乙酰胆碱酯酶抑制剂和5-HT4受体激动剂组合作为治疗神经退行性疾病的神经保护剂

本发明涉及神经退行性疾病的治疗。神经退行性疾病是由基于神经细胞的系统性变性和蜕膜脱落的神经回路神经网络崩溃而引起的疾病，已知它们是各种难治疾病，例如阿尔茨海默病(ad)，帕金森病，路易体痴呆，血管性痴呆以及包括(i)非认知神经变性，(ii)非认知神经肌肉变性和(iii)运动感觉神经变性在内的与衰老相关的问题、亨廷顿病、包括肌萎缩性侧索硬化症(als)在内的运动神经元疾病、唐氏综合征、皮质基底神经节变性、多系统萎缩、脑萎缩、橄榄体桥脑小脑萎缩、核上性麻痹、弗里德希氏共济失调、2型脊髓小脑共济失调、额颞叶变性(ftd)和原发性进行性失语。神经退行性疾病的临床症状根据疾病的不同，从轻度到重度不等。它们包括震颤、强直、运动障碍、运动减退、运动迟缓、态度反射衰竭、自主神经异常、搏动、步态障碍、抑郁症、情感冷漠、精神错乱、学习障碍、记忆衰退、认知损害、肌萎缩症、肌肉流失、肩胛带失调、构语障碍、吞咽困难、呼吸障碍、麻木、瘫痪和痴呆，这些是进行日常活动的主要障碍。神经退行性死亡是一种复杂的机制，可能是由于多个分子组导致的，这些分子组在表达、活性和/或调节出现问题时会触发神经退行性疾病。这可以解释为什么到目前为止尚未建立抑制或逆转神经变性的有效方法。除了消除这样的疾病的病因外，重建神经网络也很重要。例如，有人称，在已经认识到淀粉样蛋白β肽的细胞毒性为病因的阿尔茨海默病中，神经突的萎缩和突触的减少都触发了神经功能的恶化，相反地，即使在这样触发之后，如果未完全变性或在不变性的情况下存活的神经细胞可以被激活以延伸神经突来恢复突触，那么这些神经细胞可以被恢复。因此，迫切需要能够保护神经突但还能够增加神经突生长并促进新突触形成的新药剂，以预防和治愈神经退行性疾病。本发明满足了这种需求。实际上，本发明是由于发明人以下的出乎意料的发现而得到的：乙酰胆碱酯酶抑制剂活性和5-ht4受体激动剂活性的组合具有神经保护活性，因为除了减少tau过度磷酸化之外，它还能够增加神经突生长，维持突触率，最重要且出乎意料地，促进新突触的形成，而仅显示乙酰胆碱酯酶抑制剂活性的化合物(如多奈哌齐)则无法达到。由于这种对神经突的一般有效的保护作用，使用乙酰胆碱酯酶抑制剂活性和5-ht4受体激动剂活性的组合物作为神经保护剂用于预防和/或治疗任何涉及神经突变性的神经退行性疾病是非常有前景的。因此，本发明涉及药物组合物作为神经保护剂用于预防和/或治疗神经退行性疾病的用途，该药物组合物包含乙酰胆碱酯酶抑制剂和5-ht4受体激动剂。本发明还涉及神经保护药物组合物作为神经保护剂用于预防和/或治疗神经退行性疾病的用途，该神经保护药物组合物包含同时、分别或依次使用的乙酰胆碱酯酶抑制剂和5-ht4受体激动剂。本发明还涉及与5-ht4受体激动剂组合的乙酰胆碱酯酶抑制剂作为神经保护剂用于预防和/或治疗神经退行性疾病的用途。本发明还涉及与乙酰胆碱酯酶抑制剂组合的5-ht4受体激动剂作为神经保护剂用于预防和/或治疗神经退行性疾病的用途。具体实施方式乙酰胆碱酯酶抑制剂“乙酰胆碱酯酶”或“ache”在本文中是指ec3.1.1.7类的水解酶，其催化乙酰胆碱和一些其他充当神经递质的胆碱酯的分解。“乙酰胆碱酯酶抑制剂”在本文中是指影响乙酰胆碱酯酶的乙酰胆碱水解功能的任何天然或合成的化合物或分子。在本发明中，术语“抑制”乙酰胆碱酯酶是指减少、降低、消除、减弱、减慢或停止乙酰胆碱酯酶的乙酰胆碱水解反应。鉴定乙酰胆碱酯酶抑制剂的技术是技术人员所熟知的。通常，可以使用在ellman等人(1961)biochemicalpharmacology7：88-95中公开的ellman方法来鉴定乙酰胆碱酯酶抑制剂。乙酰胆碱酯酶抑制剂的实例是技术人员所熟知的，并且包括下式(i)的多奈哌齐：卡巴拉汀、他克林、加兰他敏、以下中公开的化合物：us专利6,037,352、us6,037,327、us6,022,683、us5,935,781、us5,886,051、us5,869,484(适合用作乙酰胆碱酯酶抑制剂的苯氨基甲酸酯衍生物)、us5,798,392、us5,789,425(咪唑烷酮衍生物)、us5,777,108(加兰他敏衍生物作为乙酰胆碱酯酶抑制剂)、us5,731,284、us5,589,386、us5,585,375、us5,550,253、us5,547,960、us5,541,340和us5,500,188。在特别的实施方式中，乙酰胆碱酯酶抑制剂选自由多奈哌齐、卡巴拉汀，他克林和加兰他敏组成的组。在特别的实施方式中，乙酰胆碱酯酶抑制剂是多奈哌齐。5-ht4受体激动剂“5-ht4受体”或“5-羟色胺受体4”在本文中是指由htr4基因在人体内编码的蛋白质，该蛋白质是人5-羟色胺受体家族的成员，其响应于血清素(5-羟色胺)而刺激camp产生。“5-ht4受体激动剂”在本文中是指对血清素4型受体具有亲和力并且能够模拟血清素对该特定细胞受体的刺激作用的任何天然或合成的化合物或分子。鉴定5-ht4受体激动剂的技术是技术人员所熟知的。通常，可以使用dumuis等人(1988)molpharmacol.34:880-7以及更新的gaven等人(2013)brainres.1511:65-72中首次公开的方法来鉴定5-ht4受体激动剂。5-ht4受体激动剂的实例是本领域技术人员公知的，并且包括普卢卡必利、西沙必利、达佐必利、莫沙必利、伦扎必利、纳那必利(naronapride)、扎考必利、维司曲格(velusetrag)、替加色罗、甲氧氯普胺、西尼必利、ym-53389{(+)-(s)-2-氯-5-甲氧基-4-[5-(2-哌啶基甲基)-1,2,4-噁二唑-3-基]苯胺盐酸盐}、rs-67333、5-甲氧基色胺(5-mt)、rs-56532、ml-10302、ssp-002392、bimu-8和da-6886(n-((1-(3-(1,2,3-三唑-1-基)丙基)哌啶-4-基)甲基)-4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯甲酰胺盐酸盐)。在特别的实施方式中，所述5-ht4受体激动剂选自由普卢卡必利、西沙必利、达佐必利、莫沙必利、伦扎必利、纳那必利、扎考必利、维司曲格、替加色罗、甲氧氯普胺、西尼必利、ym-53389、rs-67333、5-甲氧基色胺(5-mt)、rs-56532、ml-10302、ssp-002392、bimu-8和da-6886组成的组。在特别的实施方式中，5-ht4受体激动剂是rs-67333。在特别的实施方式中，乙酰胆碱酯酶抑制剂和5-ht4受体激动剂是具有两种活性的独特化合物。因此，在特别的实施方式中，乙酰胆碱酯酶抑制剂和5-ht4受体激动剂是下式(ii)的多奈必利(donecopride)化合物：神经退行性疾病“神经退行性疾病”在本文中是指由基于神经细胞的系统性变性和蜕膜脱落的神经回路神经网络崩溃而引起的疾病。如上所述，本发明人证明了乙酰胆碱酯酶抑制活性和5-ht4受体激动剂活性的组合显示了对神经突的一般有效的保护作用。由于这种一般的神经保护作用，该组合可以作为神经保护剂用于预防和/或治疗任何神经退行性疾病。神经退行性疾病的实例包括阿尔茨海默病(ad)，帕金森病，路易体痴呆，血管性痴呆以及包括(i)非认知神经变性，(ii)非认知神经肌肉变性和(iii)运动感觉神经变性在内的与衰老相关的问题、亨廷顿病、包括肌萎缩性侧索硬化症(als)在内的运动神经元疾病、唐氏综合征、皮质基底神经节变性、多系统萎缩、脑萎缩、橄榄体桥脑小脑萎缩、核上性麻痹、弗里德希氏共济失调、2型脊髓小脑共济失调、额颞叶变性(ftd)和原发性进行性失语。在特别的实施方式中，神经退行性疾病选自由阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多系统萎缩、包括肌萎缩性侧索硬化症在内的运动神经元疾病、唐氏综合征和额颞叶变性组成的组。在另一种实施方式中，神经退行性疾病是阿尔茨海默病。