具有中和狂犬病病毒效能的冲洗液及其活性检测方法与流程

本发明涉及一种冲洗液，具体为一种具有中和狂犬病病毒效能的冲洗液及其活性检测方法，属于狂犬病预防和治疗措施技术领域。

背景技术：

狂犬病是迄今为止人类死亡率最高的急性传染病之一，其病原是狂犬病毒(rabiesvirus)，人和所有温血动物对该病毒均易感。据我国疾病预防控制中心统计，2014年我国共发生狂犬病例969例，死亡病例873例。狂犬病的致死率接近100％，虽然人源抗狂犬病毒抗体药近年来有了很大的发展，但是目前仍然没有开发出非常有效的治疗性药物，因此，狂犬疫苗仍然是目前防治狂犬病的最有效的手段。狂犬病毒基因组为不分节段的单股负链rna，全长约12kb，分别编码酶蛋白(l)、糖蛋白(g)、基质蛋白(m)、磷酸化蛋白(p)、核蛋白(n)五个主要结构蛋白。其中，g蛋白和n蛋白含有多个抗原位点，能够诱导产生抗狂犬病毒抗体。

世界卫生组织(who)推荐的狂犬病暴露后预防措施，对狂犬病暴露后的预防主要采取三种主要措施，即(1)伤口有效冲洗；(2)及时接种人用狂犬病疫苗和(3)注射抗狂犬病毒免疫球蛋白。三种措施的最终目的是及时有效地将咬伤部位中的狂犬病病毒清理干净，在其进入神经组织之前消灭它。三个环节缺一不可。目前人用狂犬病疫苗和抗狂犬病病毒免疫球蛋白已有成熟的商业化产品。但对于伤口的有效冲洗环节，一般来说是采用流水冲洗，为提高冲洗效果，有的医院门诊采取加压的冲洗水枪，并适当加肥皂液进行，最终目的是尽可能把病毒冲洗掉。伤口冲洗这一步骤非常关键，为更有效清除伤口中的狂犬病病毒，急需要一种更有效的伤口冲洗液。

技术实现要素：

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种具有中和狂犬病病毒效能的冲洗液及其活性检测方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种具有中和狂犬病病毒效能的冲洗液，所述冲洗液包括：0.9％生理盐水、吐温-20、效价不低于100iu/ml的人源抗狂犬病单克隆抗体、edtana2和壳聚糖。

一种具有中和狂犬病病毒效能的冲洗液的制备方法，所述制备方法为：取0.9％生理盐水500ml，添加10ml吐温-20，最终效价不低于0.5iu/ml的的人源抗狂犬病抗体，添加edtana2和壳聚糖之后补充0.9％生理盐水，最终至1000ml，过滤除菌后于2-8℃备用。

一种具有中和狂犬病病毒效能的冲洗液的活性检测方法，包括以下步骤：

步骤一、冲洗液的配制，准备实验材料，根据配方配制冲洗液；

步骤二、冲洗液抗病毒活性检测，参考《中国药典》2015年版三部中检测狂犬病抗体活性的“快速荧光灶抑制试验(rffit)”方法进行细胞水平的活性检测，并以spf级昆明小鼠为试验对象，试验动物水平的使用效果；

步骤三、冲洗液使用场所的确定，由于本品所含成分均为医药级原料，不含任何防腐剂和刺激性成分，安全无毒，具有较高的稳定性，可在狂犬病处置门诊直接替代常规的流水伤口冲洗，也可以配制成浓缩液，与处置门诊中的冲洗装置配合稀释用。

作为本发明进一步的方案：所述步骤一中，所需的实验材料包括0.9％生理盐水、吐温-20、高效价人源抗狂犬病抗体(效价不低于100iu/ml)、edtana2以及壳聚糖。

作为本发明进一步的方案：所述步骤一中，冲洗液的制备配方为：取0.9％生理盐水500ml，添加10ml吐温-20，适量人源抗狂犬病抗体(最终效价不低于0.5iu/ml)，微量edtana2和壳聚糖之后补充0.9％生理盐水，最终至1000ml，过滤除菌后于2-8℃备用。

作为本发明进一步的方案：所述步骤二中，进行细胞水平的活性检测包括以下步骤：

(1)取样：取细胞培养用无菌96微孔板，每孔加100μl含10％胎牛血清的dmem培养基；

(2)样本稀释：首先将标准品和新型冲洗液进行3倍系列稀释，其中标准品稀释至9倍，冲洗液稀释至3倍；

(3)加样：取9倍稀释的标准品50μl加到2.1.1步骤中的96微孔板，即第1孔为27倍稀释；取3倍稀释新型冲洗液50μl上板，即第1孔为9倍稀释；

(4)二次稀释：用排枪从第1列每孔取50μl加到第二列中，混匀后继续取50μl到第3列，如此3倍系列稀释直到第12列；

(5)加毒：取固定滴度的狂犬病病毒cvs株50μl到上述微孔中，置37℃恒温培养箱中和1hr；

(6)静置培养：中和完毕后每孔加入50μlbsr细胞，置37℃恒温培养箱培养24hr；

(7)结果检测：培养完毕后弃培养上清，加入80％冷丙酮固定20分钟后，加入50μlfitc标记的抗核蛋白单抗温育1hr，之后弃上清，pbs溶液洗板1次后置倒置荧光显微镜下观察每孔的荧光感染情况。

