白细胞介素5在制备用于预防、治疗或缓解肝损伤的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药领域，具体涉及白细胞介素5在制备用于预防、治疗或缓解肝损伤的药物中的应用。

背景技术：

肝病是一直是我国最严重的公共卫生问题之一，病毒感染、机械损伤、有毒化合物代谢以及自身免疫异常都能导致肝脏疾病。急性肝损伤(acuteliverinjuries，ali)是很多因素引发肝病的常见途径，其机制涉及炎症、氧化应激以及肝实质细胞死亡。肝脏具有强大的损伤修复能力，在消除损伤因素后，肝脏的组织结构以及功能都能恢复，但当损伤持续存在或过于严重的时候，ali可能会发展成慢性肝损伤、肝纤维化甚至肝癌，不仅给患者的身体带来巨大的痛苦，还会产生沉重的经济负担。

但目前对于肝损伤还缺乏有效的治疗方法，因此本领域迫切需要开发新的疗效好的药物，用于减轻肝损伤坏死，促进肝再生。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，针对性的提出了使用白细胞介素5对肝损伤进行治疗，动物实验表明，白细胞介素5对于肝损伤的治疗具有良好的效果。

为了实现如上的目的，本发明第一方面提供白细胞介素5在制备用于预防、治疗或缓解肝损伤的药物中的应用。

本发明第二方面提供白细胞介素5在制备用于促进肝再生的药物中的应用。

本发明第三方面提供白细胞介素5在制备用于预防、治疗或缓解肝细胞凋亡的药物中的应用。

本发明第四方面提供白细胞介素5在制备用于预防、治疗或缓解肝脏坏死的药物中的应用。

本发明第五方面提供白细胞介素5在制备用于降低血清转氨酶水平的药物中的应用。

本发明通过实验证实了：(1)血清中il-5与谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)的相关系均有高度相关性；(2)il-5可以降低肝损伤后血清中转氨酶(alt、ast)水平；(3)il-5可以降低肝损伤后肝脏组织坏死；(4)il-5可以降低急性肝损伤后肝脏中caspase-3的活性从而减少肝细胞凋亡；(5)il-5可以促进肝损伤后肝细胞增殖；由此可证实，白il-5可用于预防、治疗或缓解肝损伤。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为ccl4诱导小鼠急性肝损伤后血清中alt、ast、il-5水平；

图2为注射il-5对ccl4诱导的急性肝损伤小鼠的转氨酶水平的影响；

图3为注射il-5对ccl4诱导的小鼠肝脏坏死水平的影响；

图4为注射il-5对ccl4诱导的小鼠肝细胞凋亡水平的影响；

图5为注射il-5对ccl4模型小鼠肝再生水平的影响。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

il-5是一种主要由th2细胞分泌的细胞因子，此外，上皮细胞等非造血细胞也可产生il-5。多项研究表明il-5调节嗜酸性粒细胞的生长、分化以及活化，并可以在受到刺激后将骨髓中的嗜酸性粒细胞募集到肺组织中，在哮喘等过敏性疾病中发挥重要作用。

本发明的发明人创新性地将il-5应用肝损伤的治疗中，发现il-5可以有效的预防、治疗或缓解肝损伤。

基于如上的发现，第一方面，本发明提供了白细胞介素5在制备用于预防、治疗或缓解肝损伤的药物中的应用。

尽管il-5对于肝损伤均具有一定的疗效，但实验表明，其更适用于急性肝损伤。因此，根据本发明一种优选的实施方式，所述肝损伤为急性肝损伤。

其中，术语“急性肝损伤”是指肝细胞受到病毒感染，药物性的，或者酒精性的，以及其他生物的，物理的，化学因素影响而导致肝细胞的损伤。

根据本发明，所述急性肝损伤可以为常规的各种急性肝损伤，但根据本发明一种优选的实施方式，所述急性肝损伤为化学物质诱导的急性肝损伤。

根据本发明，所述化学物质可以为任意的能够导致肝损伤的化学物质，例如，可以包括但不限于四氯化碳、对乙酰氨基酚(apap)。但本发明的发明人发现，il-5特别适用于四氯化碳诱导的肝损伤。

其中，四氯化碳(carbontetrachloride,ccl4)被细胞色素p450酶代谢形成三氯甲基自由基等中间体，引发脂质过氧化造成肝细胞损伤及坏死。继发的炎症反应所产生的细胞因子和趋化因子募集活化各种免疫细胞调控组织损伤修复，在此过程中tnf-α、il-4、il-6、il-10、igf-2、egf、hgf等多种细胞因子参与其中。