在一种供选择的实施方式中，神经退行性疾病是非阿尔茨海默病的神经退行性疾病。医学适应症本发明涉及一种药物组合物作为神经保护剂用于预防和/或治疗如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的用途，该药物组合物包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂。本发明还涉及包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的药物组合物用于制备预防和/或治疗如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的神经保护剂的用途。本发明进一步涉及一种预防和/或治疗如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的方法，包括将治疗有效量的包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的药物组合物施用至有需要的受试者。本发明进一步涉及一种在患有如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病或具有患上如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的风险的受试者中进行神经保护的方法，包括将治疗有效量的包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的药物组合物施用至所述受试者。本发明还涉及一种神经保护药物组合物作为神经保护剂用于预防和/或治疗如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的用途，该神经保护药物组合物包含同时、分别或依次使用的如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂。本发明还涉及如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂用于制备同时、分别或依次施用以预防和/或治疗如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的神经保护药物组合物的用途。本发明还涉及一种预防和/或治疗如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的方法，包括将治疗有效量的如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂同时、分别或依次施用至有需要的受试者。本发明进一步涉及一种在患有如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病或具有患上如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的风险的受试者中进行神经保护的方法，包括将治疗有效量的如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂同时、分别或依次施用至所述受试者。根据本发明，术语“受试者”或“有需要的受试者”旨在用于人类或非人类哺乳动物，该人类或非人类哺乳动物受到或可能受到如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的影响。在本发明的上下文中，术语“治疗(treating/treatment)”是指逆转、减轻或抑制这样的术语所适用的失调或病症或这样的失调或病症的一种或多种症状的进展。在本发明的上下文中，术语“预防(preventing/prevention)”是指延迟或预防该术语所适用的失调或病症，或该失调或病症的一种或多种症状的发作。“神经保护”在本文中是指退行性作用的预防或抑制和中枢神经系统中神经元完整性的恢复，特别是神经元变性的预防或抑制。“神经保护剂”在本文中是指如上定义的神经保护的组合。发明人更具体地证明，在本发明的上下文中使用的化合物的组合能够增加神经突生长，维持突触率，减少tau过度磷酸化和/或促进新突触的形成。因此，在特别的实施方式中，包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的药物组合物，或包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的神经保护药物组合物用于增加神经突生长。本发明还涉及一种在患有如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病或具有患上如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的风险的受试者中增加神经突生长的方法，包括：-将治疗有效量的包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的药物组合物施用至所述受试者，或-将治疗有效量的如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂同时、分别或依次施用至所述受试者。“神经突生长”在本文中是指从神经元的细胞体和相关的突触发生的任何突出的延伸过程。“增加神经突生长”在本文中是指与在相同但未施加目的化合物的条件下观察到的神经突生长相比，当施加目的化合物时，神经突的生长更高(即更有效、更快或更长时间)，优选统计学上显著更高。优选地，与在相同但未施加目的化合物的条件下观察到的神经突生长相比，神经突生长增加至少120％。在另一种特别的实施方式中，包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的药物组合物或包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的神经保护药物组合物用于维持突触率。本发明的另一目的涉及一种在患有如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病或具有患上如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的风险的受试者中维持突触率的方法，包括：-将治疗有效量的包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的药物组合物施用至所述受试者，或-将治疗有效量的如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂同时、分别或依次施用至所述受试者。“突触率”在本文中是指突触数目与神经元数目之比。“维持突触率”在本文中是指与对照条件(例如相同但未施加目的化合物的条件或神经元未面对神经退行性疾病的条件)中观察到的突触率相比，当施加目的化合物时，突触率相似(即在统计学上无显著差异)。在另一种特别的实施方式中，包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的药物组合物或包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的神经保护药物组合物用于促进新突触的形成。本发明的另一目的涉及一种在患有如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病或具有患上如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的风险的受试者中促进新突触的形成的方法，包括：-将治疗有效量的包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的药物组合物施用至所述受试者，或-将治疗有效量的如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂同时、分别或依次施用至所述受试者。