具有糖苷酶抑制活性的酰基他定类化合物的应用

1.本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及具有糖苷酶抑制活性的酰基他定类化合物及制备方法，以及该类糖苷酶抑制剂在防治糖尿病等疾病方面的应用。


背景技术：

2.糖尿病是由胰岛素分泌不足或人体无法有效利用胰岛素，导致高血糖的一种代谢性疾病，主要分为i型糖尿病，ii型糖尿病和妊娠期糖尿病，尤其以ii型糖尿病最为常见。糖尿病患者过高的血糖浓度，会增加心血管疾病的患病率，诱发慢性肾脏疾病，损伤神经或血管，引起眼部疾病或口腔健康问题等，极大地降低病人的生活质量。近年来，由于不健康的饮食和久坐不动的生活方式，糖尿病的患病率快速上升。根据国际糖尿病联盟(idf)统计，2019年全世界共有4.63亿糖尿病患者，其中1.164亿患者来自于中国，成为糖尿病第一大国。随着糖尿病患者的发病年龄日趋年轻化，危及生命的并发症愈发频繁，糖尿病已成为一个不可忽视的公共卫生问题。因此，加大力度进行糖尿病的基础研究具有战略意义。
3.目前，ii型糖尿病的临床治疗药物的主要类别包括：
①
胰岛素及其类似物(赖脯胰岛素)；
②
双胍类糖尿病药物(二甲双胍、或苯乙双胍)；
③
磺酰脲类糖尿病药物(格列本脲、格列吡嗪、格列齐持、格列波脲、格列美脲、或格列喹酮)；
④
α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物(阿卡波糖、伏格利波糖或米格列醇)；
⑤
胰岛素增敏剂(环格列酮、曲格列酮、罗格列酮、或吡格列酮)；
⑥
醛糖还原酶抑制剂类药物(阿司他丁、依帕司他、波拉司他、或托瑞司他)；
⑦
促胰岛素释放类药物(瑞格列奈或那格列奈)。
4.尽管已经开发了多种类的糖尿病治疗药物，但是，也有较多的负面因素制约着一些药物的应用。例如，研究发现胰高血糖素受体拮抗剂由于主要为钒类化合物，在骨骼、肾脏和肝脏易产生蓄积，并引起呕吐、脱水等不良反应。双胍类口服降血糖药(苯乙双胍和丁双胍)因其会导致乳酸性中毒而停止销售。
5.氨基寡糖类化合物—阿卡波糖是临床最常用的α-糖苷酶抑制剂，其不良反应主要是腹胀、肠鸣等。尽管一些具有α-糖苷酶抑制活性的氨基寡糖类化合物先后被报道，如isovalertatins、acarviostatins，但其体内疗效仍然有待提高。
6.因此，本领域还需要寻找新的具有更高生物安全性的糖苷酶抑制剂药物，以满足临床用药需求。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供具有糖苷酶抑制活性的酰基他定类化合物及制备方法，以及该类糖苷酶抑制剂在治疗糖尿病及相关代谢疾病中的应用。
8.在本发明的第一方面，提供式(i)所示化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体，
[0009][0010]
其中，n为1～5的正整数；
[0011]
m、p或t独立地为0～10的正整数；
[0012]
r1～r9中至少一个基团(如1～5个基团，更特别如1，2，3，4个)为-o-z，所述z为酰基；r1～r9中其余基团各自独立地选自：羟基、h、c
1-c4烷基、c
2-c4链烯基、c
2-c4链炔基、卤素；
[0013]
r1’～r9’，r1”～r9”，ra，rb各自独立地选自：羟基、h、c
1-c4烷基、c
2-c4链烯基、c
2-c4链炔基、卤素；
[0014]
y2～y4、y6、y8、y9各自独立地选自：氧、氨基、硫；
[0015]
x2～x6、x8、x9各自独立地选自：氧、硫。
[0016]
在一个或多个实施方案中，n为1，2或3。
[0017]
在一个或多个实施方案中，m为0～6的正整数，如0、1、2、3、4、5，优选2、3、4、5。
[0018]
在一个或多个实施方案中，p为0～6的正整数，如0、1、2、3、4、5，优选0、1、2、3。
[0019]
在一个或多个实施方案中，t为0～6的正整数，如0、1、2、3、4、5，优选0、1、2、3。
[0020]
在一个或多个实施方案中，m为2，n为1，p为0或1，t为0。优选地，m为2，n为1，p为1，t为0。
[0021]
在一个或多个实施方案中，所述的酰基包含2～8个碳原子；优选包含2～6个碳原子，如为2，3，4，5个碳原子；更优选地，所述的酰基包括：乙酰基，丙酰基，丁酰基，戊酰基。
[0022]
在一个或多个实施方案中，所述的酰基为经取代或未经取代的酰基。所述取代基选自羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4链烯基、c
2-c4链炔基、卤素。
[0023]
在一个或多个实施方案中，所述-o-z在r3位。
[0024]
在一个或多个实施方案中，所述的r1～r9中其余基团、r1’～r9’、r1”～r9”、ra、rb各自独立地选自：羟基、h、c1-c2烷基、c2-c3链烯基、c2-c3链炔基、卤素。
[0025]
在一个或多个实施方案中，r2和r8是c1-c2烷基。
[0026]
在一个或多个实施方案中，r1、r4、r5-r7和r9各自独立地选自羟基、h、c1-c2烷基，优选羟基。
[0027]
在一个或多个实施方案中，r1’～r9’、r1”～r9”、ra、rb各自独立地选自羟基、h、c1-c2烷基，优选羟基。
