本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于皮肤护理的的组合物及其在化妆品中的应用。
背景技术：
在化妆品的开发生产中，天然功能性植物成分具有天然来源、可自然降解、市场接受程度高等优势。天然植物成分的生产，一般为采集人工栽培或天然生长的植物组织，然后进行提取。在田地或设施内栽培植物容易受到土壤、气候、病虫害等因素的影响，每个栽培批次间的产品质量存在差异，不利于产品质量的标准化。为降低外界因素影响，提高产率和质量稳定性，已开发出植物细胞的体外培养技术，将植物体上特定部位的细胞分离出来并在人工配制的培养基中生长，通过调控培养基成分等条件使植物细胞大量合成需要的成分，同栽培相比，体外培养技术能更好的保护野生植物资源、提高生产效率。
晚香玉(polianthestuberosal.)的花朵具有浓郁香气，一般作为香料植物提取香精。其花瓣细胞在特定培养基中可产生由甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等单糖组成的胞外多糖，该胞外多糖的分子量中富含亲水性的羟基，使其具有良好的保湿性，可作为皮肤保湿成分用于化妆品中。胞外多糖作为一种高分子物质，使培养液具有较高粘度，细胞碎片等成分不易去除，使胞外多糖提取液的外观较为浑浊，不利于其在化妆品中的应用。在中性ph下，胞外多糖上的酸性基团为解离状态并带有负电荷，多糖分子链间因同种电荷而互相排斥，在水中高度伸展，使培养液表现出较高粘度，细胞碎片等浑浊物质不易去除。开发低成本、高效的培养和处理技术可促进该胞外多糖在化妆品中的应用。
良好的皮肤保湿能力有利于保持皮肤的良好状态，皮肤保湿性一般由角质层脂质屏障、天然保湿因子含量等因素决定。角质细胞内的天然保湿因子由尿素、有机酸盐、氨基酸、糖类等组成，补充氨基酸可通过皮肤中酶的降解来提高天然保湿因子浓度，进而提高皮肤保湿性。氨基酸也是合成各种胞外基质蛋白的原料，具有一定抗衰老作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种晚香玉胞外多糖的体外培养生产方法并在此技术上提供了一种用于皮肤护理的组合物。
本发明采取的技术方案包括：晚香玉细胞合成胞外多糖的体外培养条件的优化、胞外多糖的分离工艺、胞外多糖与碱性氨基酸的组合物。对于晚香玉细胞合成胞外多糖的体外培养，在通常使用的植物细胞培养基，如white培养基(white，1963)，、gnmhorg培养基(gnmhorgetal.，1968)、ls培养基(linsmnlerandskoog，1965)等，基础上进行优化。
胞外多糖作为细胞的次生代谢产物，一般在特定培养条件下才能大量产生，可通过优化培养基组成来达到目标。
首先是糖类的种类和浓度，胞外多糖的合成需要大量单糖作为构件并需要大量能量，能量的来源在非光合条件下也由糖类提供。在ls液体培养基中，对蔗糖、葡萄糖、果糖进行了比较，发现在培养过程中葡萄糖和果糖为还原性糖，易发生褐变，对细胞有一定抑制作用并使培养液色泽变深，提高了后处理难度。蔗糖为非还原性双糖，在培养过程中褐变轻微，因此选择蔗糖为培养基中的糖类。在浓度上，通过试验发现在1％～5％(w/v)范围内胞外多糖产率与蔗糖浓度为正相关，但超过3％之后产率提高幅度有限，综合考虑成本和效率等因素确定蔗糖浓度为3％(w/v)。