“促进新突触的形成”在本文中是指与在相同但未施加目的化合物的条件下观察到的新形成的突触的数目相比，当施加目的化合物时，新形成的突触的数目更高，优选统计学上显著更高。优选地，与在相同但未施加目的化合物的条件下观察到的新突触形成相比，新突触形成增加至少120％。在另一种特别的实施方式中，包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的药物组合物，或包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的神经保护药物组合物用于减少tau过度磷酸化。本发明的另一目的涉及一种在患有如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病或具有患上如上文“神经退行性疾病”一节中定义的神经退行性疾病的风险的受试者中减少tau过度磷酸化的方法，包括：-将治疗有效量的包含如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂的药物组合物施用至所述受试者，或-将治疗有效量的如上文“乙酰胆碱酯酶抑制剂”一节中定义的乙酰胆碱酯酶抑制剂和如上文“5-ht4受体激动剂”一节中定义的5-ht4受体激动剂同时、分别或依次施用至所述受试者。“tau过度磷酸化”在本文中是指tau蛋白的异常高度磷酸化，特别是thr39、ser46、thr50、ser68、thr69、thr71、ser113、thr153、thr175、thr181、ser184、ser185、ser191、ser198、ser199、ser202、thr205、ser208、ser210、thr212、ser214、thr217、thr231、ser235、ser237、ser238、ser241、ser258、ser262、ser285、ser289、ser305、ser324、ser352、ser356、tyr394、ser396、ser400、thr403、ser404、ser409、ser412、ser413、thr414、ser416、ser422、ser433和ser435残基中的至少一种的tau蛋白的异常磷酸化。“减少tau过度磷酸化”在本文中是指当施加目的化合物时，tau蛋白的thr39、ser46、thr50、ser68、thr69、thr71、ser113、thr153、thr175、thr181、ser184、ser185、ser191、ser198、ser199、ser202、thr205、ser208、ser210、thr212、ser214、thr217、thr231、ser235、ser237、ser238、ser241、ser258、ser262、ser285、ser289、ser305、ser324、ser352、ser356、tyr394、ser396、ser400、thr403、ser404、ser409、ser412、ser413、thr414、ser416、ser422、ser433和ser435残基中的至少一种，特别是thr212和ser214残基之一不会异常磷酸化，而在相同但未施加目的化合物的条件下，所述残基异常磷酸化。“治疗有效量”在本文中是指以适用于任何医学治疗的合理的受益/风险比在神经退行性疾病的治疗和/或预防中充当神经保护剂的药物组合物或组合的足够量。但是，将理解的是，本发明化合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定受试者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的病症和病症的严重程度、所用特定化合物的活性，受试者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食，施用时间、所用特定化合物的施用途径和排泄率、治疗时间、与所用特定化合物组合或同时使用的药物以及医学领域所熟知的类似因素。例如，以低于获得所需治疗效果所需的剂量开始给予该化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至获得所需效果，这是在本领域技术范围内的。如本文所用，术语“组合”、“治疗组合”或“药物组合”定义了一种剂量单位形式的固定组合或用于组合给药的部分的试剂盒，其中可以独立地同时施用或在使得组合伴侣表现出协同作用的时间间隔内分别施用乙酰胆碱酯酶抑制剂和5-ht4受体激动剂。因此，可以将本发明组合的化合物配制成一种或两种单独的药物组合物，每种组合物用于相同或不同的施用途径。在本发明的上下文中使用的化合物可以以药物组合物的形式施用，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和任选的持续释放基质(例如可生物降解聚合物)以形成治疗组合物。“药学上”或“药学上可接受的”是指在适当地施用至哺乳动物，特别是人时，不会产生不良反应、过敏反应或其他不想要的反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。包括在本发明的上下文中使用的化合物的药物组合物的形式和施用途径自然取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等。可将本发明上下文中使用的化合物配制成用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下或眼内施用等。在特别的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是口服给药的。可替代地，包含在本发明的上下文中使用的化合物的药物组合物可以包含对于能够被注射的制剂而言药学上可接受的载体。这些尤其可以是等渗的无菌盐溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或此类盐的混合物)，或干燥的、特别是冷冻干燥的组合物，该组合物能够在根据情况添加灭菌水或生理盐水后构成注射溶液。为了制备药物组合物，可以将有效量的本发明上下文中使用的化合物溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，该形式都必须是无菌的，并且必须具有一定的流动性，以达到易于注射的目的。它必须在生产和储存条件下保持稳定，并且必须进行防腐以防微生物(例如细菌和真菌)的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。适当的流动性例如通过使用包衣(例如卵磷脂)，在分散的情况下通过维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂、稳定剂、防冻剂或抗氧化剂来维持。抗细菌剂和抗真菌剂可以引起对微生物作用的预防。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过将适当的溶剂中的所需量的活性化合物与以上列举的几种其他成分根据需要掺混，然后过滤灭菌，制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散液，所述无菌载体包含基本分散介质和以上列举的那些所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术从先前的活性成分和任何其他所需成分的粉末的无菌过滤溶液中得到该活性成分和任何其他所需成分的粉末。配制后，将以与剂型相容的方式和治疗有效量施用溶液。该制剂易于以多种剂型如上述注射溶液的类型施用，但是也可以使用药物释放胶囊等。