[0028]
在一个或多个实施方案中，x2～x6、x8、x9为氧。
[0029]
在一个或多个实施方案中，y2～y4、y6、y8、y9为氧。
[0030]
在一个或多个实施方案中，z选自甲酰基、异丁酰基、未取代的正丁酰基、取代的2-丁酰基，所述取代基选自羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4链烯基、c
2-c4链炔基、卤素。
[0031]
在一个或多个实施方案中，z选自异丁酰基和c
1-c4烷基取代或未取代的2-丁酰基。
[0032]
在一个或多个实施方案中，所述式(i)化合物选自：
[0033][0034]
本发明还提供本文所述式(i)化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体在制备抑制糖苷酶活性，延缓胃肠道对碳水化合物的水解和吸收，降低餐后血糖浓度，或预防、缓解或治疗受益于血糖降低的疾病或病症的产品中的用途。
[0035]
在一个或多个实施方案中，受益于血糖降低的疾病或病症包括：高血糖症、糖尿病及其并发症、高胰岛素血症、心血管病或糖代谢疾病。所述糖尿病优选ii型糖尿病。
[0036]
在一个或多个实施方案中，所述糖苷酶是α-糖苷酶，例如α-淀粉酶；所述碳水化合物是含α-糖苷键的碳水化合物，例如含α-1,4糖苷键的碳水化合物。
[0037]
在一个或多个实施方案中，所述糖苷酶是β-糖苷酶，例如蔗糖酶；所述碳水化合物
是含β-糖苷键的碳水化合物，例如蔗糖。
[0038]
在一个或多个实施方案中，所述产品包括日化用品、食品、保健品、药物组合物或试剂盒。
[0039]
在一个或多个实施方案中，所述产品是抑制α-糖苷酶活性，抑制α-糖苷酶(例如小肠刷状缘上α-糖苷酶)对含有α-1,4糖苷键的碳水化合物的水解，减少葡萄糖的生成和吸收，降低餐后血糖浓度，或预防、缓解或治疗受益于血糖降低的疾病或病症的产品，所述式(i)化合物中，z选自甲酰基、异丁酰基、未取代的正丁酰基、取代的2-丁酰基，所述取代基选自羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4链烯基、c
2-c4链炔基、卤素。优选地，所述式(i)化合物选自本文所述的：异丁酰他定i03，m-1a；2-甲基丁酰他定i03，n-1a和异丁酰他定ii03，m-1b。
[0040]
在一个或多个实施方案中，所述产品是抑制β-糖苷酶(例如小肠上β-糖苷酶)活性，减缓由蔗糖生成葡萄糖和果糖的速率，减少餐后高血糖的发生，或预防、缓解或治疗受益于血糖降低的疾病或病症的产品，所述式(i)化合物如本文第一方面所述。优选地，所述式(i)化合物选自本文所述的：乙酰他定i03，g-2；丙酰他定i03，k-1；羟丁酰他定i03，g-1；异丁酰他定i03，m-1a；2-甲基丁酰他定i03，n-1a；异戊酰他定i03，n-1b；乙酰他定ii03，i-1和异丁酰他定ii03，m-1b。
[0041]
本发明还提供一种抑制糖苷酶活性的方法，包括：使本文所述式(i)化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体与含糖苷酶的样品接触，从而抑制糖苷酶的活性。
[0042]
在一个或多个实施方案中，所述的抑制糖苷酶活性的方法为非诊断或治疗性的方法。
[0043]
在一个或多个实施方案中，所述糖苷酶是α-糖苷酶，优选为α-淀粉酶，所述式(i)化合物中，z选自甲酰基、异丁酰基、未取代的正丁酰基、取代的2-丁酰基，所述取代基选自羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4链烯基、c
2-c4链炔基、卤素。优选地，所述式(i)化合物选自本文所述的：异丁酰他定i03，m-1a；2-甲基丁酰他定i03，n-1a和异丁酰他定ii03，m-1b。
[0044]
在一个或多个实施方案中，所述糖苷酶是β-糖苷酶，优选为蔗糖酶，所述式(i)化合物如本文第一方面所述。优选地，所述式(i)化合物选自本文所述的：乙酰他定i03，g-2；丙酰他定i03，k-1；羟丁酰他定i03，g-1；异丁酰他定i03，m-1a；2-甲基丁酰他定i03，n-1a；异戊酰他定i03，n-1b；乙酰他定ii03，i-1和异丁酰他定ii03，m-1b。
[0045]
本发明还提供一种抑制α-糖苷酶(例如小肠上α-糖苷酶)对含有α-1,4糖苷键的碳水化合物的水解，减少葡萄糖的生成和吸收，降低餐后血糖浓度，或预防、缓解或治疗受益于血糖降低的疾病或病症的方法，包括：给予有需要的对象有效量的本文所述式(i)所示化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体，所述式(i)化合物中，z选自甲酰基、异丁酰基、未取代的正丁酰基、取代的2-丁酰基，所述取代基选自羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4链烯基、c
2-c4链炔基、卤素。优选地，所述式(i)化合物选自本文所述的：异丁酰他定i03，m-1a；2-甲基丁酰他定i03，n-1a和异丁酰他定ii03，m-1b。
[0046]
