人绒毛膜促性腺激素(HCG)的延长释放制剂的制作方法

i.
背景技术：
：人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin，hcg)是由人胎盘和性腺的合体滋养层细胞产生的激素。hcg与两性性腺中存在的黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体(luteinizinghormone/choriogonadotropinreceptor，lhcgr)(也称为促黄体素/绒毛膜促性腺激素受体(lcgr)或黄体生成素受体(luteinizinghormonereceptor，lhr)相互作用。hcg的作用类似于垂体黄体生成素(luteinizinghormone，lh)的作用，因为：两种激素均刺激睾丸莱迪希细胞(leydigcell)产生睾酮和其他类固醇激素，并且两种激素均刺激卵巢黄体产生孕酮。在胎儿发育期间，胎盘产生的hcg刺激胎儿睾丸产生雄激素，这对正常男性性发育是重要的。在成人中，施用外源hcg刺激由睾丸莱迪希细胞产生睾酮。对于患有促性腺激素功能低下型性腺功能减退症(hypogonadotrophichypogonadism)的男性，外源施用hcg可刺激睾丸莱迪希细胞并恢复正常的睾酮产生。当不存在下降的解剖学障碍时，施用hcg还可刺激患有隐睾的男孩的睾丸下降。在女性中，在怀孕初期由胎盘产生的hcg刺激卵巢并促进黄体的维持。这使得黄体能够在早期妊娠期间分泌激素孕酮。孕酮使得子宫具有厚的血管和毛细血管内衬(lining)以使得其可维持胎儿生长。在正常的月经周期期间，lh与fsh一起参与正常卵泡的发育和成熟并且中期lh激增触发排卵。在成年女性中，临床施用外源hcg可代替lh激增。对于正在接受体外受精的妇女，hcg被广泛地胃肠外使用用于最终成熟诱导。在存在一个或更多个成熟卵泡的情况下，可通过施用hcg触发排卵。另外，在治疗不孕期间，出于临床目的有时使用hcg以增强孕酮的产生。由于最丰富的生物来源是目前妊娠的妇女，因此一些组织从妊娠妇女收集尿以提取hcg用于药物用途，以商品名和销售的剂型。重组hcg通过中国仓鼠卵巢(chinesehamsterovary，cho)细胞产生并且可以以商品名销售的剂型商购获得。目前市售的hcg剂型限于肌内(intramuscular，im)或皮下(subcutaneous，sc)可注射形式，其在短时间内将血清hcg水平提高至治疗水平。对于其中需要持续给药hcg的数种临床应用，需要频繁注射。这些应用包括但不限于治疗促性腺激素功能低下型性腺功能减退症和刺激孕酮产生以用于女性生育力。本领域需要延长释放的hcg剂型。本发明满足了这一需求。ii.发明概述本公开内容涉及本领域中长期感觉性需要的延长释放人绒毛膜促性腺激素(hcg)制剂。特别地，本公开内容涉及具有延长释放谱的hcg剂型。在一些实施方案中，hcg剂型表现出约1周至约2个月的释放谱。在另一些实施方案中，本文中所述的hcg剂型可具有约1周至约6个月的延长释放谱。在一些方面中，延长释放hcg剂型包含包封在微球中的hcg。在另一些方面中，微球由共聚物形成。在另一些方面中，共聚物是嵌段共聚物或多嵌段共聚物。在这样的方面中，嵌段共聚物可包含聚乙二醇(peg)或含peg聚合物嵌段和一种或更多种其他聚合物嵌段，或者作为替代地基本上由其组成。本文中所述的hcg延长释放制剂可用于与激素治疗相关的多种治疗，包括但不限于对不孕和垂体腺病症(pituitaryglanddisorder)的治疗。因此，本公开内容的另一些方面涉及施用本文中所述的延长释放hcg制剂的方法，以及采用本文中所述的延长释放hcg制剂进行治疗的方法。这样的方法包括治疗生育力和垂体腺缺陷。本文中公开的另一些方法包括对乳腺癌的治疗。在一些实施方案中，该治疗针对未生育过的女性中的现有乳腺癌。在一些实施方案中，这些女性约25岁或更年轻。在另一个实施方案中，涵盖了根据达到或接近图1的理论释放谱的方案施用所述延长释放hcg剂型的方法。本文中描述和要求保护的本发明具有许多属性和实施方案，包括但不限于本发明概述中阐述或描述或提及的那些。其不旨在全部是包括性的并且本文中描述和要求保护的本发明不限于本发明概述中确定的特征或实施方案，或者不受本发明概述中确定的特征或实施方案的限制，本发明概述仅出于举例说明而非限制性的目的而被包括在内。另外的实施方案可在以下附图说明和发明详述中公开。iii.附图简述图1.hcg延长释放制剂的示例性理论释放谱。图2.包含hcg微球的hcg延长释放制剂的累积释放谱(μg(释放))，其示出了在14天时间内释放的hcg总量；a图描绘了每种单独制剂的累积释放，并且b图描绘了每种制剂的平均累积释放。图3.包含针对hcg微球的hcg总含量(释放％)归一化的hcg微球的hcg延长释放制剂的释放谱。释放谱示出了在14天时间内释放的hcg总量；a图描绘了每种单独制剂的累积释放，并且b图描绘了每种制剂的平均累积释放。图4.针对制剂11计算的在14天时间内的实际体外释放谱(释放％)，所述制剂11是包含hcg微球的hcg延长释放制剂。图5.基于严格规划(regimented)施用每7天3mg且cmin为18ng/ml的制剂11的预测释放谱。图6.基于严格规划施用每14天3mg且cmin为1.7ng/ml的制剂11的预测释放谱。图7.基于严格规划施用每28天3mg且cmin为0.07ng/ml的制剂11的预测释放谱。图8.基于严格规划施用每7天250μg并且t1/2为36小时且cmin为3ng/ml的制剂11的预测释放谱。图9.基于严格规划施用每14天250μg并且t1/2为36小时且cmin为0.3ng/ml的制剂11的预测释放谱。图10.包含hcg微球的hcg延长释放制剂的累积释放谱(μg(释放))，其示出了在50天时间内释放的hcg总量；a图描绘了每种单独制剂的平均累积释放，并且b图描绘了每种制剂的归一化释放谱(释放％)。图11.hplc色谱图，其示出了对hcg进行浓缩之后的其纯度。图12.与dong-ahcg相比的分子量的凝胶分析。图13.来自第1轮体外释放的hcg的纯度分析。图14.包含hcg微球的延长释放制剂的累积释放谱(每种制剂以三个重复运行)，其示出了在40天时间内释放的hcg总量：a图描绘了每个重复的累积释放谱(μg(释放))，b图描绘了归一化谱(基于高效尺寸排阻色谱的％)，c图描绘了每种制剂的归一化释放谱(释放％)。图15.图14中描绘的重复的平均释放谱。图16.针对包含hcg微球的延长释放制剂695-01-0034的三个重复运行的累积释放谱，其示出了在40天时间内释放的hcg总量：a图描绘了每个重复的累积释放谱(μg(释放))，b图描绘了归一化谱(基于高效尺寸排阻色谱的％)，c图描绘了每种制剂的归一化释放谱(释放％)。图17.浓缩的hcg溶液的rp-uplc色谱图。图18.由synbiosys50cp10c20-ll40和30cp30c40-ll40的混合物构成的hcg延长释放微球的sem照片。图19.包含由synbiosys50cp10c20-ll40和30cp30c40-ll40的混合物构成的hcg微球的hcg延长释放制剂的累积释放谱。释放谱(每种制剂的三个重复的平均值)针对每种制剂的hcg总含量(释放％)进行了归一化并示出了在60天时间内释放的hcg总量。图20.包含由synbiosys50cp10c20-ll40和30cp30c40-ll40(ja16043)的33/66％w/w混合物构成的hcg微球的hcg延长释放制剂的累积释放谱。释放谱(每种制剂的三个重复的平均值)针对制剂的hcg总含量(释放％)进行了归一化并示出了在35天时间内释放的hcg总量和完整hcg％(相对于总量)。图21.由20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo](批号ja16101)构成的hcg延长释放微球的sem照片。图22.由synbiosys20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo](ja16101和ja16102)构成的hcg延长释放制剂的累积释放谱。释放谱(每种制剂的三个重复的平均值)针对每种制剂的hcg总含量(释放％)进行了归一化并示出了在70天时间内释放的hcg总量和完整hcg％(相对于总量)。图23.接受每日hcg注射的对照组猴中血清hcg水平(a图)和血清睾酮水平(b图)。图24.用代表总剂量为200、600和1200μghcg的hcg延长释放微球处理的猴中血清r-hcg和睾酮水平：a图描绘了前48小时的血清r-hcg水平，b图描绘了完整28天研究持续时间的血清r-hcg水平并且c图描绘了完整28天研究持续时间的血清睾酮水平。图25.