例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果必要的话，溶液应该适当地是缓冲的，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。就此而言，根据本发明，本领域技术人员将知道可以使用的无菌水性介质。例如，一种剂量可以溶解在1ml等渗nacl溶液中，或者被添加到1000ml皮下注射液中，或者在建议的输注部位注射(例如，参见“雷明顿药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)”第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。剂量的某些变化将必然发生，这取决于所治疗的受试者的状况。在任何情况下，负责施用的人员将确定适用于个体受试者的适当剂量。在本发明的上下文中使用的化合物通常可以是口服施用的，例如通过口服或舌下途径服用的片剂、胶囊剂、微胶囊剂、粉剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂或混悬剂形式。在特别的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物适合以1至20mg/kg体重的日剂量口服施用，特别是以2mg/kg的日剂量口服施用。在另一种特别的实施方式中，在本发明上下文中使用的化合物合适地每周两次以1至20mg/kg体重的剂量口服施用，特别是每周两次以1mg/kg体重的剂量口服施用。根据另一种特别的实施方式，在本发明的上下文中使用的化合物每天5次以10至1000mg的剂量施用，优选每天5次以0.2至2mg的剂量施用。将通过以下附图和实施例进一步说明本发明。附图说明图1：rs67333对被aβ1-42损伤的海马神经元的原代培养物中map-2神经元存活(a)、总神经突网络(b)、根据神经元数量标准化的神经突长度(c)、tau的磷酸化(at100)(d)以及map-2神经元的突触保留的作用。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/只组)。单因素anova，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图2：rs67333和多奈哌齐对被aβ1-42损伤的海马神经元的原代培养物中map-2神经元存活(a)、总神经突网络(b)、根据神经元数量标准化的神经突长度(c)、tau的磷酸化(at100)(d)以及map-2神经元的突触保留的协同作用。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/只组)。单因素anova，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。实施例实施例1该实施例显示了在被aβ损伤的大鼠原代海马神经元中具有乙酰胆碱酯酶抑制活性和5-ht4受体激动剂活性两者的化合物(即多奈必利)的作用(24小时暴露)。阿尔茨海默病(ad)是一种神经退行性疾病，主要影响65岁以上的人们，患有不同的临床症状，例如思维、语言和学习能力的进行性下降。来自各种来源的越来越多的证据表明，aβ低聚物(aβo)/原纤维是ad发病机理中的推定毒性物质。通过产生aβo溶液并利用aβo的浓度和对aβo暴露时间，可以再现早期效应(氧化应激)和结构性改变的长期发展(神经元死亡)。使用含有aβo的aβ肽溶液(通过自动蛋白质印迹精确测量)，在本实施例中使用的模型再现了ad的基本神经病理学特征。这项研究的目的是评估在aβ损伤的大鼠原代海马神经元中具有乙酰胆碱酯酶抑制活性和5-ht4受体激动剂活性两者的化合物(数种浓度的富马酸多奈必利)的作用(24h暴露)。将仅具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化合物即多奈哌齐(一种浓度)用作参考测试化合物。材料和方法海马神经元的原代培养如callizot等人.(2013)j.neurosci.res.91706-716描述的，培养大鼠海马神经元。将妊娠17天的怀孕的雌性大鼠(wistar大鼠；janvierlabsfrance)在co2室中深度麻醉然后颈脱位法处死。然后，将胎儿从子宫中取出，并立即置于冰冷的l15leibovitz培养基中，该培养基中含有2％青霉素(10,000u/ml)和链霉素(10mg/ml)溶液(ps)以及1％牛血清白蛋白(bsa)。将海马神经元在37℃下用终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％edta的胰蛋白酶-edta溶液处理20分钟。通过添加含4.5g/l葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基(dmem)来终止解离，该培养基中还含有ii级dna酶i(终浓度为0.5mg/ml)和10％的胎牛血清(fcs)。通过10ml移液枪头的吹打三次将细胞机械解离，然后在4℃下以515xg离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于限定培养基中，该培养基由含有2％的b27补充剂的溶液、2mmol/ll-谷氨酰胺、2％ps溶液和10ng/ml的脑源性神经营养因子(bdnf)的神经基础培养基组成。使用台盼蓝排斥试验，在neubauer细胞计数仪中对活细胞进行计数。将细胞以每孔20,000个的密度接种在预涂有聚l-赖氨酸的96孔板中，并在37℃下在空气(95％)-co2(5％)培养箱中培养。每2天更换一次培养基。多奈必利和人aβ1-42暴露培养17天后，使海马神经元暴露于aβ溶液(见下文)。根据callizot等人.(2013)j.neurosci.res.91706-716所述的程序，完成aβ1-42制备。简而言之，将aβ1-42肽以40μm的初始浓度溶解在上文提及的限定培养基中。将该溶液在黑暗中于37℃下轻轻搅拌3天，并在培养基中适当稀释至所用浓度(20μm(板1)或2.5μm(板2)，分别对应于2μm或0.25μm的低聚物(aβo))后立即使用。将富马酸多奈必利溶解在培养基中，并在施加aβ前1小时进行预温育。在多奈必利存在下，将aβ1-42制剂添加到在对照培养基中，使其稀释的终浓度为20或2.5μm(＝2μm或0.25μm的aβo，通过自动蛋白质印迹评估)。培养板的安排在96孔板中对一种培养物测试了富马酸多奈必利(donecopride)(每种条件6个孔)。在施加aβ之前1小时预温育化合物。评估了以下条件：板1(map-2/tau)板2(psd95/syn)对照(载体)对照(载体)+aβ(20μm24h)/载体+aβ(2.5μm24h)/载体+aβ(20μm24h)/多奈必利(1μm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(1μm)+aβ(20μm24h)/多奈必利(500nm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(500nm)+aβ(20μm24h)/多奈必利(100nm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(100nm)+aβ(20μm24h)/多奈必利(50nm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(50nm)+aβ(20μm24h)/多奈必利(10nm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(10nm)+aβ(20μm24h)/多奈必利(5nm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(5nm)+aβ(20μm24h)/多奈必利(1nm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(1nm)+aβ(20μm24h)/多奈哌齐(1μm)+aβ(2.5μm24h)/多奈哌齐(1μm)终点评估板1：存活、神经突网络和磷酸tau评估中毒后24小时，将海马神经元在-20℃下用乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定5分钟。