一种体外培育牛黄及其制备方法与流程

本发明属于体外培育牛黄技术领域，具体涉及利用现代分离技术方法获得结合胆汁酸并用于生产体外培育牛黄的工艺方法及由此方法获得的体外培育牛黄。

背景技术：

牛黄即牛胆结石，胆汁酸是其多种有效成分中的一类，胆汁酸分为结合胆汁酸和游离胆汁酸，其中结合胆汁酸如牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨去氧胆酸有抗菌、消炎等药理作用，其含量高低是区别优质或劣质牛黄的重要指标之一。

天然牛黄是自然形成的产物，质量难免存在差异，其结合胆汁酸的含量也有较大的差异，优质的天然牛黄总结合胆汁酸含量大多在3～7％，如优质的澳洲牛黄(结合胆汁酸含量见表1)。但优质牛黄来源有限，且价格昂贵。

表1：优质澳洲牛黄主要结合胆汁酸含量统计表

现有的体外培育牛黄生产工艺是以牛胆汁为原料，经过细菌发酵后，加入一定量的氢氧化钙、胆红素、胆酸等物质，根据天然牛黄形成机制，运用生物化学、物理化学、流体力学等技术手段，在模拟胆囊内进行培育，通过工业化设备生产而成。现有技术生产的体外培育牛黄，其质量指标与优质天然牛黄相近，其安全性和有效性经过了国家有关部门的认可，2004年国家药品监督管理部门下发文件，同意体外培育牛黄可以等同替代天然牛黄(国食药监注[2004]21号)，缓解了天然牛黄资源紧缺的局面，保障了一些传统名方名药的生产，是中医药传承与创新的典范。然而，一方面，由于牛胆汁来源的不同，牛胆汁中的结合胆汁酸含量有较大差异，能够满足体外培育牛黄工艺要求的牛胆汁有限，牛胆汁资源不能得到充分利用。另一方面，要使成品的差异控制在合理范围内，导致工业化生产过程的控制环节较多，控制流程比较繁琐。随着体外培育牛黄应用范围不断扩展，市场需求日益增长，需要一种新方法，能够更充分的利用不同来源牛胆汁中的结合胆汁酸，并应用到体外培育牛黄的工业化生产中，使生产控制过程更为优化，产品的批次间差异更小。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种体外培育牛黄的新方法，从牛胆汁中提取高纯度的结合胆汁酸，并对原有体外培育牛黄的生产工艺进行技术提升，在培育环节加入高纯度的结合胆汁酸和助悬剂，使得最终成品总结合胆汁酸含量在4％以上，含量稳定，与优质天然牛黄基本一致，是优质天然牛黄的理想代用品。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种体外培育牛黄的方法，包含以下步骤：

1)结合胆汁酸的制备：所述结合胆汁酸为牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨去氧胆酸；以牛胆汁为原料进行以下处理：

①黏多糖的去除：每升牛胆汁中加入100ml0.02％的ctab溶液，搅拌5min，静置30min，过滤去除沉淀，得滤液；

②蛋白质的去除：用氢氧化钠将步骤①的滤液ph调至10～10.5，向每升滤液中加入适量的0.02％的硫酸锌或氯化锌溶液，适量的0.01％的氯化钙或硝酸钙溶液形成金属盐类复合物，过滤去除沉淀，得滤液；

③结合胆汁酸混合物的获取：用浓盐酸将步骤②中滤液ph调至1～2，搅拌2min，静置20min，离心收集沉淀物；

④结合胆汁酸的分离：将步骤③收集的沉淀物与100～200目硅胶以(5～6):(3～4)比例直接拌样，干燥上样；硅胶层析柱内径22cm，装柱100～200目硅胶量5kg，高度35cm；单次上样量500～600g，拌样硅胶量300～400g，高度5～6cm，以乙酸乙酯/甲醇/甲酸为洗脱液进行洗脱，洗脱速度5～8ml/s，具体洗脱方式：先后经过乙酸乙酯/甲醇/甲酸体积比＝(50～90):(0.7～1.3):(0.7～1.3)洗脱45～65l得甘氨去氧胆酸，(70～130):(1.4～2.6):(0.7～1.3)洗脱30～50l得甘氨胆酸，随后(55～105):(14～26):(0.7～1.3)洗脱14～26l得牛磺去氧胆酸，最后经过(52～98):(18～32):(0.7～1.3)洗脱28～52l得牛磺胆酸；

2)复合胆红素钙的制备：取250l牛胆汁，加入牛磺酸，蒸汽灭菌，加入2.5l大肠杆菌、肠球菌、变形杆菌的单一菌液或者其组合菌液，进行发酵，控制发酵温度36～39℃，罐内压力0.45～0.5bar，ph值6～8，搅拌机转速50～60r/min，发酵80～90h，得发酵牛胆汁240～253l，加饱和氢氧化钙溶液，搅拌15～30min、煮沸15～20min、冷却，过滤得沉淀物11～14kg，向沉淀物中加入胆红素、胆酸、去氧胆酸、硫酸锌和硫酸镁并置于高速分散机中，加100～200l纯化水搅拌1～2h，冷冻真空干燥并粉碎，得复合胆红素钙粉末25～35kg；

