去甲泽拉木醛在抗结核分枝杆菌感染中的潜在应用的制作方法

[0001]
本发明涉及药学的技术领域，具体说是去甲泽拉木醛在抗结核分枝杆菌感染中的应用。


背景技术：

[0002]
结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)侵入人体可导致肺结核，分枝杆菌的分类众多，实验菌株包括h37rv、h37ra和bcg。结核分枝杆菌携带者在说话、咳嗽等过程中，病菌被散播进入到周围环境，健康人群接触环境中的病菌即有可能感染结核病。世界卫生组织在2018年的相关报告，全世界约存在17亿人被结核分枝杆菌所感染，预估1000万人患上结核病，结核病具有传染性强死亡率高的特点，目前通过注射疫苗和药物治疗两种方法，患病人数和死亡率成下降趋势。
[0003]
抗结核病药物的研究取得初步进展，目前结核病的治疗是基于联合用药的原则，多种药物联用可以提高疗效并缩短疗程。抗结核病药物包括一线治疗药物：异烟肼(isoniazid，inh)、利福平(rifampicin，rif)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，pza)、乙胺丁醇(ethambutol，emb)。二线治疗药物：阿米卡星，氧氟沙星等。已有的抗结核药物虽取得一定的治疗效果，但也面临着一系列问题和挑战：目前抗结核药物治疗方案为四种药物联用连续进行六个月治疗，疗程长病人依从性低，且药物的副作用肝毒性是一个大问题；另一方面长期服药以及滥用药物可能会导致耐药结核(rr-tb)、耐多药结核(mdr-tb)和广泛耐药结核(xdr-tb)的出现。还有重大障碍是部分人群被结核分枝杆菌(tb)和艾滋病病毒(hiv)同时侵染，需同时服用两类治病药物，两类药物共同使用时相互反应，对人体的毒性增大，因此对于tb/hiv共感染病人的治疗难度加大。因此科学家仍然需要致力于治疗结核病的研究，其中比较热门的是针对结核分枝杆菌的特定靶点研究，进而找出治疗结核病的潜在药物。
[0004]
莽草酸途径(shikimic acid pathway)是结核分枝杆菌生长和繁殖过程中重要的代谢途径，在生物体内经过7种催化酶的催化作用生成莽草酸，莽草酸进行一系列的反应生成多种芳香氨基酸。3-脱氢奎尼酸脱水酶(dhqase)是莽草酸途径的第3种酶，能够使3-脱氢奎尼酸(dhq)反应生成3-脱氢莽草酸(dhs)，该酶是莽草酸途径中不可缺少的一种酶，对于mtb在人体内存活及致病也是不可缺少的。因此，dhqase作为mtb毒力和生存严重依赖的潜在靶点，可以针对此靶点进行高通量筛选以获得抑制mtb感染的化合物。
[0005]
去甲泽拉木醛，英文名称为demethylzeylasteral，去甲泽拉木醛具有较强的免疫抑制活性，具有抗癌、抗炎的功能。但迄今为止，去甲泽拉木醛并未应用于抗结核分枝杆菌感染的探索和研究。