用代表总剂量为200μg(a图)、600μg(b图)和1200μghcg(c图)的hcg延长释放微球处理的猴中血清r-hcg和睾酮水平。图26.rhcg及其潜在降解产物的sec-uplc色谱图。图27.由synbiosys20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo]构成的ovidrelhcg延长释放制剂的累积释放谱。释放谱(每种制剂的三个重复的平均值)针对每种制剂的hcg总含量(释放％)进行了归一化并示出了用优化的体外溶出方法测量的在49天时间内释放的hcg总量。图28.hcg诱导产生的孕酮相对于由ovidrel产生的孕酮的百分比。a)在2小时、23天和37天时从微球批次释放的hcg；b)从微球中提取的(amd-18-022-1)或在提取缓冲液中掺入的(amd-18-022-4)hcg以及c)由作为时间的函数的从批次ms18-037、ms18-038和sr18-031释放的hcg产生的孕酮相对于ovidrel的平均百分比。图29.从hcg延长释放微球提取的hcg的2-ab聚糖映射的结果。iv发明详述本发明涉及延长释放hcg剂型。在本领域中长期感觉性需要这样的剂型，因为目前所有市售hcg剂型均是用于肌内或皮下注射的液体。此外，所有目前市售的hcg剂型均具有立即释放特性，因此血清水平不是持续的并且受hcg半衰期(约36小时)的限制。这意味着患者需要在一段时间内频繁注射以获得所期望的hcg治疗水平，这可能不方便并且因此导致患者依从性差或者导致患者和提供者选择不太有效的治疗。在一些方面中，延长释放hcg剂型包含包封在微球中的hcg或者其衍生物或同种型。在另一些方面中，微球由共聚物形成。在另一些方面中，共聚物是嵌段共聚物或多嵌段共聚物。在这样的方面中，嵌段共聚物可包含聚乙二醇(peg)或含peg聚合物嵌段和一种或更多种其他聚合物，或者作为替代地基本上由其组成。在下文中将更全面地描述根据本公开内容的一些实施方案。然而，本公开内容的一些方面可以以不同形式呈现，并且不应被解释为限于本文中阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案以使得本公开内容全面且完整并向本领域技术人员充分地传达本发明的范围。在本文的说明书中使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的并且不旨在进行限制。a.人绒毛膜促性腺激素本文中使用的术语“人绒毛膜促性腺激素”或“hcg”是指与该名称相关的特异性糖蛋白和具有类似生物学功能的任何其他分子，其与天然存在hcg或其同种型共有至少约80％的氨基酸序列同一性。hcg衍生物和同种型也可用于本文中所述的组合物和方法。在另一些实施方案中，与天然存在hcg具有至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％氨基酸序列同一性的hcg变体可用于本发明的组合物。实质上，hcg由植入后胎盘中的合体滋养层产生并且少量由性腺产生。它是在所有年龄的男性和女性的垂体腺中产生的lh的类似物。hcg也可合成产生并且可商购获得。本文中使用的hcg可以是指糖蛋白的重组形式，例如但不限于dong-a的重组hcg[产品代码da-3803]、证明与这些产品中的任一种生物等同的另一种重组hcg，或其通用形式。参见例如，seoetal.，biodrugs，1；25(2)：115-27(2011)。在一些实施方案中，这样的重组hcg由动物(例如人或其他哺乳动物)细胞系或细菌细胞系产生。在一些实施方案中，这样的重组hcg为约40至约60kda，例如至少或约40kda、至少或约41kda、至少或约42kda、至少或约43kda、至少或约44kda、至少或约45kda、至少或约46kda、至少或约47kda、至少或约48kda、至少或约49kda、至少或约50kda、至少或约51kda、至少或约52kda、至少或约53kda、至少或约54kda、至少或约55kda、至少或约56kda、至少或约57kda、至少或约58kda、至少或约59kda或约60kda。本文中使用的hcg也可以是指分离的天然产生的hcg，例如但不限于尿来源的hcg证明与这些产品中的任一种生物等同的另一种重组hcg，或其通用形式。hcg是约38kda的异二聚体，其包含α和β亚基。α亚基具有92个氨基酸和两个n-连接的碳水化合物链。β亚基具有145个氨基酸以及两个n-连接的和四个o-连接的碳水化合物链。单独的亚基通过异二聚体中的非共价相互作用保持在一起，而异二聚体以及α和β亚基几乎没有或者没有疏水核心。二硫键(α-亚基中的五个和β-亚基中的六个)使结构稳定。在α亚基中有十个半胱氨酸的同源放置并且β亚基包含十二个保守的半胱氨酸。banerjeeetal.，indianj.ofexp.biol.，40：434-447(2002)。两种亚基均由由三个二硫桥和四条多肽链形成的胱氨酸结基序组成。在每个亚基中，从中央胱氨酸结出现三个发夹环。糖蛋白激素(例如hcg)是具有激素活性的最复杂的分子。cahoreauetal.，frontendocrinol.(lausanne)，6：26(2015)。hcg异质性：妊娠血清中存在多种hcg分子形式，包括无生物活性的解离或降解的分子。已知的hcg同种型的一些实例包含完整hcg(“hcg”)、带切口hcg(“hcgn”)、hcgβ-亚基(“hcgβ”)、带切口hcgβ-亚基(“hcgβn”)、hcgβ核心片段(“hcgβcf”)和hcgα-亚基(“hcgα”)。b.共聚物微球本文中使用的术语“微球”是指包封内部空隙的直径为约999μm或更小的球形或球状体颗粒，在所述内部空隙中可负载一种或更多种治疗剂以用于药物递送。本公开内容的一些方面涉及由共聚物形成的微球。在一些实施方案中，这些共聚物可基于具有以下特征中的一种或更多种的共聚物或其部分来选择：(i)聚合物形成晶格以使得酸能够自由流动或使得酸能够释放，(ii)聚合物保护hcg活性成分免受其储存的环境和/或微球释放到其中的环境的影响(例如温度稳定性)，(iii)聚合物是亲水性的，(iv)聚合物降解而不影响hcg的纯度，(v)聚合物是可生物降解的，(vi)聚合物能够使活性成分(hcg)扩散，和/或(vii)聚合物将适应hcg的流体动力学半径(例如或dong-ahcg的流体动力学半径)。基于微球的总重量，微球可在约24小时内释放少于约3％至约40％的其中的hcg。出乎意料的是，可制备利用本文中所述的聚合物的稳定的hcg延长释放制剂，因为已知hcg在升高的温度(例如体温)下降解。还已知其响应于ph变化而降解。因此，在本发明之前，认为向患者或对象成功施用hcg的唯一方式是通过注射。本发明详述了令人惊讶的发现，即聚合物可用于形成稳定的hcg延长释放制剂，其中组分hcg不因体内存在的温度或ph而降解。包含hcg或者其衍生物或同种型的微球可通过本领域技术人员已知的技术，包括但不限于溶剂蒸发和喷雾干燥技术来制备。在一些实施方案中，形成具有以下水-聚合物比的微球：约0.1至约1.0，例如但不限于约0.5至约1.0、约0.55至约1.0、约0.6至约1.0、约0.65至约1.0、约0.7至约1.0、约0.75至约1.0、约0.8至约1.0、约0.85至约1.0、约0.9至约1.0或约0.95至约1.0。在一些实施方案中，微球的水-聚合物比为约0.5、约0.55、约0.6、约0.65、约0.7、约0.75、约0.8、约0.85、约0.9、约0.95或约1.0。这些水聚合物比可基于用于形成微球的聚合物和/或hcg或者其衍生物或同种型的浓度来调节以实现特定的释放谱。参见bosetal.，pharmaceuticaltechnology，october2011：110120。在一些实施方案中，微球的直径为至少约1μm、至少约2μm、至少约5μm、至少约10μm、至少约20μm、至少约30μm、至少约40μm、至少约50μm、至多约50μm、至多约60μm、至多约70μm、至多约80μm、至多约90μm或至多约100μm。在一些实施方案中，微球的直径为约20μm至约100μm、约30μm至约100μm、约30μm至约50μm或约50μm至约100μm。在一些实施方案中，用于制备微球的hcg的浓度为至少约5mg/ml、至少约10mg/ml、至少约15mg/ml、至少约20mg/ml、至少约25mg/ml、至少约30mg/ml、至少约35mg/ml、至少约40rng/ml、至少约45mg/ml、至少约50mg/ml、至少约55mg/ml、至少约60mg/ml、至少约65mg/ml、至少约70mg/ml、至少约75mg/ml、至少约80mg/ml、至少约85mg/ml、至少约90mg/ml、至少约95mg/ml、至少约100mg/ml。