其次为植物激素的种类和浓度，对2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyaceticacid，俗称24d)、1-萘乙酸(1-naphthaleneaceticacid)、6-苄氨基喋呤(6-benzylaminopurine)的浓度进行了研究，其浓度区间分别为1*10-4～1*10-6mol/l、1*10-4～1*10-6mol/l、1*10-5～1*10-7mol/l，三种植物激素以1*10-5mol/l、1*10-5mol/l、1*10-6mol/l浓度共同使用时，胞外多糖产率可达到4.0～6.0g/l，不使用植物激素时胞外多糖产率仅为1.4～2.2g/l。胞外多糖的存在使培养液具有较高粘度，细胞碎片等不透明杂质悬浮在较高粘度的培养液中不易去除。根据胞外多糖的单糖组成和性质，在培养技术后调整培养液ph为酸性，使胞外多糖分子中的酸性基团处于不带电荷的非解离状态，由于糖环结构的疏水相互作用使分子链的伸展程度降低，进而降低培养液的粘度，使细胞碎片等浑浊物质容易分离而得到透明外观的培养液。可供使用的酸包括盐酸、柠檬酸、乙酸、苹果酸等。盐酸酸性强且价格低廉，但盐酸属于管制药品，腐蚀性强且操作时酸雾影响环境和人体健康，盐酸中的氯离子对设备有腐蚀性，因此不使用盐酸而改用有机酸。在有机酸中综合考虑成本、气味等因素，最终选用柠檬酸。培养结束后培养液ph为6.0～7.0，使用旋转粘度计测量粘度为900～1200mpa.s，每升培养液加入3～5克柠檬酸后ph下降为2.0～5.0范围内，ph为5.0时培养液粘度为240～380mpa.s，ph为4.0时培养液粘度为70～140mpa.s，ph为3.0时培养液粘度为20～70mpa.s，粘度的降低使培养液更易于进行过滤或离心处理。将培养液ph调整为3.0后加入0.2％(w/v)活性炭、2％(w/v)的硅藻土作为脱色剂和过滤助剂，进行抽滤，可获得近似无色且透明的滤液。
多糖水溶液与多倍体积的醇类，如乙醇等，混合后多糖可呈固体析出，这是从多糖溶液中析出多糖的常用方法。上述方法中所得滤液与1～3倍体积的80％～95％乙醇混合后可得到白色絮状析出的胞外多糖，将其捞出并压榨至无液体流出，为湿润的固体多糖。取样测量固形物含量(干物质含量)，根据湿润的固体多糖重量和固形物含量，计算出胞外多糖的干物质重量。将湿润的固体多糖重新溶解在一定量水中，使水溶液中多糖浓度达到设定值，一般为1～5％范围内。向溶液中投入一定比例的碱性氨基酸，如精氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等，或多种碱性氨基酸的混合物。加入碱性氨基酸可以中和胞外多糖上携带的氢离子，使最终的组合物的ph接近中性，在制作化妆品时更易使用。加入碱性氨基酸还可提高组合物的功能性，更好的发挥皮肤保湿和抗衰老作用。根据胞外多糖的干物质重量确定碱性氨基酸的加入重量，每克胞外多糖干物质需要加入0.05～0.5克碱性氨基酸，经搅拌溶解后得到ph接近中性的溶液，或根据需要将ph调整至特定范围。
具体实施方式
实施例1