用0.1％的皂苷透化后，将细胞与以下物质温育2小时：a)在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/1000稀释的鸡多克隆抗体抗微管相关蛋白2(map-2)(该抗体使得能够对神经元细胞体和神经突进行特异性染色；并使得能够研究神经元细胞死亡和神经突网络)。b)在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/400稀释的小鼠单克隆抗体抗磷酸tau(at100)。这些抗体通过用在含有1％fcs和0.1％皂苷的pbs中以1/400稀释的alexafluor488山羊抗小鼠igg和alexafluor568山羊抗鸡igg室温下处理1小时来显现。对于每种条件，使用imagexpress(moleculardevices公司)在20倍放大倍率下每孔拍摄30张照片(代表整个孔区域)。使用相同的采集参数拍摄所有图像。通过使用“自定义模块编辑器”(moleculardevices公司)自动执行分析。评估了以下终点：-神经元总数(神经元存活，map-2阳性神经元数目)-神经突网络(以map-2阳性神经元的μm为单位)-神经元中tau的面积(μm2，与map-2阳性神经元重叠)。板2：突触评估中毒后24小时，将海马神经元在-20℃下用乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定5分钟。用0.1％的皂苷透化后，将细胞与以下物质温育2小时：a)在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/100稀释的小鼠抗突触后致密物95kda(psd95)。b)在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/100稀释的兔多克隆抗体抗突触素(syn)。这些抗体通过用在含有1％fcs和0.1％皂苷的pbs中以1/400稀释的alexafluor488山羊抗小鼠igg和alexafluor568山羊抗兔igg室温下处理1小时来显现。对于每种条件，使用imagexpress(moleculardevices公司)在20倍放大倍率下每孔拍摄40张照片。使用相同的采集参数拍摄所有图像。通过使用“自定义模块编辑器”(moleculardevices公司)自动执行突触评估。评估了以下终点：-突触的总数(psd95/syn之间重叠)。统计分析所有值均以平均值+/-sem表示。通过单因素anova，然后进行plsdfisher检验来进行统计分析，p<0.05被认为是显著的。使用graphpadprism软件版本7.04进行不同条件下的图形和统计分析。*p<0.05被认为是显著的。结果多奈必利对map-2海马神经元存活和神经突网络以及对tau过度磷酸化的作用。神经元存活下表1显示了多奈必利对海马神经元原代培养物中map-2神经元存活的影响。表1：map-2神经元(占对照的百分比)*：与aβ1-42相比，p<0.05，通过单因素anova然后进行fisherlsd检验来确定。重要的map-2神经元损失是施加aβ肽的结果。多奈哌齐在此用作具有单独的乙酰胆碱酯酶抑制活性的对照，能够显著保护神经元免于死亡。两种多奈必利剂量(100nm和500nm)发挥的神经保护作用与多奈哌齐相似。神经突网络下表2显示了多奈必利对海马神经元原代培养物中map-2神经元的神经突网络的作用。表2：map-2神经突网络(占对照的百分比)*：与aβ1-42相比，p<0.05，通过单因素anova然后进行fisherlsd检验来确定。在aβ1-42损伤后，总神经突网络严重收缩。多奈哌齐几乎保留了几乎所有的神经突网络。四种多奈必利剂量(50nm，100nm，500nm和1μm)对神经突网络也具有保护作用。神经突网络与培养物中神经元的数量成比例。为了确定每个神经元的平均神经突长度，根据神经元的数量对总的神经突网络进行标准化。相应的结果示于下表3中。表3：神经突网络/map-2神经元(占对照的百分比)*：与aβ1-42相比，p<0.05，通过单因素anova然后进行fisherlsd检验来确定。这种调整显示，在多奈哌齐和多奈必利(1μm)存在下，每个神经元的神经突长度更长，提示这两种化合物对神经突的长出有影响。tau磷酸化下表4显示了多奈必利对海马神经元原代培养物中map-2神经元的tau磷酸化(at100)的影响。表4：tau(at100)/神经元面积(占对照的百分比)*：与aβ1-42相比，p<0.05，通过单因素anova然后进行fisherlsd检验来确定。在施加aβ1-42下，观察到tau过度磷酸化(对于at100)。多奈哌齐能够显著缓和这种过度磷酸化。类似地，多奈必利(50nm，100nm，500nm)以剂量依赖方式显著降低了tau过度磷酸化。多奈必利对海马神经元原代培养物中突触的作用为了评估突触的形成，研究了突触后标志物psd-95和突触前标志物突触素的分布。psd-95和突触素染色均呈阳性的结构被认为是突触。下表5显示了多奈必利对这些突触的作用。表5：突触数目(占对照的百分比)*：与aβ1-42相比，p<0.05，通过单因素anova然后进行fisherlsd检验来确定。由施加aβ1-42造成的应激引起突触数目的减少(如先前由callizot等人.(2013)j.neurosci.res.91:706-716所示)。多奈哌齐减轻了突触的损失。同样，多奈必利也能够以剂量依赖方式(5nm至1μm)保留突触的数量。有趣的是，低剂量的化合物(5nm)观察到这种作用。该作用随剂量增加。由于aβ1-42肽引起的损伤，在实验条件下神经元的数目减少，这导致突触数目的减少。因此，为了估计每个神经元的突触数目，根据对照组、aβ1-42、多奈必利(500nm，该状态显示最高突触数量)和多奈哌齐组的神经元数量对突触数量进行标准化。这种调整显示，仅多奈必利显著促进了新突触的形成，而多奈哌齐没有作用。结论本研究表明，乙酰胆碱酯酶抑制活性和5-ht4受体激动剂活性的组合对aβ1-42肽损伤(即阿尔茨海默病体外模型)的海马神经元的神经元存活和神经突网络具有有益作用。此外，具有该活性组合的化合物能够减少at100位点上tau过度磷酸化，并能够显著刺激新突触的形成。该组合的作用大于多奈哌齐的作用，提示该组合是作为神经保护剂，特别是用于治疗神经退行性疾病的令人关注的候选药物。实施例2该实施例显示了在对阿尔茨海默病的5xfad小鼠模型的长期施用中，具有乙酰胆碱酯酶抑制活性和5-ht4受体激动剂活性两者的化合物(多奈必利)的抗健忘、抗淀粉样蛋白和抗炎作用。研究基本原理研究的目的是评估在阿尔茨海默病的5xfad小鼠模型中长期施用具有乙酰胆碱酯酶抑制活性和5-ht4受体激动剂活性两者的化合物(多奈必利)的潜在的抗健忘、抗淀粉样蛋白和抗炎作用。使用的小鼠模型是5xfad品系(在杰克逊实验室(jacksonlaboratory)称为“b6sjl-tg(appswfllon,psen1*m146l*l286v)6799vas/mmjax”,mmrrcstock编号：34840-jax或"b6.cg-tg(appswfllon,psen1*m146l*l286v)6799vas/mmjax,mmrrcstock编号：34848-jax)。这些5xfad转基因小鼠过表达突变体：具有瑞典(k670n，m671l)、佛罗里达(i716v)和伦敦(v717i)家族性阿尔茨海默病(fad)突变的人app(695)以及携带两个fad突变(m146l和l286v)的人ps1。