用于制备微球的hcg的浓度可以为约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约95mg/ml、约100mg/ml或更多蛋白质。b1.由polyactivetm多嵌段共聚物构成的hcg微球在某些方面中，共聚物是嵌段共聚物并且可任选地包含聚乙二醇(peg)和一种或更多种其他聚合物，或者作为替代地基本上由其组成。在一些方面中，所述一种或更多种其他聚合物可任选地选自聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚对苯二甲酸丙二醇酯和聚对苯二甲酸丁二醇酯(pbt)。一些非限制性示例性聚合物是由octoplus和/或reddy博士实验室产生的具有例如以下重复聚合物单元的化学结构的polyactivetm聚合物：polyactivetm聚合物由一系列聚(醚酯)多嵌段共聚物(基于聚(乙二醇)(peg)和聚(对苯二甲酸丁二醇酯)(pbt))表示。该体系的主要优点是改变两个构件单元(buildingblock)中每一个的量和长度从而创建多样化的定制聚合物家族的能力。聚合物基体特征，例如控制释放的速率、降解、溶胀和强度可通过适当组合两种共聚物区段精确地控制。虽然polyactivetm聚合物在本发明之前已用于药物递送系统，但是在本发明之前，该聚合物尚未成功配制成用于高度复杂的糖蛋白例如hcg。特别是，先前有关polyactivetm聚合物的出版物指出该聚合物可用于控制释放“生物药物和小的亲脂性分子”p.mansell，“octoplusbroadensrightstopolyactivedeliverytechnology，”in-pharmatechnologist.com，日期2007年4月26日(参见http：//www.in-pharmatechnologist.com/ingredients/octoplus-broadens-rights-to-polyactive-delivery-technology，于2016年3月9日下载)。生物药物的一些实例包括蛋白质。当peg聚合物存在于由polyactivepeg/pbt多嵌段共聚物制备的hcg微球剂型中时，peg的长度可在约1000至约2500g/mol之间变化。一些非限制性实例包括以下peg长度：至少约1000g/mol、至少约1100g/mol、至少约1200g/mol、至少约1300g/mol、至少约1400g/mol、至少约1500g/mol、至少约1600g/mol、至少约1700g/mol、至少约1800g/mol、至少约1900g/mol、至多约2000g/mol、至多约2100g/mol、至多约2200g/mol、至多约2300g/mol、至多约2400g/mol或至多约2500g/mol。在一些实施方案中，存在于由polyactivepeg/pbt多嵌段共聚物制备的hcg微球剂型中的peg和一种或更多种其他聚合物以以下比例(按重量计)存在：约80/20至约60/40，例如但不限于约79/21至约60/40、约78/22至约60/40、约77/23至约60/40、约76/24至约60/40、约75/25至约60/40、约74/26至约60/40、约73/27至约60/40、约72/28至约60/40、约71/29至约60/40、约70/30至约60/40、约69/31至约60/40、约68/32至约60/40，以及约67/33至约60/40。重量比的一些实例包括约80/20、约79/21、约78/22、约77/23、约76/24、约75/25、约74/26、约73/27、约72/28、约71/29、约70/30、约69/31、约68/32或约67/33。b2.由包含结晶聚(l-丙交酯)构件单元的多嵌段共聚物构成的hcg微球可用于本发明的持续释放hcg组合物中的其他示例性聚合物包括由innocorepharmaceuticals生产的聚合物。innocore的技术提供了专门设计成作为药物递送系统发挥作用的可生物吸收聚合物的新平台。所述聚合物由已批准用于人应用的d，l-丙交酯、乙交酯、ε-己内酯和聚乙二醇构成。虽然聚合物在本发明之前已用于药物递送系统，但是在本发明之前该聚合物尚未成功配制成用于高度复杂的糖蛋白例如hcg。聚合物描述于wo-a-2013/015685中，其全部内容同此通过引用并入。其中描述的可生物降解半结晶的相分离的热塑性多嵌段共聚物包含至少一个可水解预聚物(a)区段和至少一个可水解预聚物(b)区段，其中所述多嵌段共聚物在生理条件下的tg为37℃或更低并且tm为110至250℃，其中所述区段通过多官能扩链剂连接，其中所述区段在聚合物链上随机分布，并且其中预聚物(a)区段包含聚乙二醇。生理条件下(即在体内)的形态和特性可能与环境条件(干燥、室温)下的形态和特性不同。本文中使用的转变温度tg和tm是指在当在体内应用时(即，当处于与水蒸气饱和的大气平衡且处于体温时)物质的相应值。这可通过在使物质与水饱和大气平衡之后进行dsc测量来体外模拟。预聚物(a)区段可包含选自二醇、二羧酸和羟基羧酸的酯形成单体(esterformingmonomer)的反应产物。优选地，预聚物(a)区段包含乙交酯、丙交酯(d和/或l)、ε-己内酯和/或δ-戊内酯的反应产物。预聚物(a)区段的mn可以为约500g/mol或更大，例如约700g/mol或更大、约1000g/mol或更大、约2000g/mol或更大、约3000g/mol或更大或者约4000g/mol或更大。通常来说，预聚物(a)区段的mn为约80000g/mol或更小。预聚物(b)区段优选地包含聚(l-丙交酯)，更优选mn为约1000g/mol或更大，例如约2000g/mol或更大、约3000g/mol或更大或者约4000g/mol或更大的聚(l-丙交酯)。通常来说，预聚物(b)区段的mn为约80000g/mol或更小。基于多嵌段共聚物的总重量，多嵌段共聚物中预聚物(a)的含量可以为约10％至约90％，例如约30％至约75％或约50％至约70％。基于多嵌段共聚物的总重量，多嵌段共聚物中预聚物(b)的含量可以为约10％至约90％，例如约25％至约70％或约30％至约50％。多官能扩链剂可以是双官能脂肪族扩链剂，优选二异氰酸酯，例如1，4-丁烷二异氰酸酯或1，6-己烷二异氰酸酯。基于聚(l-丙交酯)的多嵌段共聚物中的聚乙二醇的mn可以为约150至约5000g/mol，例如约200g/mol至约1500g/mol、约600至约1000g/mol、约400至约3000g/mol、约600至约1500g/mol、约600至约5000g/mol或约1000至约3000g/mol。优选地，可生物降解的多嵌段共聚物在生理条件下的溶胀比为约1至约4，优选约1至约2，更优选约1至约1.5。在一个实施方案中，可生物降解的多嵌段共聚物是[聚(ε-己内酯)-co-聚乙二醇-co-聚(ε-己内酯)]-b-[聚(l-丙交酯)]多嵌段共聚物。b2.由包含结晶聚(对二氧环己酮)构件单元的多嵌段共聚物构成的hcg微球在某些方面中，可生物降解的多嵌段共聚物包含可生物降解的相分离的热塑性多嵌段共聚物，所述热塑性多嵌段共聚物包含至少一个非晶态可水解预聚物(a)区段和至少一个半结晶可水解预聚物(b)区段，其中-所述多嵌段共聚物在生理条件下的tg为约37℃或更低并且tm为约50至约110℃；-所述区段通过多官能扩链剂连接；-所述区段在聚合物链上随机分布；并且-所述预聚物(b)区段包含x-y-x三嵌段共聚物，其中y是聚合引发剂，并且x是以对二氧环己酮单体单元表示的嵌段长度为约7或更大的聚(对二氧环己酮)区段。x优选地为以对二氧环己酮单体单元表示的嵌段长度为约7至约35，例如约8至约30、约9至约25、约10至约20或约12至约15的聚(对二氧环己酮)区段。预聚物(a)区段的至少一部分可来源于水溶性聚合物，例如按预聚物(a)总重量计约30％或更多、约40％至约95％、约50％至约90％或约60％至约85％。预聚物(a)可例如包含环状单体和/或非环状单体的反应产物。合适的非环状单体可例如选自琥珀酸、戊二酸、己二酸、癸二酸、乳酸、乙醇酸、羟基丁酸、乙二醇、二甘醇、1，4-丁二醇和/或1，6-己二醇。合适的环状单体可例如选自乙交酯、丙交酯、ε-己内酯、δ-戊内酯、三亚甲基碳酸酯、四亚甲基碳酸酯、1，5-二氧杂环庚烷-2-酮、1，4-二烷-2-酮(对二氧环己酮)和/或环酐，例如氧杂环庚烷-2，7-二酮。优选地，预聚物(b)区段包含相对大的聚(对二氧环己酮)部分。例如，按预聚物(b)区段的总重量计约70％或更多，优选约80％或更多，更优选约90％或更多可以是聚(对二氧环己酮)。