本发明还提供一种抑制β-糖苷酶(例如小肠上β-糖苷酶)活性，减缓由蔗糖生成葡萄糖和果糖的速率，减少餐后高血糖的发生，或预防、缓解或治疗受益于血糖降低的疾病或病症的方法，包括：给予有需要的对象有效量的本文所述式(i)所示化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体，所述式(i)化合物如本文第
一方面所述。优选地，所述式(i)化合物选自本文所述的：乙酰他定i03，g-2；丙酰他定i03，k-1；羟丁酰他定i03，g-1；异丁酰他定i03，m-1a；2-甲基丁酰他定i03，n-1a；异戊酰他定i03，n-1b；乙酰他定ii03，i-1和异丁酰他定ii03，m-1b。
[0047]
本发明还提供一种提高氨基寡糖类化合物对于糖苷酶的抑制活性的方法，包括：在氨基寡糖类化合物加上至少一个酰基基团。
[0048]
在一个或多个实施方案中，所述糖苷酶是α-糖苷酶或β-糖苷酶。优选地，所述糖苷酶是α-淀粉酶或蔗糖酶。
附图说明
[0049]
图1a，酰基他定新化合物m-1a和n-1a的裂解方式图。
[0050]
图1b，m-1a的hresims/ms图谱。
[0051]
图1c，n-1a的hresims/ms图谱。
[0052]
图2a，酰基他定新化合物m-1b的裂解方式图。
[0053]
图2b，m-1b的hresims/ms图谱。
[0054]
图3a，系列浓度梯度淀粉溶液与对应吸光值的标准曲线
[0055]
图3b，酰基他定新化合物对α-淀粉酶的抑制作用
[0056]
图4，酰基他定类化合物对蔗糖酶的抑制作用
具体实施方式
[0057]
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
[0058]
本发明发现一类酰基他定类化合物具有高效的糖苷酶抑制活性。本发明的化合物的β-糖苷酶抑制活性比阿卡波糖高8倍以上。化合物m-1b、m-1a和n-1a对α-糖苷酶的抑制活性比阿卡波糖高17倍以上。此外，发明人分析发现，含有较多(例如两个)假三糖单元的化合物比含有较少(例如一个)假三糖单元的化合物具有更高的α-糖苷酶和β-糖苷酶抑制活性。上述酰基他定类化合物具有式(i)所示结构，
[0059][0060]
其中，n为1～5的正整数；m、p或t独立地为0～10的正整数；r1～r9中至少一个基团(如1～5个基团，更特别如1，2，3，4个)为-o-z，所述z为酰基；r1～r9中其余基团各自独立地选自：羟基、h、c
1-c4烷基、c
2-c4链烯基、c
2-c4链炔基、卤素；r1’～r9’，r1”～r9”，ra，rb各自独立地选自：羟基、h、c
1-c4烷基、c
2-c4链烯基、c
2-c4链炔基、卤素；y2～y4、y6、y8、y9各自独立地选自：氧、氨基、硫；x2～x6、x8、x9各自独立地选自：氧、硫。在一个或多个实施方案中，-o-z在r3位，z选自异丁酰基和c
1-c4烷基取代或未取代的正丁酰基，r2和r8是c1-c2烷基，r1、r4、r5-r7和r9各自独立地选自羟基、h、c1-c2烷基，r1’～r9’、r1”～r9”、ra、rb各自独立地选自羟基、h、c1-c2烷基，x2～x6、x8、x9、y2～y4、y6、y8、y9为氧。
[0061]
本发明人意外地发现，式(i)所示的化合物具有高效的α-糖苷酶和β-糖苷酶抑制活性。本发明还包括上述式(i)化合物的药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体，只要它们也具有与式(i)化合物具有相同或基本相同的功能。
[0062]
如本文所用，术语“烷基”单独或与其它术语组合使用，是指饱和脂肪族烷基，包括1-20个碳原子的直链或支链烷基。优选地，烷基是指含有1-10个碳原子的中等烷基，如甲基、乙基、丙基、2-异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基及类似烷基。更优选地，是指含有1-4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基及类似烷基。烷基可以被取代也可不被取代。当被取代时，取代基个数为1个或多个，优选1-3个，更优选1个或2个，取代基团独立地选自包括卤素、羟基、低级烷氧基、芳基。
[0063]
本文所用的术语“链烯基”包括含有至少一个碳碳双键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。
[0064]
本文所用的术语“链炔基”包括含有至少一个碳碳三键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。
[0065]
本文所用的术语“卤素”指f、cl、br、或i。
[0066]
如本文所用，术语“取代”，是指一个化合物具有取代基，该取代基至少包含一个带有一个或多个氢原子的碳原子、氮原子、氧原子或硫原子。如果一个取代基被描述为被“取代”，是指一个非氢取代基占据了一个碳、氮、氧、或硫上的一个氢的位置。本发明中，所述的烷基、链烯基、链炔基可被取代；例如，取代或未取代的烷基，取代或未取代的链烯基，取代或未取代的链炔基。除非另有定义，否则经取代的基团在一个或多个适当位置具有取代基，且当超过一个位置经取代时，每一取代位置的取代基可为相同或不同。所述的经取代的酰基的取代基包括：羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4链烯基、c