两种转基因均受小鼠thy1启动子调控以驱动在脑中过表达。5xfad小鼠概括了阿尔茨海默病淀粉样蛋白病理学的主要特征，是神经内aβ42诱导的神经变性和淀粉样斑块形成的有用模型。方法和实验设计小鼠根据1986年11月24日欧洲共同体理事会的指令(86/609/eec)进行了动物实验。尽一切努力使动物的痛苦最小化以及减少使用的小鼠数量。oakley等人(2006)j.neurosci.26:10129-10140中描述了5xfad小鼠的产生。这些5xfad转基因小鼠过表达携带瑞典(k670n，m671l)、佛罗里达(i716v)和伦敦(v717i)家族性ad(fad)突变的人app(695)和携带两个fad突变(m146l和l286v)的人早老素(ps1)。两种转基因的表达均受小鼠thy1启动子的神经元特定元件调控。通过将半合子转基因小鼠与b6/sjlf1种鼠(breeder)杂交来维持5xfad品系(b6/sjl遗传背景)。通过将半合子转基因小鼠与c57bl/6j种鼠(breeder)杂交来维持5xfad品系(c57bl/6j遗传背景)。使用尾部基因组dna通过pcr对所有动物进行基因分型。将转基因和野生型小鼠饲养在我们的动物设施中，可以随意获得食物和水，并在22-24℃下以12小时明暗循环饲养。在该研究中使用了雌性5xfad小鼠。对于每个实验，小鼠的年龄均以月为单位(以两周的范围)。药物在法国卡昂cermn合成了多奈必利(富马酸多奈必利，mr31155)。rs67333(1-(4-氨基-5-氯-2-甲氧基-苯基)-3-(1-丁基-4-哌啶基)-1-丙酮)用作参考5-ht4受体激动剂，并购自tocrisbioscience(r&dsystemseurope，里尔，法国)。将化合物重悬于dmso中(37.5μg/μl，在-20℃下储存)，并在施用前在0.9％nacl中按1:250的比例新鲜稀释。载体溶液(0.9％nacl，0.4％dmso)用作对照。动物处理5xfad小鼠根据2种不同的方案接受了药物或载体的长期处理。在每个实验中，药物或载体溶液每周腹膜内施用两次(1mg/kg)。在“方案1”中，将小鼠(每组n＝6-7只小鼠)从2月龄到4月龄用化合物处理。在“方案2”中，将小鼠(n＝7)从1月龄到4月龄用化合物处理。在每个方案的结束时，用盐溶液中的100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠，并用pbs进行心内灌注。在冰上迅速分离脑，去除嗅球和小脑，并将两个半球分开。将一个半球在干冰上冷冻，并保存在-80℃下用于生化分析，将另一个半球固定在4％pfa中进行免疫组织化学(ihc)。脑脊液(csf)收集麻醉小鼠并将其安放在立体定位仪上。借助微型牵开器(finesciencetools，海德堡，德国)切割颈部皮肤并分离皮下组织和肌肉。然后放下小鼠，使头部与身体形成约135°的角度(liu和duff(2008)j.vis.exp.10:960)。使用毛细管(硼硅酸盐玻璃，b100-75-10，sutterinstruments，诺瓦托，美国加利福尼亚州)来对枕大池的硬脑膜开孔。通过毛细作用收集csf，并将csf转移到0.5ml微管中，立即在干冰上冷冻并保存在-80℃直至使用。解冻后，如国际申请wo2008/009868中所述将样品在60℃下加热5分钟，并进行分析而不进行进一步的冻融循环。脑提取物的制备将5xfad小鼠和对照组的脑半球、额叶皮质和海马体解冻，称重，并在含有蛋白酶抑制剂混合物(rocheappliedscience，梅朗，法国)的4个体积的tris-盐水(50mmtris-hclph＝7.4，150mmnacl)中匀浆化。将得到的匀浆液以54,000×g离心20分钟，收集上清液(“可溶部分”)并等分以在-80℃下储存。通过短时超声处理将沉淀物重悬于10个体积的6m盐酸胍的50mmtris-hcl(ph＝7.6)溶液中，并再次以26,500×g离心20分钟。将上清液(“不溶级分”)等分并储存在-80℃下(morishima-kawashima等人.(2000)am.j.pathol.157:2093-2099)。aβ40和aβ42的定量根据制造商的说明使用来自iblinternational(德国汉堡)的针对aβ40(人淀粉样蛋白β(1-40)检测试剂盒，#27713)和aβ42(人淀粉样蛋白β(1-42)检测试剂盒，#27719)剂量的elisa试剂盒。使用infinite2000发光计数器在620nm和450nm读出反应。使用bca蛋白测定法(sigma-aldrich)将获得的值标准化到每个样品的蛋白浓度。免疫组织化学使用振动切片机(micromhm650v，thermoscientific，圣艾尔布兰，法国)切割30微米厚的切片，并在-20℃下保存在冷冻保护介质中。为了标记淀粉样斑块，将额叶皮质、海马体和内嗅皮质(以前囟为基准的坐标：额叶皮质＝1.98mm，海马体＝1.94mm，内嗅皮质＝-3.08mm)的自由浮动组织切片在pbs中广泛地洗涤，然后在封闭溶液(pbs；3％bsa；0.1％tritonx-100)中温育1小时。将切片用hoechst染料(lifetechnologies，圣欧班，法国，1:1000)染色15分钟以检测细胞核，然后用新鲜制备的硫黄素t溶液(#t3516-5g，sigma-aldrich)(终浓度：在封闭缓冲液中为0.01mg/ml)处理15分钟。在70％乙醇中洗涤5分钟后，将样品固定在带有盖玻片的聚赖氨酸载玻片上。对于gfap(胶质纤维酸性蛋白)染色，如前所述将自由浮动大脑切片封闭，并与多克隆兔抗gfap(1:1000，z0334，dako，莱叙利斯，法国)在4℃下温育过夜。硫黄素t染色并用70％乙醇洗涤后，添加alexafluor594山羊抗兔二抗(1:1000，a11012，lifetechnologies)2小时。如前所述进行pbs洗涤和封片。图像采集与分析图像是使用axioimagerz1显微镜(carlzeisss.a.s.，马尔利勒鲁瓦，法国)采集的。对硫黄素t染色进行盲分析，数据以来自同一大脑区域/动物的2至3个组织切片中每mm2的平均颗粒数表示(imagej软件)。使用imagej软件对gfap表达进行定量，结果以面积分数表示。新颖物体识别测试使用新颖物体识别(nor)测试(bevinsandbesheer(2006)nat.protoc.1:1306-1311)来测试小鼠的认知能力。在药物处理期间对动物进行了广泛处理，然后开始测试。每天，使小鼠在至少测试前1小时熟悉测试室。在放置在光线昏暗的房间中的有机玻璃盒子(宽度：35cm，长度：20cm，高度：20cm)中进行测试。在第1天和第2天，使每只小鼠习惯于空盒10分钟/天。在第3天，将两个物体(用塑料玩具制成)放置在笼子中，距离相对的墙壁5厘米。在训练期期间，将每只动物面对墙壁放置在两个物体之间，然后使它们探索物体5分钟。然后将小鼠放回它们的笼中，并在24小时后进行5分钟的测试期，在该测试中两个(熟悉)物体中的一个被新的(新颖)物体代替。对整个实验进行了录像，并对物体的探索[小鼠鼻子与物体接触或闻到物体的距离为≤1cm所花费的时间]进行盲测量。考虑了两个参数：1)在训练期期间动物与两个熟悉物体互动所花费的探索时间(秒)，以及2)相对于总探索时间，动物与新颖物体互动所花费的探索时间([新颖/(熟悉+新颖)]×100)。还计算了辨别指数([新颖-熟悉]/[熟悉+新颖])。统计分析所有值均以平均值±sem表示。在多个比较组的情况下，通过anova分析和随后的tukey事后检验确定了处理的显著效果。在所有其他情况下，均使用未配对学生t检验。对于所有统计检验，p<0.05被认为是显著的。使用graphpadprism7(graphpadsoftware，拉霍亚，加利福尼亚)进行分析。结果多奈必利对5xfad脑淀粉样蛋白载量的作用本研究使用27只雌性5xfad小鼠(b6/sjl遗传背景)。