3)培育与成形：按照每100kg复合胆红素钙中加50～100l步骤2)中的发酵牛胆汁，100～150l纯化水，添加步骤1)获得的结合胆汁酸，助悬剂羟丙甲基纤维素，搅拌15～30min，均匀分散，静置30～60min，加酸调节ph至5.5～6.8，偏轴定向旋转培育形成类球形物，干燥得成品。

优选地，上述步骤1)②中，每升滤液中加入0.02％硫酸锌或氯化锌溶液以及0.1％氯化钙或硝酸钙溶液的体积均为15～25ml。

优选地，上述步骤1)④中，将步骤③收集的沉淀物与100-200目硅胶以5:4的比例直接拌样，干燥上样；硅胶层析柱内径22cm，装柱硅胶量5kg，装柱100-200目硅胶高度35cm。

优选地，上述步骤1)④中，单次上样量500g，拌样硅胶量400g，拌样硅胶高度5cm，具体洗脱方式：先后经过乙酸乙酯/甲醇/甲酸体积比＝70/1/1洗脱50l得甘氨去氧胆酸，100/2/1洗脱40l得甘氨胆酸，随后80/20/1洗脱20l得牛磺去氧胆酸，最后经过75/25/1洗脱40l得牛磺胆酸。

优选地，上述步骤2)中，向250l牛胆汁中加入7.5～15kg牛磺酸，向240-253l发酵牛胆汁中加入240～1000l饱和氢氧化钙溶液，向过滤得的11-14kg沉淀物中加入10～15kg胆红素，1.5～3kg胆酸，0.8～1.5kg去氧胆酸，0.12～0.2kg硫酸锌，0.12～0.2kg硫酸镁。

优选地，上述步骤3)中，向每100kg复合胆红素钙中加入上述步骤1)获得的结合胆汁酸的质量如下：牛磺胆酸2～3kg，甘氨胆酸2～3kg，牛磺去氧胆酸0.7～0.9kg，甘氨去氧胆酸0.7～0.9kg，所加入的羟丙甲基纤维素0.2～0.3kg。

第二方面，提供利用上述方法制备的体外培育牛黄。

牛胆汁除水分外，含有胆汁酸、胆色素、黏多糖类、蛋白质类以及无机盐等物质。本发明利用ctab能与黏多糖类物质形成沉淀而去除黏多糖类物质，利用zn²⁺和ca²⁺等金属离子在碱性条件下能与大多数蛋白质反应形成沉淀而去除大部分蛋白质类物质。大部分结合胆汁酸主要以钠盐的形式存在牛胆汁中，在ph为酸性的情况下，转化为结合胆汁酸，因不溶于水而沉淀，收集得到粗胆汁酸类物质。通过层析分离的方法，得到不同种类的结合胆汁酸。按以上步骤1l牛胆汁可提取牛磺胆酸14.2～16.3g，甘氨胆酸10.2～13.3g，牛磺去氧胆酸3.5～4.9g，甘氨去氧胆酸2.8～3.9g，平均提取率依次为：78.9％、74.7％、72.1％、69.5％，纯度范围依次为：99.1～99.3％、99.2～99.6％、98.0～98.3％、98.1～98.7％，符合体外培育牛黄的工业化生产要求。

本发明根据更大规模的工业化生产要求和产品质量控制原则对原有体外培育牛黄工艺进行技术提升，以牛胆汁作为原料，利用现代化分离技术从牛胆汁中提取结合胆汁酸，获取高纯度牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨去氧胆酸。在体外培育牛黄的生产过程中加入高纯度结合胆汁酸。为了提高各种胆汁酸在每个产品个体中的均匀度，在培育环节加入适量的助悬剂羟丙甲基纤维素，从而提高各种胆汁酸在反应体系中分布的均匀度，最终制成的成品中结合胆汁酸总含量达到4％以上，其中牛磺胆酸1.8～2.0％,甘氨胆酸1.5～1.7％，牛磺去氧胆酸0.5～0.6％，甘氨去氧胆酸0.4～0.6％，质量稳定，与优质天然牛黄基本一致。

具体实施方式

通过以下详细说明可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

利用液相梯度洗脱方法并结合蒸发光检测器检测制备获得的结合胆汁酸纯度。具体检测方法如下：采用xaquac18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相a，0.2％三氟乙酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱，1～30min：a(％)25→52，b(％)75→48；30～40min：a(％)52，b(％)48；40～44min：a(％)52→98，b(％)48→2；44～57min：a(％)98，b(％)2，流动相流速1.0ml/min，用蒸发光散射检测器检测，雾化温度35℃，漂移管温度80℃，气体流速1.8l/min，供试品和对照品均采用甲醇溶解并超声处理。