2-c4链炔基、卤素。
[0067]
本文所用的术语“异构体”包括：几何异构体、对映异构体、非对映异构体(如顺反异构体，构象异构体)。本发明公开的化合物或其盐可以包括一个或多个非对称中心，因此会存在对映异构体、非对映异构体以及其它可以被定义的立体异构体形式，根据立体化学可分为(r)-或(s)-、用于氨基酸的(d)-或(l)-。本发明意为包括所有这些可能的异构体，以及外消旋形式和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(r)-和(s)-或(d)-和(l)-异构体可以通过手性合成子或手性试剂制备，或用通常的技术如使用手性柱的高效液相来分离制备。当本发明所述的化合物含有烯族双键或其它几何不对称中心时，除非另有说明，则其意为该化合物包括e和z几何异构体。同样地，所有的互变异构体也包括在内。
[0068]
本发明中，“食品中或药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
[0069]
本文所述“食品中或药学上可接受的盐”包括酸式盐和碱式盐。
[0070]“药学上可接受的酸式盐”是指可保持游离碱的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。该类盐可由无机酸构成，例如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似的酸。该类盐还可由有机酸构成，例如但不限于乙酸、二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基磺酸、1,2-乙二磺酸、乙烷磺酸、羟乙基磺酸、蚁酸、延胡索酸(fiimaric acid)、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、羟基乙酸、马尿酸、异丁酸、乳
酸、乳糖酸、月桂酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲烷磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、2-萘磺酸、1-萘酚-2-甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸及类似酸。
[0071]“药学上可接受的碱式盐”是指可保持游离酸的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。这些盐通过向游离酸中加入无机碱或有机碱制成。通过无机碱得到的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐及类似盐。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐以及镁盐。通过有机碱得到的盐包括但不限于一级、二级、三级铵盐，取代的胺包括天然取代的胺、环胺以及碱性离子交换树脂，例如氨气、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、n,n'-双苄基乙撑二胺、乙二胺、葡萄糖胺、甲葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、缓血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、聚酰胺树脂以及类似结构。优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
[0072]
通常结晶会产生所公开化合物的溶剂化产物。当在本文中使用时，术语“溶剂化物”是指一种包含了一种或多种本专利公开的化合物分子与一种或多种溶剂分子的聚合物。溶剂可能是水，此时溶剂化物可能是水合物。可选地，溶剂还可能是有机溶剂。因此，本专利公开的化合物可以作为水合物存在，包括单水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物及类似结构，还可作为相应的溶剂化产物存在。本发明公开的化合物可以是真正的溶剂化物，而在其它情况下，本发明公开的化合物也可以是仅保有一部分水，或者是保有水与一些溶剂的混合物。
[0073]
所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(i)的一种化合物，或化学结构式(i)的一个化合物所组成的盐或溶液。
[0074]
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
[0075]
制备方法
[0076]
本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如微生物，特别是海洋链霉菌)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。
[0077]