预聚物(b)区段的数均分子量mn可以为约1300至约7200g/mol，优选约1300至约5000g/mol，更优选约1500至约4500g/mol，甚至更优选约2000至约4000g/mol，例如约2200至约3000g/mol。预聚物(b)区段的重均分子量mw可以为约1800至约10800g/mol，优选约1800至约7000g/mol，更优选约2100至约6300g/mol，甚至更优选约2600至约5600g/mol，例如约3000至约4200g/mol。预聚物(b)区段的tg可小于约0℃，例如小于约-20℃，或小于约-40℃。预聚物(b)区段的tm可以为约60至约100℃，优选约75至约95℃。水溶性聚合物可选自或来源于由以下组成的聚合物组：聚醚，例如聚乙二醇(peg)、聚四亚甲基氧化物(polytetramethyleneoxide，ptmo)、聚丙二醇(polypropyleneglycol，ppg)、聚乙烯醇(polyvinylalcohol，pva)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，pvp)、聚乙烯己内酰胺、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(聚-hema)、聚磷腈，或这些聚合物的共聚物。优选地，水溶性聚合物来源于聚乙二醇。更优选地，水溶性聚合物来源于mn为约150至约5000g/mol的聚乙二醇。扩链剂可以是双官能脂肪族扩链剂。优选地，扩链剂是二异氰酸酯，例如1，4-丁烷二异氰酸酯或六亚甲基二异氰酸酯。在一个实施方案中，可生物降解的多嵌段共聚物是[聚(ε-己内酯)-co-聚乙二醇-co-聚(ε-己内酯)]-b-[聚(对二氧环己酮)]多嵌段共聚物。在某些方面中，可生物降解的多嵌段共聚物如[(r1r2nr3)q]r[(r4pr5r6p)]s所示，其中r1和r3各自是r2是r4和r6各自是作为重复r2部分的数目，n为约20至约115，优选约35至约100，更优选约45至约85；作为重复r4和r6部分的数目，p为约7或更大，优选约7至约35，更优选约10至约20，甚至更优选约10至约14；作为(r1r2nr3)嵌段的数均分子量，q为约1000至约7000g/mol，优选约3000至约5000g/mol，更优选约3800至约4200g/mol；作为预聚物(a)区段与预聚物(b)区段的比值，r/s为约0.10至约1.0，例如约0.15至约0.50或约0.20至约0.30。在一个实施方案中，可生物降解的多嵌段共聚物如[(r1r2nr3)q]r[(r4pr5r6p)]s所示，其中r1、r2、r3、r4、r5和r6各自独立地如上定义，并且其中n为约65至约71，p为约11至约13，q为约3800至约4200，r为约15至约25，并且s为约75至约85。当由基于聚(对二氧环己酮)的多嵌段共聚物制备的hcg微球剂型中存在peg聚合物时，peg的长度可在约1000至约5000g/mol之间变化。一些非限制性实例包括以下peg长度：至少约1000g/mol、至少约1200g/mol、至少约1400g/mol、至少约1600g/mol、至少约1800g/mol、至少约2000g/mol、至少约2200g/mol、至少约2400g/mol、至少约2600g/mol、至少约2800g/mol、至少约3000g/mol、至少约3200g/mol、至少约3400g/mol、至少约3600g/mol、至少约3800g/mol、至多约4000g/mol、至多约4200g/mol、至多约4400g/mol、至多约4600g/mol、至多约4800g/mol或至多约5000g/mol。c.制剂本公开内容的一些方面涉及包含多个hcg微球的制剂。这样的制剂可包含根据本文中公开的任一种参数的微球的均质或非均质混合物。此外，这样的制剂可任选地还包含可药用赋形剂和/或与所治疗特定适应证相关的其他组分。d.施用方法和释放谱本文中公开的微球的特征是使得hcg或者其衍生物或同种型能够延长释放的释放谱。在一些方面中，微球或微球制剂中少于或约1/7的hcg或者其衍生物或同种型在施用之后的前24小时内释放，例如少于或约1/14、少于或约1/21、少于或约1/28、少于或约1/29、少于或约1/30、少于或约1/31、少于或约1/33、少于或约1/34、少于或约1/35、少于或约1/42、少于或约1/49、少于或约1/56、少于或约1/57、少于或约1/58、少于或约1/59、少于或约1/60、少于或约1/61或者少于或约1/62。在一些方面中，微球或微球制剂中约2％至约40％的hcg或者其衍生物或同种型在前24小时内释放，例如约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、约10％、约10.5％、约11％、约11.5％、约12％、约12.5％、约13％、约13.5％、约14％、约14.5％、约15％、约15.5％、约16％、约16.5％、约17％、约17.5％、约18％、约18.5％、约19％、约19.5％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％或约40％，或者包含这些值中的两个的任何范围，例如，约18.5％至约26％。不希望受任何理论的束缚，设想上述释放谱使得hcg或者其衍生物或同种型能够延长释放持续指定的时间，例如但不限于约一周或更长、约两周或更长、约三周或更长、约四周或更长、约五周或更长、约六周或更长、约七周或更长、约八周或更长、约一个月或更长、约两个月或更长、或者约7天或更长、约8天或更长、约9天或更长、约10天或更长、约11天或更长、约12天或更长、约13天或更长、约14天或更长、约15天或更长、约16天或更长、约17天或更长、约18天或更长、约19天或更长、约20天或更长、约21天或更长、约22天或更长、约23天或更长、约24天或更长、约25天或更长、约26天或更长、约27天或更长、约28天或更长、约29天或更长、约30天或更长、约31天或更长、约32天或更长、约33天或更长、约34天或更长、约35天或更长、约36天或更长、约37天或更长、约38天或更长、约39天或更长、约40天或更长、约41天或更长、约42天或更长、约43天或更长、约44天或更长、约45天或更长、约46天或更长、约47天或更长、约48天或更长、约49天或更长、约50天或更长、约51天或更长、约52天或更长、约53天或更长、约54天或更长、约55天或更长、约56天或更长、约57天或更长、约58天或更长、约59天或更长、约60天或更长、约61天或更长、或者约62天或更长、约1个月或更长、约2个月或更长、约3个月或更长、约4个月或更长、约5个月或更长、约6个月或更长。设想微球和包含这些微球的制剂可根据本领域已知的任何施用方式来施用，包括但不限于表面、肠内、肠胃外、经口、舌下、通过吸入、鼻、通过注射、皮内、经皮、肌内、皮下、推注给药、输注和/或任何其他合适的方法来施用。在某些方面中，本公开内容涉及达到或接近根据图1的理论释放谱的施用方法。在一些实施方案中，释放谱显示出极少的释放或没有突释(burstrelease)。本公开内容的一些方面涉及接近例如根据图1的释放谱的施用方案。这样的方案包括以以下施用延长释放hcg制剂：约每一周、两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、一个月、两个月、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、约30天、约31天、约32天、约33天、约34天、约35天、约36天、约37天、约38天、约39天、约40天、约41天、约42天、约43天、约44天、约45天、约46天、约47天、约48天、约49天、约50天、约51天、约52天、约53天、约54天、约55天、约56天、约57天、约58天、约59天、约60天、约61天或约62天。e.治疗方法本文中公开的hcg微球及其制剂可用于治疗多种治疗，并基于适应证根据适当的周期和剂量进行施用。适应证可以是人的或兽医学的。一些示例性适应证包括促性腺激素功能低下(hyogonadotropism)、隐睾、黄体期维持(例如在辅助生殖技术中)、避孕、体重减轻、垂体腺病症、乳腺癌和/或与hcg缺乏相关的任何其他疾病或病症。某些实施方案涉及用本文中公开的hcg微球和制剂来治疗乳腺癌。已知妊娠保护免于乳腺癌。不受理论的束缚，预期施用本文中公开的hcg微球和制剂可实现乳腺癌风险降低多至约30％至约40％。参见russoandrusso，molecularbasisofbreastcancer：preventionandtreatment(springerscience&businessmedia，2004)。