市场购买的ms或ls培养基干粉根据使用说明用蒸馏水或去离子水复溶，2，4-二氯苯氧乙酸和1-萘乙酸用少量无水乙醇预溶，6-苄氨基喋呤用少量0.1n的naoh溶液预溶，加入到复溶的液体培养基中使其浓度为1*10-5mol/l、1*10-5mol/l、1*10-6mol/l，加入3％(w/v)的蔗糖搅拌溶解，用naoh调节ph为6.0～7.0范围内。配置好的培养液转入发酵罐内，升温至118℃灭菌15分钟，冷却至25～30℃后接种已培养好的晚香玉花瓣细胞液体培养物，接种量为1％(v/v)，26±1℃恒温培养，无需光照，发酵罐搅拌转速80转/分钟，30l发酵罐通气量10l/分钟，培养15～30天后放罐收集培养液。搅拌下将无水柠檬酸以4g/每升的比例加入到培养液中，使ph约3.0，加入0.2％(w/v)的粉末活性炭、2％(w/v)的100目硅藻土，搅拌至均匀后静置1～2小时，搅拌均匀后倒入抽滤漏斗抽滤。滤液可使用真空蒸发设备进行浓缩，使体积减少为原体积的1/3～1/2，以减少醇析时乙醇用量，也可不浓缩直接进行醇析。将滤液倒入2倍滤液体积的95％乙醇中，搅拌混合，出现白色絮状的多糖析出，用滤布分离析出物后挤干至无液体流出，得到湿润的固体多糖并称重，取样并使用快速水分测定仪在60～90℃内烘干以确定干物质含量，重量乘以干物质含量得到多糖干物质重量。将湿润的固体多糖投入到已预热至70～90℃水中，搅拌溶解，按每克胞外多糖干物质加入0.2克精氨酸，搅拌溶解，使ph为6.0～7.0范围内，补充水使胞外多糖浓度为3.0％(w/v)，稍冷却后加入适量防腐剂，冷却后得到可用于化妆品的组合物。
实施例2
将0.2g精氨酸用0.178g组氨酸代替，其余同实施例1。
实施例3
将0.2g精氨酸用0.168g赖氨酸代替，其余同实施例1。
实施例4
将0.2g精氨酸用0.152g鸟氨酸代替，其余同实施例1。
实施例5
将0.2g精氨酸用0.1g精氨酸和0.089克组氨酸的混合物代替，其余同实施例1。
实施例6
将0.2g精氨酸用0.046g氢氧化钠代替，其余同实施例1。
实施例7
使用abts(总抗氧化能力检测试剂盒法)对实施例1～6制得的组合物测量自由基清除率，具体结果如表1所示：
表1
从自由基清除率数据可知，使用碱性氨基酸制备的组合物在抗氧化性上优于使用碱性的氢氧化钠制备的组合物，碱性氨基酸可增强组合物的功能性，碱性氨基酸的混合物可产生更好抗氧化性。
实施例8
将实施例5中得到的组合物配置为化妆品保湿水，配方如表2所示：
表2
10名平均年龄为37.5±4.4的志愿者，在左上臂内侧涂抹活性配方，在右上臂内侧涂抹空白对照，每次涂抹量为0.1毫升，每日涂抹两次，使用4日后进行皮肤含水量的测定，使用30日后进行皮肤弹性和皮肤细纹的测定。
皮肤含水量测定使用德国courage+khazaka(ck)公司的多功能测量仪corneometercm825仪器测量皮肤含水量，通过比较保湿水使用前后皮肤含水量数值的变化来评估产品的保湿功效，评价标准为前后增加0～5为有改善，5～10为有较明显改善，大于10为明显改善。皮肤弹性测定使用德国courage+khazaka(ck)公司的多功能测量仪corneometercm825仪器测量皮肤弹性，通过比较保湿水使用前后皮肤弹性数值的变化来评估产品的抗衰老功效，评价标准为前后增加0～0.05为有改善，0.05～0.1为有较明显改善，大于0.1为明显改善。皮肤细纹的测定使用德国courage+khazaka(ck)公司的sv600皮肤皱纹测量仪测定皮肤粗糙度参数，通过比较保湿水使用前后皮肤粗糙度参数的变化来评估产品的抗衰老功效，评价标准为前后下降0～5为有改善，5～10为有较明显改善，大于10为明显改善。
志愿者不同部位使用保湿水前后的数据平均值比较见表3。
表3
从数据可见，实施例5制得组合物中含有晚香玉细胞胞外多糖和碱性氨基酸，使用该组合物配制的活性配方在改善皮肤保湿和抗衰老上的效果优于仅含有胞外多糖而不含有碱性氨基酸的空白对照。