作为本发明的优选方式，提供了一种制备本发明的式(i)所示的化合物的方法，所述方法包括：培养海洋链霉菌ho 1518，获得培养产物(例如培养上清液)，从中分离获得所述的式(i)化合物。之后，包括对培养产物进行纯化，从不同的洗脱液中，分离不同的式(i)化合物。产物的收集、纯化本领域周知，例如可以采用树脂吸附和洗脱法例如梯度洗脱。
[0078]
其它的制备式(i)化合物的方法也被包含在本发明中，例如通过化学合成的方法将糖单元相连。合成的化合物可以进一步通过柱层析法、高效液相色谱法等方式进一步纯化。
[0079]
组合物
[0080]
本发明还提供一种组合物，包含本文所述的式(i)化合物或其药学上或食品中可
接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体，和药学上或食品中可接受的辅料。所述组合物可以是食品、保健品、药物组合物。
[0081]
本发明中，“食品中或药学上可接受的辅料”是用于将本发明的式(i)化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体传送给动物或人的药学上或食品上可接受的载体、溶剂、悬浮剂或赋形剂。辅料可以是液体或固体，包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。在一些实施方案中，药学上可接受的辅料可以包括一种或多种非活性成分，包括但不限于：稳定剂、防腐剂、添加剂、佐剂、喷雾剂、压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。更具体而言，合适的辅料可以是本领域常用于植物提取成分或核酸给药的辅料。
[0082]
通常，组合物中含有治疗有效量的本文所述试剂。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。治疗有效量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案在多个剂量中给药。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。示例性地，所述组合物含有按照重量比例为例如0.001-50％，优选0.01-30％，更优选0.05-10％的式(i)所示的化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体。
[0083]
本文所述组合物可与其他控制体重或治疗受益于血糖降低的试剂联用。本领域技术人员可确定其他试剂的给药剂量。
[0084]
在一个或多个实施方案中，所述组合物还可以含有蛋白质、脂质、碳水化合物、食物纤维和维生素等。蛋白质例如乳蛋白(全乳蛋白、酪蛋白钠、酪蛋白钙等)及其水解物、其他动物性蛋白(卵蛋白、明胶等)及其水解物、以及植物性蛋白(大豆等)及其水解物。本发明的组合物可以含有蛋白质作为主要成分。总蛋白质含量可以适当决定，如果目的是摄取每日必需摄取量的1/3，则优选13～30g/400ml左右。维生素也可以添加维生素a、b1、b2、b6、b12、c、d、e、k2、烟酸、泛酸、叶酸等，可以单独添加也可以混合。本发明的组合物还可以含有干燥酵母(例如啤酒酵母、面包酵母等)。
[0085]
本发明所述的组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物机体的剂型都是可以的，可以被制成单位剂型的形式。剂型比如可选自：凝胶剂、气雾剂、片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、散剂、丸剂、控速释剂、输液剂、混悬剂等等。根据本发明的化合物所治疗的疾病类型，本领域人员可以选择方便应用的剂型。从易于制备和储存的立场看，优选的组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。本发明的化合物或其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。本发明的化合物或其组合物也可储存在适当的容器，并置于试剂盒或药盒中。所述组合物还可以是日化用品，例如洗发水、沐浴露、化妆品、洗衣粉等。
[0086]
方法和用途
[0087]
本发明人在研究中发现，式(i)所示的化合物具有高效的抑制α-糖苷酶和β-糖苷酶的作用，因此其是良好的α-糖苷酶和β-糖苷酶抑制剂。作为α-糖苷酶和β-糖苷酶抑制剂，该化合物可以延缓胃肠道对碳水化合物的水解和吸收，降低餐后血糖浓度，或预防、缓解或
治疗受益于血糖降低的疾病或病症。本文所述受益于血糖降低的疾病或病症包括：高血糖症、糖尿病及其并发症、高胰岛素血症、心血管病或糖代谢疾病。特别地，式(i)所示的化合物能够高效地抑制α-糖苷酶活性，抑制α-糖苷酶(例如小肠刷状缘上α-糖苷酶)对含有α-1,4糖苷键的碳水化合物的水解，减少葡萄糖的生成和吸收，降低餐后血糖浓度；而且，式(i)所示的化合物能够高效地抑制β-糖苷酶(例如小肠上β-糖苷酶)活性，减缓由蔗糖生成葡萄糖和果糖的速率，减少餐后高血糖的发生。
[0088]
本文所述“糖苷酶”是水解糖苷键的酶，包括α-糖苷酶和β-糖苷酶，分别水解α-糖苷键(例如α-1,4糖苷键)和β-糖苷键(例如β-d-呋喃果糖苷键)。含糖苷键的化合物可以是蛋白、核酸、碳水化合物，例如双糖，包括但不限于麦芽糖、蔗糖。
[0089]