此外，与本领域中公开的用于施用hcg的方法不同，本文中公开的hcg微球和制剂在3个月内相对于常规hcg的45次施用需要较少的施用，例如少于约10次、少于约9次、少于约8次、少于约7次、少于约6次、少于约5次、少于约4次或少于约3次施用，或者约1或2次施用。在另一些实施方案中，所述制剂以每周1次施用或者每月1次、2次或3次施用方案可有效用于治疗和/或预防乳腺癌。在一些实施方案中，所述治疗针对未生育过的女性中的现有乳腺癌。在一些实施方案中，所述制剂为提供超过一个月的治疗作用的一次注射形式。f.一般定义除非上下文另有清楚地说明，否则在本发明的说明书和所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。当提及可测量值例如量或浓度等时，本文中使用的术语“约”意在涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％，或甚至0.1％的变化。当用于描述本文中公开的任何组分、范围、剂型等的选择时，术语“可接受的”、“有效的”或“足够的”旨在所述组分、范围、剂型等适合于所公开的目的。此外，本文中使用的“和/或”是指并且涵盖一个或更多个相关列举项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)来解释时缺乏组合。本文中使用的术语“包含/包括”旨在意指制剂和方法包含/包括所列举的要素，但不排除其他。本文中使用的过渡短语“基本上由......组成”(和语法变体)应解释为涵盖所列举的物质或步骤“以及不会实质性影响所列举实施方案的基本和新的特征的那些”。参见inreherz，537f.2d549，551-52，190u.s.pq.461，463(ccpa1976)(在原文中强调)；另见mpep§2111.03。因此，本文中使用的术语“基本上由......组成”不应被解释为等同于“包含/包括”。“由......组成”应意指排除其他成分和用于施用本文中公开的制剂的实质性方法步骤中超过痕量的要素。由这些过渡术语中的每一个所定义的方面均在本公开内容的范围内。“制剂”旨在意指活性剂与另外的惰性(例如，可检测试剂或标记)或活性化合物或组合物(例如辅料)的组合。“药物制剂”旨在包含活性剂与惰性或活性载体的组合，使得该制剂适合于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。“可药用载体”是指可用于本发明制剂的任何稀释剂、赋形剂或载体。可药用载体包含离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯类、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。合适的药用载体描述于remington’spharmaceuticalsciences，mackpublishingcompany中，其是该领域中的标准参考文本。优选地根据预期的施用形式，即经口片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂等，并且与常规药学实践一致地对其进行选择。本文中使用的术语“延长释放”是指在指定的时间段内释放活性成分(hcg)的能力。术语“突释”是指将活性成分(hcg)迅速释放到环境中的阶段，以使得在长时间内持续释放不是可持续的。本文中使用的术语“对象”或“患者”可互换使用以意指任何动物。在一些实施方案中，对象可以是哺乳动物；在另一些实施方案中，对象可以是人、小鼠或大鼠。本文中使用的在对象中治疗疾病是指(1)在易患疾病或尚未表现出疾病症状的对象中预防症状或疾病的发生；(2)抑制疾病或阻止其发展；或者(3)改善疾病或疾病症状或者引起所述疾病或疾病症状的消退。如本领域中所理解的，“治疗”是用于获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。出于本技术的目的，有益或期望的结果可包含一种或更多种但不限于减轻或改善一种或更多种症状、降低病症(包括疾病)的程度、使病症(包括疾病)状态稳定(即不恶化)、延迟或减慢病症(包括疾病)进展、改善或缓解病症(包括疾病)状态以及缓解(无论是部分还是全部)(无论是可检出还是不可检检出的)。除非另外定义，否则本文中使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。还将理解的是，除非本文中明确如此定义，否则例如在常用字典中定义的那些术语应被解释为具有与其在本申请和相关领域背景下的含义一致的含义，并且不应被解释为理想化或过度形式化的意义。例如，描述符可用于指代表现出特定器官的特征的生物材料(例如组织、类器官、样品)，例如使用“肝的”来描述肝来源组织或肝类类器官。尽管下文没有明确限定，但是这样的术语应根据其常见含义来解释。在本文说明书中使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而不旨在限制本发明。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入本文。除非另有说明，否则本技术的实践将采用本领域技术内的常规技术。除非上下文另有说明，否则特别预期的是本文中描述的本发明的多个特征可以以任何组合使用。此外，本公开还考虑在一些实施方案中，可排除或省略本文中阐述的任何特征或特征的组合。为了举例说明，如果说明书声明复合物包含组分a、b和c，则特别期望的是可单独或以任何组合省略和声明放弃(disclaim)a、b或c，或者其组合中的任一种。包括范围的所有数字名称，例如ph、温度、时间、浓度和分子量均是近似值，其以(+)或(-)以1.0或0.1的增量进行变化(视情况而定)，或者作为替代地以+/-15％或者作为替代地10％或者作为替代地5％或者作为替代地2％的变化进行变化。应理解，虽然并不总是明确指出，但是所有数字名称之前均带有术语“约”。还应理解，虽然并不总是明确指出，但是本文中所述的试剂仅是示例性的并且这样的等同物是本领域已知的。v.实施例以下实施例是非限制性的并且是对可在使本公开内容生效的多种情况下使用的操作的举例说明。另外，本文中公开的所有参考文献均通过引用整体并入本文。实施例1-市售hcg的比较比较获自emdserono的(“serono”)与dong-ahcg的分子量差异。制备胶体蓝非变性(colloidalbluenative)和sdspage凝胶。还制备了适合于银染(silverstaining)的凝胶，但其产生了不可读的结果。在具有非变性样品和运行缓冲液的非变性凝胶条件下，制备的dong-a和serono二者的apihcg样品均显示出相同的带模式。非变性page(nativepage)分析表明，来自dong-a和serono的hcg之间没有显著的分子量差异。非变性page凝胶上的分子量类似，但由于非相容的标记而导致难以读取。在非非变性和半非变性条件下(存在sds)，来自dong-a和serono的hcg的分子量(44与52kda之间的带)与所列出的50至60kda的单扩散带类似(图12)。实施例2-polyactivehcg微球的产生使用ph7.4的pbs缓冲液+甲硫氨酸将dong-ahcg浓缩至目标浓度20mg/ml。下表1中给出了分析的总结。表1-hcg浓度分析在浓缩步骤期间维持蛋白质的完整性，得到约20mg/ml(21.5mg/ml)蛋白质溶液，这继而使得蛋白质/聚合物比为1.5％至2％。因此，最终药物产物应为在0.2cc中约0.2至0.6mghcg的范围内。在浓缩期间维持蛋白质的完整性(图11)。使用容积式移液管(positivedisplacementpipet)将浓缩的hcg与包含聚合物(polyactivetm聚合物(1g/9g二氯甲烷))的有机溶液引入到主乳液中并随后在室温下将其以19000rpm匀浆30秒。然后将该主乳液与7％pbspva混合5分钟并随后添加pbs+甲硫氨酸持续5小时，随后洗涤5次。用负载有安慰剂(pbs+甲硫氨酸)的微球重复类似的过程。根据该方法产生了多种聚合物的微球，所述聚合物包括以下列出的那些：polyavctivetmpeg1500系列：peg/pbt重量比＝70/30、75/25、80/20、90/10polyactivetmpeg1000系列：peg/pbt重量比＝70/30、67/33polyactivetmpeg2000系列：peg/pbt重量比＝60/40、75/25、80/20使用mastersizer对所得颗粒进行尺寸测量(size)，如表2中所述。表2-微球尺寸分布安慰剂负载hcg显微术确认了用mastersizer获得的结果。除重量比为1500/90/10的微球制剂给出大的卵形微球形状之外，没有观察到显著的形态学差异。