第二方面，本发明提供了白细胞介素5在制备用于促进肝再生的药物中的应用。

第三方面，本发明提供了白细胞介素5在制备用于预防、治疗或缓解肝细胞凋亡的药物中的应用。

根据本发明的研究发现，白细胞介素5可以通过降低肝脏中caspase-3活性来预防、治疗或缓解肝细胞凋亡。

第四方面，本发明提供了白细胞介素5在制备用于预防、治疗或缓解肝脏坏死的药物中的应用。

第五方面，本发明提供了白细胞介素5在制备用于降低血清转氨酶水平的药物中的应用。

其中，所述转氨酶可以为谷丙转氨酶(alt)和/或谷草转氨酶(ast)。

根据本发明，在如上几方面中，所述il-5可以通过商购获得，可以通过自行制备获得。对于制备所述il-5的方法，可以参照本领域公知的技术方案，例如，将il-5的表达基因插入到载体中，获得表达载体，然后再转入宿主细胞进行表达，最后提取纯化获得。

本发明中，对il-5的氨基酸序列并没有特别的限定，可以为现有的各种il-5，根据本发明一种优选的实施方式，所述il-5的氨基酸序列如seqidno：1所示。

seqidno：1

meipmstvvketltqlsahralltsnetmrlpvpthknhqlcigeifqgldilknqtvrggtvemlfqnlslikkyidrqkekcgeerrrtrqfldylqeflgvmstewameg

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，

实验小鼠为7-8周龄balb/c小鼠，雄性，体重18-22g。

重组小鼠il-5(货号:z02995)蛋白购自南京金斯瑞公司；

il-5(ab204523)elisa试剂盒购自abcam；

ast(seb214mu)、alt(sea207mu)elisa试剂盒购自cloud-clone公司；

caspase-3活性检测试剂盒(货号:c1115)购自碧云天公司；

bradford蛋白浓度测定试剂盒(货号:p0006)购自碧云天公司

brdu(5-bromodeoxyuridine)(货号：b9285)购自sigmaaldrich公司；

anti-brdu(货号:ab6326)、anti-ki67(货号:ab16667)购自abcam公司；

多功能酶标仪enspiremultimodeplatereader购自perkinelmer公司；

组织切片扫描仪nanozoomer2.0rs购自hamamatsu公司。

实施例1

本实施例用于说明ccl4诱导的急性肝损伤模型中血清il-5含量与肝损伤程度的相关性

(1)ccl4诱导的肝损伤模型：将ccl4稀释于大豆油中，制备为0.5重量％的ccl4溶液，按10μl/g(ccl4溶液体积/小鼠体重)剂量对小鼠进行腹腔注射，构建小鼠急性肝损伤模型。注射后，分别于0、24、36、48、72h后收集血液和肝脏组织，每个时间点各6只小鼠。

检测不同时间点收集血清的转氨酶的变化。结果显示，造模后24小时转氨酶达到峰值，随后逐渐下降(图1a和图1b)。

(2)不同剂量ccl4诱导的肝损伤模型：将ccl4稀释于大豆油中，制备为0.1重量％、0.3重量％、0.6重量％、0.9重量％浓度ccl4溶液，按10μl/g(ccl4溶液体积/小鼠体重)剂量对小鼠进行腹腔注射按腹腔，24h后收集血液和肝脏组织，每组各6只小鼠。

检测不同剂量ccl4处理后小鼠血清中il-5和转氨酶的水平，具体如下：

在相应时间点对各组小鼠进行摘眼球取血，收集的血清样本于4℃静置2h，1000g离心15min，取上清，分装置于-20℃保存并尽快进行检测，保存时避免反复冻融。随后进行用alt(sea207mu,cloud-clone)、ast(seb214mu,cloud-clone)、il-5(ab204523)，abcam)elisa试剂盒检测血清中alt、ast、il-5含量。

结果显示，随着注射ccl4浓度的增加，小鼠血清转氨酶水平不断升高(图1c和图1d)，表明小鼠肝脏损伤程度不断加重，血清中il-5水平也随ccl4浓度增加而增加(图1e)。

进一步的，对血清中转氨酶含量与il-5水平做线性回归分析。结果显示，血清中il-5与alt或ast的相关系数(coefficientofdetermination,r)分别为0.8737、0.9230，均有高度相关性(图1f和图1g)。