因此，在非诊断或治疗性方面，本发明提供一种抑制α-糖苷酶和/或β-糖苷酶活性的方法，包括：使本文所述式(i)化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体与含α-糖苷酶和/或β-糖苷酶的样品接触，从而抑制α-糖苷酶和/或β-糖苷酶的活性。此外，本发明还提供一种延缓胃肠道对碳水化合物的水解和吸收，降低餐后血糖浓度，或预防、缓解或治疗受益于血糖降低的疾病或病症的方法，特别是一种抑制α-糖苷酶活性，抑制α-糖苷酶(例如小肠刷状缘上α-糖苷酶)对含有α-1,4糖苷键的碳水化合物的水解，减少葡萄糖的生成和吸收，降低餐后血糖浓度的方法；或者是一种抑制β-糖苷酶(例如小肠上β-糖苷酶)活性，减缓由蔗糖生成葡萄糖和果糖的速率，减少餐后高血糖的发生的方法，包括：给予有需要的对象有效量的本文所述式(i)所示化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体。
[0090]
具体而言，“有效量”指的是对人或者动物能够产生治疗功能的，并且能够被动物和人所接受的注射量。例如，在液体的组合药物中，多肽的浓度可以是20ng/ml以上、50ng/ml、100ng/ml以上等。该有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。可调节剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0091]
本发明中化合物的给药方式可以包括但是并不限制于皮下注射、经皮注射、植入、局部给药、肌肉注射、缓释给药和口服等。本领域技术人员知晓在不同给药方式、剂量、给药部位等情况下将药物给予对象所需的其他试剂。例如敷料、溶剂(如水)等。
[0092]
实施上述方法的试剂盒包含本文所述式(i)所示化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体，或本文所述的组合物，和任选的施用它们所需的其他物品，和任选的说明书。所述其他物品例如使用或施用各种剂型的组合物所需的量具、容器例如注射器等。所述说明书用于指导所述使用或施用过程。因此，本发明还提供本文所述式(i)化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体在制备抑制α-糖苷酶和/或β-糖苷酶活性，延缓胃肠道对碳水化合物的水解和吸收，降低餐后血糖浓度，或预防、缓解或治疗受益于血糖降低的疾病或病症的产品中的用途。所述产品可以是日化用品、食品、保健品、药物组合物或试剂盒。
[0093]
在具体实施方案中，本发明包括本文所述式(i)化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体在制备抑制α-糖苷酶活性，抑制α-糖苷酶(例如小肠刷状缘上α-糖苷酶)对含有α-1,4糖苷键的碳水化合物的水解，减少葡萄糖的生成和吸收，降低餐后血糖浓度，或预防、缓解或治疗受益于血糖降低的疾病或病症的产品
中的用途，其中，z选自甲酰基、异丁酰基、未取代的正丁酰基、取代的2-丁酰基，所述取代基选自羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4链烯基、c
2-c4链炔基、卤素。优选地，所述式(i)化合物选自本文所述的：异丁酰他定i03，m-1a；2-甲基丁酰他定i03，n-1a；和异丁酰他定ii03，m-1b。所述α-糖苷酶优选是α-淀粉酶。
[0094]
在另一具体实施方案中，本发明包括本文所述式(i)化合物或其药学上或食品中可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物、水合物或前体在制备抑制β-糖苷酶(例如小肠上β-糖苷酶)活性，减缓由蔗糖生成葡萄糖和果糖的速率，减少餐后高血糖的发生，或预防、缓解或治疗受益于血糖降低的疾病或病症的产品中的用途，其中，所述式(i)化合物如本文所述。优选地，所述式(i)化合物选自本文所述的：乙酰他定i03，g-2；丙酰他定i03，k-1；羟丁酰他定i03，g-1；异丁酰他定i03，m-1a；2-甲基丁酰他定i03，n-1a；异戊酰他定i03，n-1b；乙酰他定ii03，i-1和异丁酰他定ii03，m-1b。所述β-糖苷酶优选是蔗糖酶。
[0095]
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
[0096]
实施例
[0097]
实施例1、菌株的发酵培养及化合物的制备
[0098]
海洋链霉菌菌株ho 1518于2010年采自中国山东日照附近50-100m深海域的海洋沉积物，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为cctcc no:m 2018176ho 1518。
[0099]
向500ml锥形瓶中添加100ml 3％tsb溶液(购自美国bd公司)，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至室温，接种链霉菌ho 1518斜面孢子，置于28℃，250rpm的恒温摇床中，培养48h，作为种子液。
[0100]
精密称量以下无机盐(g/l)：nacl 24.4770，na2so