作为本发明进一步的方案：所述步骤二中，进行试验动物水平的使用效果测试时，模拟咬伤三级暴露情况，采用不同组合进行干预，每组重复三次。

本发明的有益效果是：该具有中和狂犬病病毒效能的冲洗液的制备方法设计合理，可起到清洗伤口作用，又可对伤口中的病毒进行中和，具有一定的治疗作用。

附图说明

图1为本发明结构制备流程示意图；

图2为本发明细胞水平的活性检测流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种具有中和狂犬病病毒效能的冲洗液，所述冲洗液包括：0.9％生理盐水、吐温-20、效价不低于100iu/ml的人源抗狂犬病抗体、edtana2和壳聚糖。

一种具有中和狂犬病病毒效能的冲洗液的制备方法，所述制备方法为：取0.9％生理盐水500ml，添加10ml吐温-20，最终效价不低于0.5iu/ml的人源抗狂犬病抗体，添加edtana2和壳聚糖之后补充0.9％生理盐水，最终至1000ml，过滤除菌后于2-8℃备用。

如图1和图2所示，一种具有中和狂犬病病毒效能的冲洗液的活性检测方法，包括以下步骤：

步骤一、冲洗液的配制，准备实验材料，根据配方配制冲洗液；

步骤二、冲洗液抗病毒活性检测，参考《中国药典》2015年版三部中检测狂犬病抗体活性的“快速荧光灶抑制试验(rffit)”方法进行细胞水平的活性检测，并以spf级昆明小鼠为试验对象，试验动物水平的使用效果；

步骤三、冲洗液使用场所的确定，由于本品所含成分均为医药级原料，不含任何防腐剂和刺激性成分，安全无毒，具有较高的稳定性，可在狂犬病处置门诊直接替代常规的流水伤口冲洗，也可以配制成浓缩液，与处置门诊中的冲洗装置配合稀释用。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤一中，所需的实验材料包括0.9％生理盐水、吐温-20、高效价重组人源抗狂犬病单克隆抗体(1000iu/ml)、edtana2以及壳聚糖。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤一中，冲洗液的制备配方为：取0.9％生理盐水500ml，添加10ml吐温-20，适量人源抗狂犬病单克隆抗体(最终浓度不低于0.5iu/ml)，微量edtana2和壳聚糖之后补充0.9％生理盐水，最终至1000ml，过滤除菌后于2-8℃备用。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤二中，进行细胞水平的活性检测包括以下步骤：

(1)取样：取细胞培养用无菌96微孔板，每孔加100μl含10％胎牛血清的dmem培养基；

(2)样本稀释：首先将标准品和新型冲洗液进行3倍系列稀释，其中标准品稀释至9倍，冲洗液稀释至3倍；

(3)加样：取9倍稀释的标准品50μl加到2.1.1步骤中的96微孔板，即第1孔为27倍稀释；取3倍稀释新型冲洗液50μl上板，即第1孔为9倍稀释；

(4)二次稀释：用排枪从第1列每孔取50μl加到第二列中，混匀后继续取50μl到第3列，如此3倍系列稀释直到第12列；

(5)加毒：取固定滴度的狂犬病病毒cvs株50μl到上述微孔中，置37℃恒温培养箱中和1hr；

(6)静置培养：中和完毕后每孔加入50μlbsr细胞，置37℃恒温培养箱培养24hr；

(7)结果检测：培养完毕后弃培养上清，加入80％冷丙酮固定20分钟后，加入50μlfitc标记的抗核蛋白单抗温育1hr，之后弃上清，pbs溶液洗板1次后置倒置荧光显微镜下观察每孔的荧光感染情况。

结果显示生理盐水组每孔病毒荧光均为90％以上感染，即没有中和活性，标准品和新型冲洗液前1-2孔均无病毒荧光，说明病毒已被中和掉，且随着稀释比例的增大，荧光逐步增强，病毒的中和活性逐步降低，详见图1所示。体外细胞学水平试验结果显示该冲洗液对狂犬病病毒有明显抑制作用，采用reed-much法计算得有效抗体效价可达1.8iu/ml，根据who技术文件，认为中和抗体效价在0.5iu/ml以上即可产生对狂犬病病毒的有效保护

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤二中，进行试验动物水平的使用效果测试时，模拟咬伤三级暴露情况，采用不同组合进行干预，每组重复三次，实验结果显示流水冲洗仅有3.3％保护率，普通流水冲洗加疫苗组有36.7％的保护率。而新型冲洗液可达到76.7％的保护率，远超过普通流水冲洗加疫苗组，由此可见新型冲洗液不仅具有流水冲洗作用，还具有较好的中和狂犬病病毒作用。冲洗效果明显优于普通冲洗液。

如下表所示为冲洗液实验动物结果：

本品所含成分均为医药级原料，不含任何防腐剂和刺激性成分，安全无毒，本品具有较高的稳定性，建议低温阴凉保存。该冲洗液可在狂犬病处置门诊直接替代常规的流水伤口冲洗，也可以配制成浓缩液，与处置门诊中的冲洗装置配合稀释用。

综上，通过细胞水平和试验动物水平的实验结果表明，该新型冲洗液具有一定的狂犬病病毒中和活性，在试验小鼠水平模拟三级暴露后的处置仅用冲洗液的情况下保护率即可达到70％以上，效果远大的传统的流水冲洗效果。该冲洗液可在狂犬病处置门诊直接替代常规的流水伤口冲洗，也可以配制成浓缩液，与处置门诊中的冲洗装置配合稀释用。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。