型，测量了在np转染后促炎性细胞因子il-1β的分泌。与未转染的对照相比，在用huirf5np转染的thp-1细胞中，il-1β的产生显著增加(平均21倍；p<0.0001，图8d)，这与m1巨噬细胞细胞表面标志物cd80的稳健上调(mfi为10.9倍，p<0.0001)有关(图8e)。
seqidno:密匙
本文所描述的核酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写示出，如37c.f.r.§1.822中所定义。仅示出每个核酸序列的一条链，但是互补链应理解为包括在适当的实施方案中。seqidno:55、58、61、64、71、73和79在此序列表中未使用。随附的序列表显示以下序列：
如本领域普通技术人员将了解的，本文所公开的每个实施方案可包含以下、基本上由或由以下组成：所述实施方案特别陈述的要素、步骤、成分或组分。因此，“包括(include)”或“包括(including)”应解释为叙述：“包含(comprise)、由……组成或基本上由……组成”。过渡术语“包含/包括(comprise)”或“包含/包括(comprises)”意指包括但不限于，并且允许包括未指定的要素、步骤、成分或组分，即使在较大的量时也是如此。过渡短语“由……组成”排除未指定的任何要素、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由……组成”将实施方案的范围限制为指定的要素、步骤、成分或组分以及并不实质地影响所述实施方案的那些要素、步骤、成分或组分。如实施例2所述，材料效应将导致治疗小鼠卵巢癌模型的能力在统计学上显著降低。
除非另外指示，否则说明书和权利要求中所用的表示成分的量，如分子量的性质、反应条件等的所有数值均应当理解为在所有情况下都由“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求中所陈述的数值参数都是近似值，所述近似值可根据本发明要寻求获得的所需性质而变化。在最低限度，并且不试图将等效物原则的应用限制于权利要求的范围，每个数值参数均应当至少根据报告的有效数字的数值和通过应用普通四舍五入技术来解读。当要求进一步澄清时，“约”当与陈述的数值或范围结合使用时具有本领域技术人员合理地归于它的含义，即将稍微大于或稍微小于陈述值或范围表示为在以下范围内：陈述值±20％；陈述值±19％；陈述值±18％；陈述值±17％；陈述值±16％；陈述值±15％；陈述值±14％；陈述值±13％；陈述值±12％；陈述值±11％；陈述值±10％；陈述值±9％；陈述值±8％；陈述值±7％；陈述值±6％；陈述值±5％；陈述值±4％；陈述值±3％；陈述值±2％；或陈述值±1％。
尽管陈述本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中所陈述的数值尽可能准确地报告。然而，任何数值固有地含有必然由它们各自测试测量值中发现的标准偏差所产生的某些误差。
除非本文另外指示或者与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在所附权利要求的上下文中)使用的“一个/种(a、an)”、“所述”以及类似的指代语应解读为涵盖单数和复数形式。本文中列举数值的范围仅意在作为一种单个地提及落在所述范围内的每个单独数值的速记方法。除非本文另外指明，否则每个单个数值都并入到本说明书中，如同其在本文中被单个地列举一样。除非本文另外指明或上下文明显矛盾，否则可按任何适合的顺序来执行本文所述的全部方法。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)仅意在更好地说明本发明，而不会对原本要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解读为指示任何未要求保护的要素是实施本发明所必需的。
本文所公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应解读为是限制性的。每个组的成员可单个地提及和要求保护，或以与所述组的其它成员或本文中出现的其它要素的任何组合形式提及和要求保护。可预见，出于简便和/或可专利性的原因，一个组的一个或多个成员可包括于所述组内，或从所述组中删除。当出现任何这种包括或删除时，本说明书被认为含有所修改的组，因此满足所附权利要求中使用的所有马库什组(markushgroup)的书面描述。
本文描述了本发明的某些实施方案，包括为本发明人所知用于实施本发明的最佳模式。当然，本领域技术人员在阅读前面的描述后将会明了这些所描述实施方案的变化形式。本发明人预期本领域的熟练技术人员会适时采用此类变化形式，而且本发明人意图本发明能以除了本文具体描述的方式之外的其它方式来实施。因此，本发明包括在适用法律允许的所附的权利要求中列举的主题的所有修改形式和等效形式。此外，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾，否则呈所有可能变化形式的上述要素的任何组合都涵盖在本发明内。
此外，在整个说明书中，已经大量参考了专利、印刷的出版物、期刊文章和其他书面文本(本文的参考材料)。每一参考材料关于它们的参考教义单个地以引用的方式整体并入本文。
最后，应当理解，本文所公开的本发明的实施方案是对本发明原理的说明。可采用的其他修改形式也在本发明的范围内。因此，例如但不限于，可根据本文的教义利用本发明的替代性配置。因而，本发明不限于明确示出和描述的实施方案。
本文示出的细节是作为实例并且仅出于说明性讨论本发明的优选实施方案的目的，并且之所以呈现所述细节，是为了提供认为是本发明的各个实施方案的原理和概念方面的最有用和易理解的描述的内容。就此而言，除对于本发明的基本理解所必需的之外，没有企图更详细地示出本发明的结构细节，借助于附图和/或实施例所作的描述使得本领域技术人员明了如何可以在实践中体现本发明的若干形式。
除非在以下实施例中明确并毫无疑问地修改或是当含义的应用使得任何构建无意义或基本上无意义，否则在本公开中使用的定义和解释意指并且旨在控制任何未来构建。在术语的构建将使它无意义或基本上无意义的情况下，定义应该从韦氏字典(webster'sdictionary)第3版或本领域普通技术人员已知的字典诸如生物化学和分子生物学牛津字典(anthonysmith编著，牛津大学出版社，oxford，2004)中取得。
序列表
<110>弗雷德·哈金森癌症研究中心(fredhutchinsoncancerresearchcenter)
斯蒂芬·马蒂亚斯(stephan,matthias)
<120>通过调节细胞活化状态改变体内免疫细胞的炎症状态
<130>f053-0076pct/18-073-wo-pct
<150>us62/618,908
<151>2018-01-18
<160>111
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>498
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
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<220>
<223>结合cd38的cdrh1
<400>75
glyphethrpheaspasptyrgly
15
<210>76
<211>8
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrh2
<400>76
ilesertrpasnglyglylysthr
15
<210>77
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrh3
<400>77
alaargglyserleuphehisaspserserglyphetyrpheglyhis
151015
<210>78
<211>8
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrl1
<400>78
asnserasnileglyserasnthr
15
<210>79
<400>79
000
<210>80
<211>11
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrl3
<400>80
glnsertyraspserserleuserglyserarg
1510
<210>81
<211>8
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrh1
<400>81
glyphethrpheasnasntyrgly
15
<210>82
<211>8
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrh2
<400>82
ilesertyraspglyserasplys
15
<210>83
<211>15
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrh3
<400>83
alaargvaltyrtyrtyrglypheserglyprosermetaspval
151015
<210>84
<211>11