技术实现要素：

[0006]
针对相关技术中的问题，本发明提供去甲泽拉木醛在抗结核分枝杆菌感染中的应用。
[0007]
本发明还提供了针对结核分枝杆菌中3-脱氢奎尼酸脱水酶的抑制剂。
[0008]
本发明所涉及去甲泽拉木醛cas号为107316-88-1，购自上海陶素生化科技有限公司。在进行酶活测定时，去甲泽拉木醛对3-脱氢奎尼酸脱水酶抑制活性较好，科研人员可对去甲泽拉木醛进行深入的研究。
[0009]
本发明提供一种用于预防或治疗结核分枝杆菌中的3-脱氢奎尼酸脱水酶(dhqase)感染的药物，其活性成分为去甲泽拉木醛，该药物包含上述含有去甲泽拉木醛以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。
[0010]
本发明具有的优点和积极效果是：
[0011]
本发明的针对结核分枝杆菌中的3-脱氢奎尼酸脱水酶(dhqase)的抑制剂，这种抑制剂为去甲泽拉木醛。去甲泽拉木醛对结核分枝杆菌中的3
-ꢀ
脱氢奎尼酸脱水酶活性具有显著的抑制效果。
附图说明
[0012]
图1是去甲泽拉木醛对结核分枝杆菌中的3-脱氢奎尼酸脱水酶的抑制活性示意图
[0013]
图2是去甲泽拉木醛对结核分枝杆菌中的3-脱氢奎尼酸脱水酶的ic
50
的测定示意图
[0014]
图3是去甲泽拉木醛对结核分枝杆菌中的3-脱氢奎尼酸脱水酶抑制剂类型判断的示意图
具体实施方式：
[0015]
为了更好地说明本发明，在下面将详述本发明的具体实施方式。
[0016]
1.3-脱氢奎尼酸脱水酶(dhqase)的表达与纯化
[0017]
根据文献(petersen,guilherme o.,saxena,shalini,renuka,janupally,et al.structure-based virtual screening as a tool for the identification of novel inhibitors against mycobacterium tuberculosis 3-dehydroquinate dehydratase[j].journal of molecular graphics&modelling,2015,60:124-131.)
[0018]
(1)将pet28a-arod重组载体转化到escherichia coli bl21(de3)的菌株，利用lb(加入50mg/l卡那霉素)培养基筛选得到具有重组质粒菌株。
[0019]
(2)挑取具有重组质粒菌株，加入一定量lb液体培养基(50mg/l卡那霉素)，当其在600nm波长处的吸光值(即od600)达到0.6时，加入 0.1mm iptg(isopropyl-β-d-thiogalactoside)在20℃培养16小时。
[0020]
(3)用5000rpm离心10min收集细胞后高压破菌；破碎后10000rpm 离心30min保留上清夜。
[0021]
(4)将上清液加入破菌buffer(50mm tris-hcl,150mm nacl,ph 7.5) 并加入ni-nta亲和层析柱中，用ni-nta亲和层析获得较均一的蛋白。
[0022]
(5)含20mm咪唑的buffer除去非目的蛋白，含200mm咪唑的buffer 收集mtdhqase，
用层析的方法进行纯化来进一步获得具有稳定均一的目的蛋白。
[0023]
2.mtdhqase的活性测定
[0024]
采用纯度大于97％的5-dehydroquinic acid钾盐(购自sigma-aldrich公司)作为底物；紫外波长测定的仪器为m1000 pro全波长多功能微孔板检测仪，在紫外波长234nm处完成了dhqase活性的光度测定。
[0025]
蛋白buffer组分为50mm tris-hcl,150mm nacl,5％甘油，ph 7.5，用缓冲液配mtdhqase(终浓度2nm)，加入去甲泽拉木醛(终浓度为 20μm),10min进行孵育，迅速加入底物5-dehydroquinic acid钾盐浓度为 80μm。654rpm震荡10s，检测吸光度值。
[0026]
用酶标仪测定酶动力学曲线，曲线前600s的斜率作为酶促反应的初速度。计算出每个化合物的剩余活性和抑制率。设定v0为不加去甲泽拉木醛的初速度，v
i
为加去甲泽拉木醛的初速度。根据酶促反应速率，计算出每个化合物的剩余活性ra(residual activity，ra)(v
i
/v0)以及抑制率ir(inhibitionrate，ir)(1-v
i
/v0)。
[0027]
3.去甲泽拉木醛ic
50
的测定
[0028]
蛋白mtdhqase的终浓度为2nm，再用95％的dmso配置底物 5-dehydroquinic acid钾盐，使其终浓度为80μm。我们首先根据初筛结果设定12个抑制剂浓度，去甲泽拉木醛的浓度分别是240um、140μm、40μm、 20μm、10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm、0.3125μm、0.15625μm、 0.078125μm。先将mtdhqase与去甲泽拉木醛在37℃孵育10min后，加入 10μl底物，记录时间与吸光度值变化曲线。使用graphpad prism 6.0软件分析mtdhqase反应初速率，得到去甲泽拉木醛浓度与剩余活性的关系曲线，最终求出ic
50
值。
[0029]
4.化合物去甲泽拉木醛抑制剂类型的判断
[0030]
实验操作为：用95％的dmso配制抑制剂，去甲泽拉木醛的浓度为0μm、 2.5μm、5μm。用酶活buffer配制不同浓度的mtdhqase，浓度为0μm、0.25 μm、0.5μm、1μm、2μm、4μm。将90μl的不同浓度的mtdhqase加到96 孔u型酶标板中，加入1μl的不同浓度的抑制剂。最后加入10μl的80μm 底物5-dehydroquinic acid钾盐。使用m1000 pro全波长酶标仪测吸光度的变化值。
[0031]
本发明涉及药学的技术领域，具体说是去甲泽拉木醛在抗结核分枝杆菌感染中的应用，去甲泽拉木醛在抑制结核分枝杆菌中的mtdhqase时抑制率 ir>85％，且抑制剂类型为可逆性抑制剂，在制备抗结核分枝杆菌中3-脱氢奎尼酸脱水酶的小分子抑制剂方面有很大应用潜力，科研人员可对去甲泽拉木醛在抗结核病领域进行深入研究。
[0032]
以上所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常用的方法。
[0033]
以上仅为本发明的具体实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。