4 3.9170，kcl 0.664，srcl2·
6h2o 0.0404，mgcl2·
6h2o 4.981，cacl
2 0.9482，nahco
3 0.192，h3bo
3 0.026，naf 0.004，用自来水溶解并定容至一定体积，配制人工海水；精密称取微量元素金属盐(g/l)：mncl
2 0.389，niso4·
6h2o 0.056，licl 0.028，k2cr2o
7 0.15，na2edta 1.00，fecl3·
6h2o 2.00，alcl
3 0.05，cucl
2 0.02，cocl2·
6h2o 0.005，zncl
2 0.06，na2moo4·
2h2o 0.074，ki 0.08，bacl2·
2h2o 0.05，使用自来水定容至相应体积，配制微量元素溶液。使用人工海水配制ph培养基(pharmamedia粉末1％，可溶性淀粉1％，葡萄糖1.2％，玉米浆干粉0.5％)，调节ph为7.2，向2l锥形瓶中添加400ml ph培养基(内含400μl微量元素溶液)，121℃高压灭菌20min，冷却后接种ho 1518种子液，置于28℃，200rpm的发酵罐中培养7天，总共发酵35l。
[0101]
将菌株ho 1518发酵液离心，收集上清液；利用xad-16大孔树脂柱吸附链霉菌中的代谢产物，然后使用50％乙醇水和100％乙醇洗脱至几乎无色，浓缩洗脱液，获得粗提物。粗提物经ods-c
18
反相硅胶柱层析，甲醇/水(5:95
→
100:0)梯度洗脱，分为6个馏分(fr.1-fr.6)；经hplc检测，确定酰基他定类化合物存在于fr.1和fr.2中。馏分fr.1经ods-c18反相硅胶柱层析，甲醇/水梯度洗脱(5:95
→
100:0)，分为11个亚组分(a-k)。亚组分g先经全制备hplc分离(mecn/h2o，8ml/min；0～50min，5:95
→
25:75；50.1～70min，25:75
→
50:50)，再经半制备hplc进一步纯化(meoh/h2o，18:82，3ml/min)，分离得到已知化合物g-1(乙酰他定i03，5.0mg,t
r 24.7min)和g-2(羟丁酰他定i03，4.3mg,t
r 32.7min)；亚组分i先经mci柱层
析，再经hplc全制备(mecn/h2o，8ml/min；0～50min，5:95
→
25:75；50.1～70min，25:75
→
50:50)和hplc半制备(meoh/h2o，18:82，3ml/min)分离纯化，得到已知化合物i-1(乙酰他定ii03，50.2mg,t
r 28.7min)；亚组分k利用mci柱层析分离，再经hplc半制备(meoh/h2o，18:82，3ml/min)，得到已知化合物k-1(丙酰他定i03，40.2mg,t
r 38.7min)。
[0102]
利用mci柱对馏分fr.2进行梯度洗脱(meoh/h2o，5:95
→
100:0)，细分成14个亚组分(a-m)。亚组分m先经反相硅胶柱层析，再经hplc全制备(mecn/h2o，8ml/min；0～50min，5:95
→
25:75；50.1～70min，25:75
→
50:50)，并利用hplc半制备进一步纯化(meoh/h2o，26:74，3ml/min)，得到新化合物m-1a(异丁酰他定i03，10.9mg,t
r 28.7min)和m-1b(异丁酰他定ii03，10.2mg,t
r 30.6min)。亚组分n经反相硅胶柱层析，甲醇/水梯度洗脱，经两次hplc半制备(mecn/h2o，10:90，3ml/min；meoh/h2o，27:73，3ml/min)，获得新化合物n-1a(2-甲基丁酰他定i03，3.2mg,t
r 17.6min)和已知化合物n-1b(异戊酰他定i03，15.6mg,t
r 18.8min)。
[0103]
全制备柱为半制备柱为半制备柱为分析检测柱为分析检测柱为紫外检测波长为210nm。
[0104]
实施例2、酰基他定家族新化合物的化学结构
[0105]
上述获得的3个新化合物均为无色透明固体，易溶于水，紫外吸收为末端吸收。
[0106]
异丁酰他定i03(对应于化合物代号m-1a)，分子式为c
41h69
no
29
，分子量为1039.40。
[0107]
2-甲基丁酰他定i03(对应于化合物代号n-1a)，分子式为c
42h71
no
29
，分子量为1053.41。
[0108]
异丁酰他定ii03(对应于化合物代号m-1b)，分子式为c
60h100
n2o
41
，分子量为1504.58。
[0109]
表1、化合物m-1a和n-1a的核磁数据*
[0110][0111][0112]
*a-i环的位置为从化合物的右侧到左侧数起。
[0113]
表2、化合物m-1b的核磁数据*
[0114][0115]
实施例3、酰基他定家族新化合物质谱裂解规律
[0116]
3.1、阿卡他定家族i03骨架类型
[0117]
酰基他定新化合物m-1a和n-1a属于阿卡他定家族i03骨架类型，在正离子质谱裂解模式下，它们形成共同的碎片离子峰m/z 304(b2)，与前体化合物—阿卡他定i03的质谱裂解碎片相同；而在m/z y5和b3-b5处的碎片离子峰及分子离子峰，与阿卡他定i03分别相差70和84个质量单位。以上表明，酰基他定新化合物m-1a和n-1a的酰基取代位置均在d环上。两个化合物详细的裂解方式如图1a所示，其hresims/ms图谱见图1b～1c。