实施例2

本实施例用于说明注射il-5对ccl4诱导急性肝损伤后血清中转氨酶(alt、ast)水平的影响。

il-5治疗模型：将30只小鼠随机分为两组，实验组腹腔注射il-5(z02995，genscript)，il-5溶于pbs中，注射量/小鼠体重为100μg/kg；对照组注射等体积的pbs。24h后腹腔注射0.5重量％ccl4，注射方案同实施例1，并分别于0、24、36、48、72h后收集血液和肝脏组织，每个时间点实验组和对照组各6只小鼠。

对血清中的alt和ast的水平，结果如图2所示，在造模后24h，与对照组相比，注射il-5可显著降低转氨酶水平，其中alt减少了63.2％、ast减少了约59.6％(图2a和图2b)。

实施例3

本实施例用于说明注射il-5对降低ccl4诱导急性肝损伤后肝脏组织坏死的影响。

为了研究il-5对于ccl4诱导的急性肝损伤模型中的肝脏坏死的作用。对实施例2收集的肝脏组织进行h&e染色，每只小鼠的组织切片随机选取3个视野，坏死面积由ilastik软件识别统计并分析。

结果发现，在造模后36h，与对照组(pbs注射组)相比，注射il-5可使肝脏坏死面积减少约45.8％(图3a和图3b)。

实施例4

本实施例用于说明注射il-5对ccl4诱导的急性肝损伤后肝细胞凋亡的影响

在ccl4诱导的急性肝损伤模型中，线粒体途径激活caspase-3，引发肝细胞的凋亡。为了研究il-5能否抑制ccl4诱导的肝细胞凋亡，按照实施例2的方法，在ccl4造模前24h向小鼠腹腔注射il-5蛋白，并于造模后24、36、48、72h检测肝脏中caspase-3活性，来分析肝脏中细胞的凋亡程度，具体如下：

取30mg肝脏组织加入300μl裂解液，在冰上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中，冰浴再裂解5分钟。4℃,20000g离心15分钟,取上清转移到预冷的离心管中。按照caspase-3活性检测试剂盒(c1115，beyotime)和bradford蛋白浓度测定试剂盒(p0006，beyotime)说明书，立即检测caspase-3的活性以及总蛋白浓度。最后，将caspase-3的活性除以总蛋白浓度计算caspase-3相对活性。

结果显示，造模后，肝脏中caspase-3的活性显著升高，在造模后48h达到峰值。在造模后48h，相比于对照组(pbs注射组)，il-5注射组肝脏中caspase-3的活性下降了64.3％，与正常肝脏(造模0h)相比无明显区别(图4)。

实施例5

本实施例用于说明注射il-5对提高ccl4诱导的急性肝损伤后肝细胞增殖的影响

(1)按照实施例2的方法对小鼠进行造模，然后通过免疫组化实验检测il-5对ccl4模型小鼠肝脏ki67的表达。每只小鼠的组织切片随机选取3个视野，阳性细胞数目、总细胞数由ilastik软件统计并分析阳性细胞比例。

结果显示，在ccl4造模后24、36、48h，对照组小鼠肝脏ki67阳性细胞比例分别为：11.03％、15.25％、17.67％；il-5组小鼠肝脏ki67阳性细胞比例分别为：16.83％、33.26％、31.96％，与对照组相比，il-5组小鼠在ccl4造模后24、36、48h的ki67阳性细胞比例均显著增加(图5a和图5b)。

(2)采用brdu掺入实验检测小鼠损伤后肝脏的dna合成。将brdu(b9285，sigmaaldrich)按10mg/ml浓度溶于生理盐水，在小鼠执行安乐死之前1.5h按50mg/kg(注射量/小鼠体重)腹腔注射至小鼠体内。对ccl4造模后不同时间点的小鼠肝脏组织进行brdu染色，每只小鼠的组织切片随机选取3个视野，阳性细胞数目、总细胞数由ilastik软件统计并分析阳性细胞比例。。

结果显示，在ccl4造模后24、36、48h，对照组小鼠肝脏brdu阳性细胞比例分别为：11.13％、15.51％、22.35％；il-5组小鼠肝脏brdu阳性细胞比例分别为：21.26％、37.19％、42.93％，与对照组相比，il-5组小鼠在ccl4造模后24、36、48h的brdu阳性细胞比例均显著增加(图5c和图5d)。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

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<110>天津大学

中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

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