基于尺寸分布，选择表3的制剂(通常是在没有进行任何额外处理的情况下尺寸为约50至100μm的那些)用于进一步分析。表3-用于进一步分析的微球实施例3-polyactivehcg微球的释放谱分析根据实施例2的方法制备微球。通过体外释放测定测试表4中列出的一系列制剂。表4-第1轮体外释放将样品和对照与ph7.4的pbs中的0.05％nan3和0.05％吐温20在37℃下一起孵育。确定进行至14天的初步累积释放谱和归一化释放谱(图2至3)。制剂695-01-0008、695-01-0010和695-01-0011全部显示出低突释至没有突释。由表5所示，对照制剂的hcg保持基本上是纯的(图13)，在14天内降低仅约5％。表5-hcg的纯度制剂695-01-0011(“制剂11”)表现出用于延长释放hcg施用的合适释放谱。基于制剂11的实际体外释放谱(图4)，确定不同hcg剂量的制剂11的理论释放谱(图5至9)，假定生物利用度＝0.5；分布体积＝5.5l；吸收半衰期＝8小时；终末消除半衰期＝24小时；用23至25g针可注射的最大微球密度为15％w/v(150mg/ml)；2％药物载量；1cc注射递送3mghcg；以及一次注射：将1ml中的3mghcg配制成“制剂11”polyactive微球。表6示出了制剂11中具有3mghcg的产品的hcg半衰期和给药间隔如何导致血液中最低持续hcg水平(以ng/ml计)。表6-基于制剂11理论释放谱(基于以上假定)估计的血液中hcg水平cmin与cmax之间的比也显示出大的差异t1/2＝24和36小时。血浆水平与施用剂量和消除半衰期成正比。对于每两周一次给药，具有较低释放率(甚至多至4或6周)的制剂可提供较低的cmax/cmin比和更有效的剂量使用并且将降低对较高hcg载量％的需求。因此，考虑了另一轮体外释放，其改变了功能性制剂11的参数。表7中列出了提出的变化。另一些考虑因素包括以1∶4、1∶1、1.5∶1或4∶1的重量比混合polyactivetmpeg150075/25和polyactivetmpeg150070/30来分别模拟polyactivetmpeg150071/29、72.5/27.5、73/27和74/26。表7-制剂11的提出的变化对表8中列出的另外的样品进行第二轮和第三轮体外释放测定。许多制剂-695-01-0021(至少4至6周释放)、695-01-0025、695-01-0031、695-01-0032、695-01-0033(可能是最佳地)和695-01-0034显示出了适合于1周至超过50天的延长释放持续时间的hcg释放谱。(图10、14至16)。表8中提供了对这些制剂的进一步分析。表8-延长释放微球的表征实施例4-由synbiosys[pcl-co-peg-co-pcl]-b-[plla]多嵌段共聚物构成的hcg延长释放微球的产生本实施例描述了由synbiosys[聚(ε-己内酯)-co-聚乙二醇-co-聚(ε-己内酯)]-b-[聚(l-丙交酯)](pcl-co-peg-co-pcl]-b-[plla])多嵌段共聚物制备的hcg延长释放微球的制备和表征。使用ph7.4的pbs缓冲液+甲硫氨酸和具有截留尺寸为10kda的聚醚砜膜的amiconultra-15小瓶将hcg(dong-apharmaceuticalco.，ltd；korea)浓缩至目标浓度30mg/ml。如用rp-uplc测定的，浓缩溶液的hcg浓度为30.7mg/mlhcg。浓缩蛋白质溶液的目视检查显示出没有不溶性颗粒。在浓缩步骤期间维持hcg的完整性。rp-uplc分析(图17，uplc色谱图)确定了不存在聚集体并且没有降解的迹象。将约0.35g浓缩hcg溶液添加至0.50g聚合物在2.92g二氯甲烷(dcm)中的溶液中并随后以22000rpm匀浆40秒以产生油包水(water-in-oil，w/o)主乳液。然后使用连续流动反应器将该主乳液用包含5.0w/v％nacl的4.0％pva水溶液乳化，从而形成水包油包水(water-in-oil-in-water，w/o/w)双乳液。将w/o/w乳液在室温下搅拌3小时，以允许提取和蒸发二氯甲烷。溶剂蒸发完成之后，通过过滤收集hcg微球并冻干以产生干燥的hcg微球。使用上述操作，在不同的制剂和过程参数设置(聚合物混合比、聚合物浓度、cp∶dp比)下由synbiosys50[pcl-co-peg1000-co-pcl]2000-b-[plla]4000和synbiosys30[pcl-co-peg3000-co-pcl]4000-b-[plla]4000的混合物来制备微球。synbiosys50[pcl-co-peg1000-co-pcl]2000-b-[plla]4000(也缩写为50cp10c20-ll40)是由分子量为2000g/mol(包含50摩尔％的分子量为1000g/mol的聚乙二醇)的亲水性[pcl-co-peg1000-co-pcl]预聚物区段(a)和分子量为4000g/mol的半结晶聚(l-丙交酯)预聚物区段(b)构成的多嵌段共聚物，其通过1，4-丁烷二异氰酸酯以50/50wt.％嵌段比扩链。synbiosys30[pcl-co-peg3000-co-pcl]4000-b-[plla]4000(也缩写为30cp30c40-ll40)是由分子量为4000g/mol(包含75摩尔％的分子量为3000g/mol的聚乙二醇)的亲水性[pcl-co-peg3000-co-pcl]预聚物区段(a)和分子量为4000g/mol的半结晶聚(l-丙交酯)预聚物区段(b)构成的多嵌段共聚物，其通过1，4-丁烷二异氰酸酯以30/70wt.％嵌段比扩链。使用库尔特计数器multisizeriii对所得hcg微球的颗粒尺寸分布进行表征。平均颗粒尺寸在21至48μm之间变化(表9)。表9-由50cp10c20-ll40和30cp30c40-ll40的混合物制成的hcg微球的概述。*聚合物比＝聚合物1/聚合物2的事量比；聚合物1＝50cp10c20-ll40；聚合物2＝30cp30c40-ll40如使用jeoljcm-5000neoscope通过扫描电子显微镜评价的，hcg微球的显微镜检查确定了用库尔特计数器的结果。所有hcg微球均具有类似的形态特征，即具有光滑表面的球形状的微粒(图18)。通过在0.1mnaoh中水解聚合物，将水解物与ph7.4的100mm磷酸盐缓冲液混合并随后通过rp-uplc分析hcg浓度，确定了所有微球的hcg含量和包封效率(encapsulationefficiency，ee)。hcg微球批次的hcg含量在1.3％至1.8％之间变化，表示包封效率为75％至95％(表9)。通过将hcg微球在37℃下在ph7.4的pbs缓冲液(包含0.01％吐温-20和0.01％叠氮化钠)中孵育，在预定下取样并用rp-uplc分析hcg浓度来确定体外释放动力学。确定进行至至少4周的累积释放谱(图19)。所有制剂均显示出低突释至没有突释，接着是此后逐渐释放hcg。一些制剂显示出滞后时间，随后是不规则的释放模式(ja16044和ja16045)。ja16043表现出最具前景的释放动力学，因为它没有突释，线性释放持续数周并且回收率＞75％。进一步分析了ja16-043的释放的hcg的完整性。通过rp-uplc确定完整hcg的浓度。如图20中所示，hcg几乎完全以其完整形式从hcg微球释放。实施例5-synbiosys20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo]多嵌段共聚物的合成已知实施例4中使用的[聚(ε-己内酯)-co-聚乙二醇-co-聚(ε-己内酯)]-b-[聚(l-丙交酯)]多嵌段共聚物降解相对慢。已知由基于聚(对二氧环己酮)的结晶嵌段构成的多嵌段共聚物降解更快，这可有益于防止重复皮下施用之后的聚合物载体积聚。该实施例描述了基于peg3000并且嵌段比为20/80wt.％的[聚(ε-己内酯)-co-聚乙二醇-co-聚(ε-己内酯)]-b-[聚(对二氧环己酮)]多嵌段共聚物的合成和表征。使用分子量为3000g/mol的聚乙二醇(peg3000)作为引发剂并且辛酸亚锡(stannousoctanoate)作为催化剂通过ε-己内酯的开环聚合制备了分子量(mn)为约4000g/mol的聚(ε-己内酯)-co-peg3000-co-聚(ε-己内酯)预聚物(缩写为pcl-peg3000-pcl)。使用1，4-丁二醇作为引发剂并且辛酸亚锡作为催化剂通过对二氧环己酮进行开环聚合合成了分子量(mn)为约2500g/mol的聚(对二氧环己酮)预聚物(缩写为pdo)。通过1h-nmr对预聚物的分子量进行分析。通过使用1，4-丁烷二异氰酸酯作为扩链剂将pcl-peg3000-pcl预聚物与pdo预聚物在对二氧六环中扩链，随后通过冷冻干燥或沉淀以去除对二氧六环制备了嵌段比为20/80wt.