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrl1
<400>84
argalaserglnservalsersertyrleuala
1510
<210>85
<211>7
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrl2
<400>85
aspalaserasnargalathr
15
<210>86
<211>10
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrl3
<400>86
glnglnargserasntrpproprothrphe
1510
<210>87
<211>5
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrh1
<400>87
serphealametser
15
<210>88
<211>17
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrh2
<400>88
alaileserglyserglyglyglythrtyrtyralaaspservallys
151015
gly
<210>89
<211>13
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd38的cdrh3
<400>89
asplysileleutrppheglygluprovalpheasptyr
1510
<210>90
<211>11
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd64的cdrl1
<400>90
argalaserglnservalsersertyrleuala
1510
<210>91
<211>7
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd64的cdrl2
<400>91
aspalaserserargalathr
15
<210>92
<211>10
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd64的cdrl3
<400>92
glnleuargserasntrpproprotyrthr
1510
<210>93
<211>5
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd64的cdrh1
<400>93
glytyrglymethis
15
<210>94
<211>17
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd64的cdrh2
<400>94
valiletrptyraspglyserasnlystyrtyralaaspservallys
151015
gly
<210>95
<211>9
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>结合cd64的cdrh3
<400>95
aspthrglyaspargphepheasptyr
15
<210>96
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>正向引物serpinb2
<400>96
actggggcagttatgacagg20
<210>97
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>反向引物serpinb2
<400>97
gatgatcggccacaaactg19
<210>98
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>正向引物retnla
<400>98
ttgttcccttctcatctgcat21
<210>99
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>反向引物retnla
<400>99
ccttgaccttattctccacga21
<210>100
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>正向引物ccl5
<400>100
cctactcccactcggtcct19
<210>101
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>反向引物ccl5
<400>101
ctgatttcttgggtttgctgt21
<210>102
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>正向引物ccl11
<400>102
agagctccacagcgcttc18
<210>103
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>反向引物cdl11
<400>103
cagcacctgggaggtgaa18
<210>104
<211>26
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>正向引物密码子优化的irf5
<400>104
tcttaaagaccacatggtagaacagt26
<210>105
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>反向引物密码子优化的irf5
<400>105
agctgctgttgggattgc18
<210>106
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>正向引物内源性irf5
<400>106
gctgtgcccttaacaaaagc20
<210>107
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>反向引物内源性irf5
<400>107
ggctgaggtggcatgtct18
<210>108
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>正向引物gapd
<400>108
agccacatcgctcagacac19
<210>109
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>反向引物gapd
<400>109
gcccaatacgaccaaatcc19
<210>110
<211>134
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>110
metasnthrglumettyrglnthrprometgluvalalavaltyrgln
151015
leuhisasnpheserileserphepheserserleuleuglyglyasp
202530
valvalservallysleuaspasnseralaserglyalaservalval
354045
alaileaspasnlysilegluglnalametaspleuvallysasnhis
505560
leumettyralavalargglugluvalgluileleulysgluglnile
65707580
arggluleuvalglulysasnserglnleugluarggluasnthrleu
859095
leulysthrleualaserprogluglnleuglulyspheglnsercys
100105110
leuserproglugluproalaprogluserproglnvalprogluala
115120125
proglyglyseralaval
130
<210>111
<211>405
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>111
atgaacaccgaaatgtatcagacccccatggaggtggcggtctaccagctgcacaatttc60
tccatctccttcttctcttctctgcttggaggggatgtggtttccgttaagctggacaac120
agtgcctccggagccagcgtggtggccatagacaacaagatcgaacaggccatggatctg180
gtgaagaatcatctgatgtatgctgtgagagaggaggtggagatcctgaaggagcagatc240
cgagagctggtggagaagaactcccagctagagcgtgagaacaccctgttgaagaccctg300
gcaagcccagagcagctggagaagttccagtcctgtctgagccctgaagagccagctccc360
gaatccccacaagtgcccgaggcccctggtggttctgcggtgtaa405
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