小鼠从2月龄到4月龄的两个月中每周两次腹膜内接受载体或化合物(1mg/kg)从脑提取物中可溶和不可溶部分中定量aβ40和aβ42。结果以占载体的百分比表示。下表6列出了获得的结果：表6：aβ40和aβ42水平(占对照的百分比)*：与载体相比，p<0.05，这通过单因素anova和tukey检验确定。表6中列出的载体组的值如下：○可溶部分：aβ40＝9.48±1.08μg/mg蛋白质，aβ42＝0.24±0.03μg/mg蛋白质，○不溶部分：aβ40＝0.68±0.10μg/mg蛋白质，aβ42＝10.84±0.73μg/mg蛋白质，抗淀粉样蛋白作用。在5xfad小鼠大脑的可溶部分中，长期施用多奈必利(1mg/kg，每周两次)能够显著降低aβ42水平(*p<0.05，这通过单因素anova和tukey检验确定)，而aβ40水平则没有任何变化。同样，在不溶部分中，多奈必利降低了小鼠大脑中aβ42的载量。两种药物均不影响不溶aβ40的水平。多奈必利对5xfad小鼠记忆、csf中淀粉样蛋白负荷、淀粉样斑块和星形胶质细胞聚集的影响本研究使用28只雌性5xfad小鼠(c57bl/6j遗传背景)。小鼠从1月龄到4月龄的三个月中每周两次腹膜内接受载体或化合物(1mg/kg)在处理结束时，在新颖物体识别测试(nor)中评估了小鼠的长期记忆能力。期间间隔24小时。由于在训练期期间，没有小鼠未能探索两个物体中的任何一个或探索两个物体的时间少于10秒，因此所有小鼠均被包括在数据分析中。抗健忘作用。将1月龄的5xfad雌性和wt同窝仔用rs67333、载体或多奈必利(1mg/kg，每周两次，共3个月)进行处理，然后通过新颖物体识别(nor)测试来评估识别记忆力。处理结束后三天开始习惯化期，以避免干扰急性效应。训练期和测试之间的间隔为24小时。探索时间相似和辨别指数不显著表明，载体处理的小鼠记忆能力受损，无法辨别新颖物体与熟悉物体。与用载体处理的小鼠相比，热衷于探索新颖物体的时间所占比例更高(与熟悉的物体相比**p<0.01，这通过双因素anova然后进行sidak检验确定)，这表明rs67333处理逆转了认知障碍。类似的，多奈必利长期处理也能够防止记忆改变(与熟悉的物体相比**p<0.01，这通过双因素anova然后进行sidak检验确定)。2个化合物处理组的辨别指数不同于零，即机遇水平(由未配对学生t检验确定)。训练期期间的总探索时间在三组中没有显著差异，这表明用多奈必利处理的5xfad小鼠的识别记忆改善并不是探索活动的增加所导致的。csf中的淀粉样蛋白载量。与对照组相比，经rs67333或多奈必利处理的5xfad小鼠的脑脊液(csf)中aβ42的浓度(1mg/kg，每周两次，连续3个月)无显著差异，表明长期5-ht4受体激动剂刺激不影响csf中的淀粉样蛋白水平(由单因素anova然后进行tukey检验确定)。抗淀粉样蛋白作用。额叶皮质、海马体和内嗅皮质被分析为5xfad小鼠大脑(额叶、正中和尾部部分)以及受阿尔茨海默病早期影响且高度富集淀粉样蛋白沉积物的人脑区域的代表性区域。与载体处理相比，多奈必利处理(1mg/kg，每周两次，共3个月)，淀粉样斑块数在额叶皮质中(与载体相比减少了16±3％，**p<0.01)以及在内嗅皮质中(与载体相比减少了24±4％，**p<0.01)均显著减少。rs67333处理(1mg/kg，每周两次，共3个月)后，额叶皮质和内嗅皮质中均未见显著效果。与对照组相比，用rs67333或多奈必利(1mg/kg，每周两次，共3个月)处理的5xfad小鼠海马体中的淀粉样斑块数没有显著差异。统计学数据通过单因素anova和tukey检验确定。抗炎作用。星形胶质细胞的免疫组织化学评估(抗gfap抗体(胶质纤维酸性蛋白))显示，多奈必利和rs67333长期处理(1mg/kg，每周两次，共3个月)显著减少了星形胶质细胞增生(与接受载体的对照组相比，处理的动物的内嗅脑切片中gfap染色降低了54±10％和62±6％，与载体相比*p<0.01)。但是，与对照组相比，rs67333或多奈必利(1mg/kg，每周两次，共3个月)处理的5xfad小鼠的额叶皮质或海马体中gfap染色没有显著不同。统计学数据通过单因素anova和tukey检验确定。结论这项研究表明，具有乙酰胆碱酯酶抑制活性和5-ht4受体激动剂活性的化合物(多奈必利)在向阿尔茨海默病的转基因小鼠模型5xfad小鼠长期施用后，发挥抗淀粉样蛋白作用(降低aβ42水平和淀粉样蛋白斑块)和抗炎作用(减少星形胶质细胞增生)。这些作用在内嗅皮质和额叶皮质中最明显。此外，长期施用多奈必利能够发挥抗健忘作用并防止5xfad小鼠出现记忆力衰退。所有这些作用与rs67333(作为参考的5-ht4受体激动剂)的作用相当，有时甚至更大，指出乙酰胆碱酯酶抑制活性和5-ht4受体激动剂活性的组合是对抗阿尔茨海默病的有前景的药物。实施例3该实施例显示了在存在aβ1-42损伤的存在下，rs67333(5-ht4受体激动剂)和多奈哌齐对大鼠原代海马神经元的协同作用。在研究协同活性之前，在该研究的第一部分中评估了每种分子的作用。评估了单独的rs67333在被aβ损伤的大鼠原代海马神经元中的作用(暴露24h)。在第二步中，评估了rs67333和多奈哌齐(8种浓度的混合化合物)在被aβ损伤的大鼠原代海马神经元中的协同作用(暴露24h)。材料和方法海马神经元的原代培养所有实验均按照美国国家卫生研究院《实验动物的护理和使用指南》进行，并遵循欧盟现行法规(指令2010/63/eu)。协议号：a1301310。如callizot等人.(2013)j.neurosci.res.91706-716描述的，培养大鼠海马神经元。将妊娠17天的怀孕的雌性大鼠(wistar大鼠；janvierlabsfrance)在co2室中深度麻醉并颈脱位法处死。然后，将胎儿从子宫中取出，并立即置于冰冷的l15leibovitz培养基中，该培养基中含有2％青霉素(10,000u/ml)和链霉素(10mg/ml)溶液(ps)以及1％牛血清白蛋白(bsa)。将海马体在37℃下用终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％edta的胰蛋白酶-edta溶液处理20分钟。通过添加含4.5g/l葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基(dmem)来终止解离，该培养基中还含有ii级dna酶i(终浓度为0.5mg/ml)和10％的胎牛血清(fcs)。通过10ml移液枪头的吹打三次将细胞机械解离。然后将细胞在4℃下以515xg离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于限定培养基中，该培养基由含有2％的b27补充剂的溶液、2mmol/ll-谷氨酰胺、2％ps溶液和10ng/ml的脑源性神经营养因子(bdnf)的神经基础培养基组成。使用台盼蓝排斥试验，在neubauer细胞计数仪中对活细胞进行计数。将细胞以每孔20,000个的密度接种在预涂有聚l-赖氨酸的96孔板中，并在37℃下在空气(95％)-co2(5％)培养箱中培养。每2天更换一次培养基。对于96孔板，仅使用60个孔。不使用第一行、最后一行以及第一列和最后一列的孔(以避免任何边缘效应)，并用无菌水填充。测试化合物和人aβ1-42暴露预培养：在培养的第17天，将化合物溶解在培养基中，并与原代海马神经元预温育1小时，然后暴露于aβ1-42。损伤：培养17天后，使海马神经元暴露于aβ溶液(见下文)。根据callizot等人.(2013)j.neurosci.res.91706-716所述的程序，完成aβ1-42制备。本研究中使用的aβ1-42批号包含10％的低聚物(如combes等人(2015)j.neurosci.res.93:633-643所述，通过wb定量)。简而言之，将aβ1-42肽以40μmol/l的初始浓度在上述限定的培养基中溶解。