％的[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo]多嵌段共聚物，缩写为20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo]。对聚合物的聚合物组成(通过1h-nmr)、特性黏度(ubbelohde、氯仿)、残留的对二氧六环含量(气相色谱)以及热特性(通过调制式差示扫描量热法)进行分析。表10列出了多种[聚(ε-己内酯)-co-peg-co-聚(ε-己内酯)]-b-[聚(对二氧环己酮)]多嵌段共聚物的特性。表10-20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo]多嵌段共聚物的特性：聚(对二氧环己酮)嵌段长度、特性黏度和热特性(熔融温度tm和熔融焓δhm)。实施例6-由synbiosys20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo]多嵌段共聚物构成的hcg延长释放微球的产生如实施例4中所述将hcg(dong-apharmaceuticalco.，ltd.korea)浓缩至30mg/ml。将1.5g20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo]多嵌段共聚物(rcp-1557)溶解在二氯甲烷中至浓度为15wt.％。将0.73g浓缩的hcg溶液添加至聚合物溶液并以22000rpm匀浆40秒以产生油包水(w/o)主乳液。然后使用具有20μm孔的膜通过膜乳化，用包含5.0w/v％nacl的4.0％pva水溶液乳化主乳液，从而形成水包油包水(w/o/w)双乳液。将w/o/w乳液在室温下搅拌3小时，以允许提取和蒸发二氯甲烷。溶剂蒸发完成之后，通过过滤收集hcg微球并冻干以产生干燥的hcg微球。使用实施例4中所述方法表征的hcg微粒是球形的，具有光滑的表面形态(图21)并且具有38μm的平均颗粒尺寸和窄的颗粒尺寸分布(cv＝14％至18％)。hcg含量在1.33至1.62wt.％之间变化，表示包封效率为67％至86％(表10)。在11周的时间内所有微粒逐渐释放rhcg并且主要是完整的(图22)而没有任何显著突释。表11-由20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo]制成的hcg微球的概述将批ja16101和ja16102组合为一批用于进一步测试体内药代动力学/药效学。实施例7-hcg延长释放微球在年轻成年食蟹猴(cynomolgusmonkeys)中的初步药代动力学/药效学研究在五只健康的年轻成年雄性食蟹猴中用从ja16101和ja16102(实施例5)收集的hcg延长释放微球进行体内药代动力学/药效学研究。在研究持续时间内，所有猴每三天均用gnrh拮抗剂(西曲瑞克250μg)处理，以抑制垂体功能和内源性睾酮产生。所有猴均用西曲瑞克进行预处理(第5天和第2天)，并评估hcg和睾酮水平二者。在研究持续时间内，两只猴接受每日皮下注射3μghcg(对照组)：一只猴给药ovidrel并且另一只猴给药dong-ahcg。三只猴皮下施用单剂量的hcg延长释放微球(200μg、600μg和1200μgr-hcg)(hcg-msp组)。对于两组，在前24小时内频繁获得血液样品并且此后定期获得血液样品。对所得血清通过elisa方法(lloq＝0.5ng/ml)评估hcg并通过lc/ms/ms方法(lloq＝0.25ng/ml)评估睾酮水平，直至hcg和睾酮水平降至低水平。对照组中的猴最初血清hcg水平升高伴随着血清睾酮水平相应升高(图23)。到第3天，血清水平达到稳定状态。然而，尽管每日持续注射hcg，但是血清hcg和血清睾酮水平二者后来最终下降至几乎为零。使用结合抑制分析来确定针对hcg的抗药抗体(anti-drugantibody，ada)的存在。对在第55天从对照组中的猴收集的样品进行的掺入回收率(spikerecovery)分析确定了血清hcg和血清睾酮水平的下降与ada对hcg的响应相关。将5ng/nl和55ng/nl参考标准物二者掺入经处理的猴血清导致使用elisa测定的hcg回收率的完全抑制，这与当掺入初始猴血清或预剂量时的回收率多于80％+相反。对于用hcg延长释放微球处理的全部三只猴，hcg水平以接近线性和剂量依赖性方式升高。在48小时内的血清hcg水平确定了即使对于最高剂量，突释也几乎为零(图24，a图)。在研究持续时间内的血清hcg水平和血清睾酮水平在图24b图和c图)中绘制。图25示出了接受代表200μg(a图)、600μg(b图)和1200μghcg(c图)的hcg延长释放微球的每只单独的猴在同一张图上的血清hcg和血清睾酮。这些图显示在整个研究中血清hcg与血清睾酮水平之间明显并行。另外，其示出血清hcg以稳定方式释放直至约14天时出现显著降低。在第33天收集的经hcg延长释放微球处理的猴血清的掺入回收率分析确定了血清hcg水平下降是由失活的ada响应引起的，与对照组类似。表12-在将hcg(ovidrel)掺入到猴血清中之后的平均hcg回收率。回收的hcg的抑制指示ada形成总之，这项初步研究表明，hcg延长释放微球的单次皮下注射在食蟹猴中以最小的突释提供剂量依赖性的hcg持续释放，并且从微球释放的hcg保持其生物活性并诱导睾酮响应。然而，由于与重组人蛋白的抗药抗体(ada)形成相关的灵长类模型的限制，因此不能评价完整释放持续时间内的药代动力学。由于已知在重复暴露之后在动物中形成针对hcg的抗药抗体，因此本研究中针对hcg的ada的形成并不令人惊讶。总的来说，这些观察结果表明，hcg水平的下降并不反映制剂的问题，而仅仅是对用于评价人蛋白持续释放的动物模型的限制。预期在人中不出现失活的ada，并且其不可能降低治疗效果。人男性在成年期具有非常低但是可检测的天然存在水平的hcg，并且预期将不会对hcg的施用具有免疫应答。总之，单次皮下注射hcg延长释放微球在食蟹猴中以最小的突释提供剂量依赖性的hcg持续释放。实施例8-由synbiosys多嵌段共聚物20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo]构成的基于ovidrel的hcg微球本实施例描述了使用ovidrel作为替代hgc来源的hcg延长释放微球的制备和表征。使用如实施例5中所述合成的不同批的20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo](rcp-1801、rcp-1803、rc1811和rcp-1814)。如实施例4中所述，将hcg溶液(ovidrel，serono)浓缩至30mg/ml。在浓缩步骤期间维持hcg的完整性。sec-uplc分析确定不存在聚集体和hcg降解。根据实施例5中所述的一般操作同时改变了关键制剂和过程参数，以1.5g的规模制造hcg延长释放微球(表13)。所有hcg微球的颗粒尺寸分布均通过激光衍射表征。颗粒具有窄的颗粒尺寸分布，其中平均颗粒尺寸为38至49μm(表14)。通过sem的显微镜检查显示所有微粒均具有光滑的表面形态。针对完整hcg与降解产物(主要由其亚基组成)之间的最大分辨率对hcguplc方法进行优化。该方法在配备有光电二极管阵列(pda)检测器和荧光检测器的watersacquityh-classuplc系统上进行。通过比较完整蛋白的浓度与所有hcg相关化合物的总浓度来确定hcg完整性。图26中示出了包含完整hcg、α和β亚基、可溶性聚集体和蛋白质片段的典型色谱图的一个实例。表13-用于制备基于ovidrel的hcg延长释放微球的制剂和过程参数设置。表14-ovidrelhcg延长释放微粒的平均颗粒尺寸、hcg含量、包封效率和hcg完整性。批d50(μm)hcg含量(wt.％)ee(％)rhcg完整性(％)sr18-031491.2466100ms18-035420.8844100ms18-036381.738799ms18-037381.8291100ms18-038401.798999ms18-039391.9397100ms18-041411.3869100ms18-042401.5477100ms18-043391.3668100ms18-044401.8191100ms18-048411.2562100ms18-049401.1357100ms18-050391.5979100通过从微粒提取hcg并通过优化的sec-uplc方法分析hcg浓度确定的hcg含量在0.88％(ee44％)至1.93％(ee97％)之间变化(表14)。