【实施例1】按照本发明体外培育牛黄新工艺进行实施

以10l牛胆汁为原料，加入1l0.02％ctab溶液，搅拌5min，静置30min，过滤去除沉淀，得滤液10.95l，用氢氧化钠将滤液ph调至10.3，加250ml0.02％硫酸锌溶液和250ml0.01％氯化钙溶液形成金属盐类复合物，过滤得滤液，用浓盐酸调ph至1.5，搅拌2min、静置20min，离心收集沉淀物500g，取500g沉淀物与400g硅胶(100目)直接拌样，干燥，得拌样硅胶，高度5cm，硅胶层析柱内径22cm，装柱硅胶(100目)量5kg，高度35cm。以乙酸乙酯/甲醇/甲酸为洗脱液进行洗脱，洗脱速度5～8ml/s，上柱层析。经过乙酸乙酯/甲醇/甲酸＝70:1:1洗脱50l得甘氨去氧胆酸，100:2:1洗脱40l得甘氨胆酸，随后80:20:1洗脱20l得牛磺去氧胆酸，最后经过75:25:1洗脱40l得牛磺胆酸。统计结果如表2。

表2实施实例1中制备结合胆汁酸结果

注：提取率＝b/a*100％

将250l牛胆汁置于发酵罐内，加7.5kg牛磺酸，蒸汽灭菌后，加2.5l含有大肠杆菌的种子液，控制发酵温度36～38℃，罐内压力0.45～0.5bar，ph值6～8，搅拌机转速50r/min，发酵82h，得发酵液250l，加300l饱和氢氧化钙溶液，搅拌20min、煮沸15min、冷却，过滤得沉淀物(干重)12.8kg，向沉淀物中加10kg胆红素，1.5kg胆酸，1kg去氧胆酸，0.15kg硫酸锌和0.15kg硫酸镁置于分散机中，并加100l纯化水，搅拌1.5h，真空冷冻干燥并粉碎，得复合胆红素钙粉末25.3kg。取2kg复合胆红素钙，加入2l上述发酵牛胆汁，2l纯化水以及55g牛磺胆酸，52g甘氨胆酸，14g牛磺去氧胆酸，14g甘氨去氧胆酸，4g羟丙甲基纤维素，搅拌15min，静置30min，用盐酸调ph至6.4，偏轴定向旋转培育得到大小均一的类球形物，干燥得成品。经检测，不仅符合2015版中国药典一部第70页牛黄的质量标准，还利用液相梯度洗脱方法并结合蒸发光检测器检测，牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨去氧胆酸含量分别为：1.95％、1.65％、0.54％，0.50％，结合胆汁酸总含量为4.64％，与优质天然牛黄基本一致。

【实施例2】按照本发明体外培育牛黄新工艺进行实施

以12l牛胆汁为原料，加入1.2l0.02％ctab溶液，搅拌5min，静置30min，过滤去除沉淀，得滤液13.15l，用氢氧化钠将滤液ph调至10.3，加入260ml0.02％硫酸锌溶液和260ml0.01％氯化钙溶液形成金属盐类复合物，过滤得滤液，用浓盐酸调ph至1，搅拌2min、静置20min，离心收集沉淀物570g，取570g沉淀物与400g硅胶(200目)直接拌样，干燥，得拌样硅胶，高度5.8cm，硅胶层析柱内径22cm，装柱硅胶(200目)量5kg，高度35cm。以乙酸乙酯/甲醇/甲酸为洗脱液进行洗脱，洗脱速度5～8ml/s，上柱层析。经过乙酸乙酯/甲醇/甲酸＝70:1:1洗脱50l得甘氨去氧胆酸，100:2:1洗脱40l得甘氨胆酸，随后80:20:1洗脱20l得牛磺去氧胆酸，最后经过75:25:1洗脱40l得牛磺胆酸。统计结果如表3。

表3实施实例2中制备结合胆汁酸结果

将250l牛胆汁置于发酵罐内，加10kg牛磺酸，蒸汽灭菌后，加2.5l含有大肠杆菌的种子液，控制发酵温度36～38℃，罐内压力0.45～0.5bar，ph值6～8，搅拌机转速50r/min，发酵88h，得发酵液252l，加400l饱和氢氧化钙溶液，搅拌30min、煮沸20min、冷却，过滤得沉淀物(干重)13.2kg，向沉淀物中加入13kg胆红素，2.5kg胆酸，1.2kg去氧胆酸，0.18kg硫酸锌和0.18kg硫酸镁置于分散机中，并加180l纯化水，搅拌2h，干燥并粉碎，得复合胆红素钙粉末28.5kg。取2kg复合胆红素钙，加1.5l上述发酵牛胆汁，2.5l纯化水以及45g牛磺胆酸，45g甘氨胆酸，18g牛磺去氧胆酸，18g甘氨去氧胆酸，6g羟丙甲基纤维素，搅拌30min，静置60min，用盐酸调ph至6.0，偏轴定向旋转培育得到大小均一的类球形物，干燥得成品。经检测，不仅符合2015版中国药典一部第70页牛黄的质量标准，还利用液相梯度洗脱方法并结合蒸发光检测器检测，牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨去氧胆酸含量分别为：1.81％、1.52％、0.55％，0.52％，结合胆汁酸总含量为4.40％，与优质天然牛黄基本一致。

上述实施例1、2中菌体的培养为现有技术。发酵过程用于维持发酵液ph值的溶剂可以为盐酸或氢氧化钠。