[0118]
3.2、阿卡他定家族ii03骨架类型
[0119]
酰基他定新化合物m-1b属于阿卡他定家族ii03骨架类型，在正离子质谱裂解模式下，它形成共同的碎片离子峰m/z 304(b2)，466(b3)，624(b4)和769(b5)，与前体化合物—阿卡他定ii03的质谱裂解碎片相同；而在m/z y5-y8和b6-b8处的碎片离子峰及分子离子峰，与阿卡他定ii03相差70个质量单位。以上说明，酰基他定新化合物m-1b的酰基取代位置也在d环上。化合物m-1b的详细的裂解方式见图2a，其hresims/ms图谱如图2b所示。
[0120]
实施例4、酰基他定家族新化合物在酶学水平对α-糖苷酶活性的抑制
[0121]
上述获得的新化合物属于氨基寡糖类化合物，与化合物阿卡波糖在部分结构上存在相似性。阿卡波糖为ii型糖尿病临床用药，其作用机理为抑制肠道内α-淀粉酶(为典型的糖苷酶)对淀粉的水解，减少葡萄糖的产生，从而达到降低血糖的目的。鉴于此，本发明人以阿卡波糖为阳性对照，测试获得的新化合物的活性。
[0122]
首先，建立淀粉溶液的标准曲线：
[0123]
分别取0、10、20、30、40、45、50、55、60、70、80、90和100μl 0.2％淀粉溶液，加入到96孔板中，依次加入150、140、130、120、110、105、100、95、90、80、70、60和50μl磷酸盐缓冲溶液(ph＝6.9)，在20℃孵育30min，再加入20μl 1m盐酸。精密量取100μl反应液，转移至96孔板，加入25μl卢戈氏碘液，充分混匀。在630nm下读取各浓度的吸光值，平行测量三次。
[0124]
将5μl猪胰α-淀粉酶溶液(50u/ml)和45μl不同浓度的受试样品溶液或阿卡波糖溶液(抑制剂，溶于蒸馏水中)混合，置于20℃，100rpm摇床中孵育10min，再加入100μl 0.2％的可溶性淀粉溶液(底物，溶于ph为6.9的100mm磷酸盐缓冲液)，混匀，反应30min，加入20μl 1m盐酸，以终止反应。其余操作同上。
[0125]
根据系列浓度梯度的淀粉溶液的吸光度值，绘制其标准曲线，如图3a所示；代入阿卡波糖和受试样品溶液的吸光度值，计算出待测化合物对淀粉抑制率(表3～6)。使用graphpad prism 5.0计算各样品的ic
50
值，见图3b和表7。
[0126]
表3阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制作用
[0127][0128]
表4化合物m-1a对α-淀粉酶的抑制作用
[0129][0130]
表5化合物n-1a对α-淀粉酶的抑制作用
[0131][0132]
表6化合物m-1b对α-淀粉酶的抑制作用
[0133]
[0134]
表7酰基他定类新化合物对α-淀粉酶的抑制活性
[0135][0136]
由表7可知，本发明的3个新化合物m-1b、m-1a和n-1a均表现出显著的α-淀粉酶抑制活性，且均优于阳性对照药—阿卡波糖；其中以m-1b的抑制活性最强(ic
50
＝0.045
±
0.007μm)，约为阿卡波糖抑制活性的85倍；m-1a和n-1a的ic
50
值介于0.152～0.219μm之间，分别为阿卡波糖抑制活性的17倍和25倍。
[0137]
实施例5，酰基他定家族化合物在酶学水平对蔗糖酶活性的抑制
[0138]
上述获得的8个化合物属于氨基寡糖类化合物，与化合物阿卡波糖在部分结构上存在相似性。据文献报道，阿卡波糖具有蔗糖酶抑制活性。鉴于此，本发明人以阿卡波糖为阳性对照，测试8个化合物的蔗糖酶抑制活性。
[0139]
将10μl蔗糖酶溶液(100u/ml)和30μl不同浓度的受试样品溶液(抑制剂，溶于蒸馏水中)混合，于37℃孵化10min；再加入100μl 60mm蔗糖溶液(底物，溶于ph为6.0的磷酸盐缓冲液)，混匀，37℃孵化30min。然后，加入200μl 3,5－二硝基水杨酸，于沸水中灭活5min，冷却至室温。将反应液置于酶标仪下，在540nm下读取各样品溶液的吸光度值(a样)，平行试三次。以相同体积的蒸馏水代替待测样品溶液作为阴性对照组，按相同操作测试其吸光度值(a样空)。根据不同浓度的样品溶液和空白溶液的吸光度值，按以下公式计算其蔗糖酶抑制率(表8)。接着，使用graphpad prism 5.0计算各样品的ic
50
值，见图4和表9。
[0140]
蔗糖酶活性抑制率/％＝(a样-a样空)/a样空
×
100
[0141]
表8奥利司他对蔗糖酶的抑制作用
[0142]
[0143][0144]
表9酰基他定化合物对蔗糖酶的抑制活性
[0145][0146]
由表9可知，本发明的化合物均具有显著的蔗糖酶抑制活性，且均优于阳性对照药—阿卡波糖。其中，以化合物i-1和m-1b的蔗糖酶抑制活性最好，较阿卡波糖强约30倍和8倍；化合物g-1、g-2、k-1、m-1a、n-1a和n-1b的ic
50
值介于2.36～9.34μm。通过构-效关系分析发现，含有两个假三糖(即九个结构单元)的化合物i-1和m-1b对蔗糖酶的抑制活性优于含有一个假三糖(即六个结构单元)的化合物。以上表明假三糖结构单元的增加能提高化合物的蔗糖酶抑制活性。此外，取代侧链以乙酰基和丙酰基的蔗糖酶抑制活性最佳。