使用具有更高缓冲容量使得能够更精确鉴定和量化hcg和hcg完整性的优化方法来分析体外释放动力学。将hcg微球在包含1.0ml100mm磷酸盐缓冲液(ph7.4，包含0.025％吐温-20和0.02％叠氮化钠)的小瓶中孵育，并放置在37℃的振荡恒温水浴中。每周两次获取样品，其中限制一周内的取样间隔为两天。在每个取样时间点，将样品离心并移出0.85ml上清液用于分析。将样品用新鲜的ivr培养基洗涤两次，并用新鲜的pbs缓冲液代替移除的体积。用sec-uplc确定体外释放样品中的总hcg和完整hcg含量。仅对在两天取样间隔之后获取的样品建立释放的rhcg的完整性，以确保释放的rhcg(溶液中)的最小降解。与旧方法相比，使用优化的体外释放测定，hcg从hcg延长释放微粒中释放明显更快。图27示出了根据表13制备的基于20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo]的hcg延长释放微球的累积释放动力学。除ms18-035(其使用12.5％的低聚合物浓度制备)之外，所有制剂均显示出类似的hcg的体外释放动力学，其特征在于低的突释，随后在1至4周之间几乎线性释放rhcg，并且总的释放持续时间为约5周。通过sec-uplc测量的释放的rhcg的完整性在85％至99％之间变化(表15)。表15：释放的rhcg的完整性。总的来说，可得出结论，微囊化过程是稳健且可重现的，所产生的hcg延长释放微球具有窄的颗粒尺寸分布，平均hcg含量为约1.62wt.％，可接受的ee＞80％，包封的hcg的良好完整性(＞86％)以及持续时间为约5周的s形体外释放谱。实施例9-包封的hcg和从hcg-msp释放的hcg的生物活性在小鼠ma-10莱迪希细胞生物测定中测量了包封的和释放的hcg的生物活性。从如实施例8中所述制备的基于20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo]的hcg延长释放微球的三个代表性批次(ms18-031、ms18-037和ms18-038)产生受试样品。对延长释放微球进行体外释放测定，在此在2小时、23天和37天之后释放并收集hcg。另外，为了评价包封的rhcg的稳定性，从已冷冻储存5个月的大量延长释放微球提取hcg，并在莱迪希细胞生物测定中对其进行测试。测量来自每个hcg-msp批次的释放的rhcg的生物活性，并使用hcg生物测定将其与ovidrel(重组绒毛膜促性腺激素)的生物活性进行比较，所述hcg测定通过enzo孕酮酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒来测量鼠莱迪希细胞肿瘤系ma-10中hcg诱导的孕酮产生。表16中列出了通过高效液相色谱(sec-uplc)方法测量的每个受试样品的总hcg浓度和完整hcg的百分比。表16：受试样品、总hcg浓度和完整hcg％的列表。表17中总结了由不同hcg样品诱导的孕酮的测量水平。表17：hcg诱导的孕酮水平相对于参考标准计算了hcg受试样品在ma-10细胞中诱导孕酮产生的能力的百分比差异，参见表18和图28(a图和b图)。表18.hcg诱导的孕酮水平占ovidrel诱导的孕酮的百分比。为了进行比较，给出了先前通过hplc-sec确定的9个ivr样品的完整百分比。对于ivr样品，计算每个取样时间时三个批次的平均值(表19，并绘制在图28(c图)中)。表19.相对于ovidrel，由从批次ms18-037、ms18-038、sr18-031在2小时、23天和37天时释放的hcg产生的平均孕酮百分比。数据显示，从微球提取或释放的hcg能够诱导鼠ma-10莱迪希细胞产生孕酮。对于提取的hcg，生物活性与参考标准类似(＞90％)，表明hcg-msp中的ovidrel在冷冻储存5.5个月时维持其效力。此外，提取溶剂不损害hcg完整性，也不干扰hcg生物测定。对于从hcg-msp释放的hcg，孕酮响应在早期、中期和晚期释放时间点上维持。孕酮响应在9个释放样品中有8个高于75％并且在9个样品中有6个高于84％。尽管孕酮响应随时间降低，但这并没有发生在所有hcg微球批上，其中例如，批ms18-037显示出在3个时间点上均无活性变化。总的来说，本研究表明，hcg可包封在微球中并随时间从hcg延长释放微球释放，同时维持药理学重要的其生物活性部分。实施例10-微囊化hcg的2-ab聚糖映射hcg是高度糖基化和唾液酸化的分子。hcg唾液酸化是影响受体相互作用、转导信号传导、药代动力学和体内暴露的cqa。糖部分与hcg分子的接头(特别是与末端唾液酸相关)是潜在不稳定的。为了研究通过水包油包水过程将hcg包封在微球中是否会影响唾液酸化水平或一般糖基化(其进而可影响药代动力学而不必改变蛋白质的体外生物活性)，通过表征2-ab聚糖映射对微囊化hcg的唾液酸化和一般糖基化水平进行分析。如实施例8中所述制备基于20[pcl-peg3000-pcl]-b-[pdo]的hcg-msp(ms18-037)。根据实施例7中所述的操作提取hcg，并通过sec-uplc测定提取的hcg的浓度和完整性(表20)。考虑到与提取缓冲液(即具有0.2％sds:meoh(67:33)的pbs)相关的可能的基体干扰或样品制备所需的真空浓度的潜在作用，包含数个对照层。表20通过2-ab聚糖映射表征的样品*hcg浓度和完整性通过sec-uplc测量监测了69种不同聚糖物质的r-hcg。相对于总面积评价每种物质的丰度，并以相对丰度表示。主要物质总结在图29a图中。通过考虑到所有n-聚糖物质的结构特征对其进行分组来进一步对其进行阐述。获得了触角性(antennarity)、半乳糖基化、岩藻糖基化和唾液酸化分布并在图29b图中给出。在用rhs进行的可行性实验中，观察到主要对岩藻糖基化并且部分对唾液酸化物质的基体效应(如图29，b图中rhs相对于提取缓冲液中的rhs的值所示)，其被认为适用于来自提取的材料的2-ab聚糖映射并是对结果的解释。对于唾液酸化(其已知为hcg活性和效力的关键质量属性)，在从msp提取的hcg“样品”中观察到的水平与“提取缓冲液中的相关对照”相当，表明与各自的对照相比，包封对唾液酸化水平没有影响。与ovidrel(“参照”，作为在不添加提取缓冲液的情况下的基线)相比的差异与可行性实验中观察到的基体效应完全一致，表明没有另外的干扰。总之，与相关对照相比，包封/提取没有改变唾液酸化谱。对于岩藻糖基化，存在与基体效应明显相关的一些差异。如果正交确认的话，则在从msp提取的两个样品之间观察到一定水平的变异性，考虑将其用于提取操作的标准化。所有其他聚糖物质均完全一致。***本文中描述的具体方法和组合物代表一些优选实施方案，并且是示例性的并不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员在考虑本说明书之后将想到其他目的、方面和实施方案，并且所述其他目的、方面和实施方案均涵盖在由权利要求书的范围所限定的本发明的精神内。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可对本文中公开的本发明进行多种替换和修改。本文中举例说明性地描述的本发明可在不存在本文中未将其具体公开为必要要素的任何一个或更多个要素、一个或更多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，在本文中的每种情况下，在本发明的实施方案或实施例中，术语“包含/包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一个可用说明书中的其他两个术语中的任一个替换。此外，术语“包含/括”、“包括/含”、“包含/含有”等应广泛且不受限制地理解。本文中举例说明性地描述的方法和过程可以以不同的步骤顺序适当地实践，并且它们不一定受限于本文中或权利要求中指定的步骤顺序。此外，除非上下文另外明确指出，否则本文中和所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。在任何情况下，均不能将本专利解释为限于本文中具体公开的具体实施例或实施方案或方法。已在本文中对本发明进行了广泛且一般地描述。落入一般公开内容内的每个较窄的物质和亚类分组也构成本发明的一部分。这包括对其中附带条件或否定限制(从该属中去除任何主题)的本发明的一般性描述，而不论所去除的内容是否在本文中进行了具体叙述。另一些实施方案在所附权利要求书之内。另外，在以马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明由此也以马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述。当前第1页12