将该溶液在黑暗中于37℃轻轻搅拌3天，并在培养基中适当稀释至所用浓度(20μmol/l或2.5μmol/l，分别对应于2μmol/l或0.25μmol/l的低聚物(aβo))后立即使用。在化合物存在下，将aβ1-42制剂添加到对照培养基中，使其稀释至终浓度20或2.5μmol/l(分别为2μmol/l或0.25μmol/l的aβo，通过自动wb测定)。培养板的安排在96孔板中对一种培养物测试了测试化合物(每种条件6个孔)。在施加aβ1-42之前1小时预温育化合物。评估了以下条件：步骤1：单独的rs67333板1(map-2/tau)板2(psd95/syn)对照(载体)对照(载体)+aβ(20μm24h)/载体+aβ(2.5μm24h)/载体+aβ(20μm24h)/rs67333(100pm)+aβ(2.5μm24h)/rs67333(100pm)+aβ(20μm24h)/rs67333(1nm)+aβ(2.5μm24h)/rs67333(1nm)+aβ(20μm24h)/rs67333(10nm)+aβ(2.5μm24h)/rs67333(10nm)+aβ(20μm24h)/rs67333(50nm)+aβ(2.5μm24h)/rs67333(50nm)+aβ(20μm24h)/rs67333(100nm)+aβ(2.5μm24h)/rs67333(100nm)+aβ(20μm24h)/rs67333(500nm)+aβ(2.5μm24h)/rs67333(500nm)+aβ(20μm24h)/rs67333(1μm)+aβ(2.5μm24h)/rs67333(1μm)+aβ(20μm24h)/rs67333(10μm)+aβ(2.5μm24h)/rs67333(10μm)步骤2：协同作用终点评估中毒后24小时，将上清取出并立即冷冻用于将来进行分析。将它们在-20℃下保存长达6个月。然后，将海马神经元在-20℃下用乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定5分钟。将它们在pbs中再次洗涤两次，然后透化，并使用含有0.1％皂苷和1％fcs的pbs溶液在室温下封闭非特异性位点15分钟。免疫染色：map-2/at100-固定和透化后，将细胞与以下物质温育2小时：-在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/1000稀释的鸡多克隆抗体抗微管相关蛋白2(map-2)(该抗体对神经元细胞体和神经突进行特异性染色，使得能够研究神经元细胞死亡和神经突网络)；和-在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/100稀释的小鼠单克隆抗体抗磷酸tau(at100)。这些抗体通过用在含有1％fcs和0.1％皂苷的pbs中以1/400稀释的alexafluor488山羊抗小鼠igg和alexafluor568山羊抗鸡igg室温下处理1小时来显现。对于每种条件，使用imagexpress(moleculardevices公司)在20倍放大倍率下每孔拍摄30张照片(代表整个孔区域)。使用相同的采集参数生成所有图像。由图像，通过“自定义模块编辑器”(moleculardevices公司)自动执行分析。研究了以下读数：-神经元总数(神经元存活，map-2阳性神经元数目)-神经突网络(以map-2阳性神经元的μm为单位)-at100的面积(μm2，与map-2阳性神经元重叠)。免疫染色：psd95和syn固定和透化后，将细胞与以下物质温育2小时：-在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/200稀释的小鼠抗突触后致密物95kda(psd95)；-在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/100稀释的兔多克隆抗体抗突触素(syn)。这些抗体通过用在含有1％fcs和0.1％皂苷的pbs中以1/400稀释的alexafluor488山羊抗小鼠igg和alexafluor568山羊抗兔igg室温下处理1小时来显现。对于每种条件，使用imagexpress(moleculardevices公司)在20倍放大倍率下每孔拍摄40张照片。使用相同的条件拍摄所有图像。通过使用“自定义模块编辑器”(moleculardevices公司)自动执行突触评估。评估了以下终点：-突触的总数(psd95/syn之间重叠)统计分析所有值均以平均值±sem(平均值的标准误差)表示。通过单因素anova，然后进行dunnett检验或lsdfisher检验，进行统计学分析。p<0.05被认为是显著的。结果这项研究旨在研究rs67333与多奈哌齐之间潜在的协同作用。该研究的第一步旨在鉴定对所选参数(神经元存活、神经突网络的完整性、tau过度磷酸化、突触保留)的最低活性剂量。该研究的第二步旨在测试rs67333和多奈哌齐对相同参数(神经元存活、神经突网络的完整性、tau过度磷酸化、突触保留)的无活性剂量的不同组合。rs67333对被aβ1-42损伤的海马神经元的作用aβ1-42损伤引起海马神经元损失，以及神经突网络损失、tau过度磷酸化和突触损失。rs67333显示了对神经元存活(图1a)、总神经突网络(图1b)、每个神经元的平均神经突长度(图1c)、tau过度磷酸化(图1d)和突触损失(图1e)的保护作用。最低保护活性剂量为：在该模型中多奈哌齐的最低活性剂量为1nm(表7)。表7：多奈哌齐在被aβ1-42损伤的海马神经元的原代培养物中的神经保护作用结果表示为占对照的百分比，以平均值表示。*指多奈哌齐相对于aβ1-42条件有显著(p<0.05)的作用。与该研究的第一步所产生的结果一致，将以下rs67333和多奈哌齐的组合物施加在被aβ1-42损伤的海马神经元的原代培养物中：组合物多奈哌齐rs6733311pm10pm21pm100pm31pm1pm410pm10pm510pm100pm610pm1pm7100pm100pm8100pm1pmrs67333和多奈哌齐对被aβ1-42损伤的海马神经元的协同作用对所有参数均证实了aβ1-42肽的神经毒性，并且这种神经毒性对所有参数均类似于在步骤1中观察到的损伤(参见图2)。rs67333和多奈哌齐的无活性剂量的几种组合物具有神经保护作用：·#6组合物(多奈哌齐10pm和rs673331nm)改善了神经元的存活率。·#4至#8组合物能够显著改善神经突网络的总长度。使用#6组合物(10pm的多奈哌齐和1nm的rs67333)观察到了最大的效果。有趣的是，#6和#8组合物增加了每个神经元中神经突的平均长度。·几乎所有组合物(从#2至#8)都能够减少at100表位上tau过度磷酸化。使用#6组合物(10pm的多奈哌齐和1nm的rs67333)观察到了最大的效果。·#6至#7组合物保护突触免受aβ1-42损伤。讨论本研究的目的是在阿尔茨海默病的体外模型中确定rs67333与多奈哌齐之间的潜在协同作用。表8总结了协同作用的结果：表8：多奈哌齐和rs6733的组合物在被aβ1-42损伤的海马神经元的原代培养物中的神经保护作用结果表示为占对照的百分比，以平均值表示。*指多奈哌齐相对于aβ1-42条件有显著(p<0.05)的作用。与上述结果一致，可以得出以下结论：·步骤1：-对tau过度磷酸化，rs67333的最低活性浓度为1nm。rs67333的最低神经保护(神经元存活)浓度为50nm。-多奈哌齐的最低活性浓度为1nm。·步骤2：-rs67333和多奈哌齐的组合物对所有研究的参数均显示出明显的协同作用。-rs67333和多奈哌齐的协同作用对于以下方面来说优于多奈哌齐的第一有效剂量所获得的作用：神经元存活(协同作用：80％存活；单独的多奈哌齐：75％)神经突网络(协同作用：80％存活；单独的多奈哌齐：75％)at100(协同作用：141％；单独的多奈哌齐：165％)总而言之，这项研究的结果清楚地证明了阿尔茨海默病体外模型中rs67333和多奈哌齐之间具有协同作用。当前第1页12