一种抑制TRPV1通路的多糖组合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及药品和化妆品
技术领域：
，具体涉及一种抑制trpv1通路的多糖组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
：随着社会经济的快速发展，居民生活水平不断提升，环境污染、生活压力等因素导致一系列皮肤问题的产生，如敏感肌肤。据不完全统计，全球敏感性肌肤的人群越来越多，其中男性占38％，女性占61％。环境污染和化妆品过度使用造成机体对外来物刺激的抵抗力逐渐减弱，皮肤过敏、刺激等情况越发频繁。皮肤过敏常见症状主要有发红、发痒，也可能会伴有水泡、红肿干屑及渗出液化等症状，具体病状程度因人而异，严重时可能会出现麻木、胸部紧绷、肿胀等症状。除了污染类过敏源外，各类化妆品中香精香料、防腐剂、染发剂、表面活性剂等物质都是常见的皮肤过敏原，这些中大多数属于化学添加成分，因此健康绿色的植物提取物成为化妆品抗敏的主流，具有抗敏抗炎、温和有效的化妆品日益受到人们的重视。而健康绿色、抗敏有效的化妆品源于物料本身，因此，具有稳定的抗敏抗刺激及舒缓类植物提取物会成为趋势，更加会受到学者和市场的青睐。皮肤过敏常伴有免疫和过敏机制的发生。其炎症反应是由于皮肤角质层的厚度降低，皮肤屏障功能受损，导致皮肤对外环境中水溶性刺激物的渗透性增加，外界抗原容易进入皮肤组织，通过角质细胞、郎格汉氏细胞及淋巴细胞介导炎症反应。由此说明皮肤的屏障功能受损不仅仅是皮肤炎症的一个表现，更重要的是导致皮肤炎症发生的导火索。皮肤是人体最大的器官，是抵御外界环境污染的有效屏障。其中，皮肤由不同组分构成了4层屏障，分别是：①微生物屏障：皮肤表面的微生物群体产生的小分子物质如游离脂肪酸(ffas)、溶于苯酚的调控蛋白(psms)，以及激活免疫细胞释放抗炎因子，有效抵御微生物、病原体的感染；②物理屏障：皮肤最外面的由无核的角质细胞构成角质层(sc)，及颗粒层中的紧密连接(tj)等结构组成物理屏障；其功能是抵制有害介质经皮渗透和过量的水分和盐分的流失；③化学屏障：由角质细胞间的疏水介质，即神经酰胺、游离脂肪酸和胆固醇构成脂质薄层和角质细胞产生的抗菌肽(amps)构成。其功能是保持皮肤组织的油脂平衡，抑制病原体和过敏原的入侵；④神经屏障：由适应性免疫系统中的体液和细胞构成的免疫屏障，包括多种炎症因子和淋巴细胞，如树突状细胞(dendriticcells，dc)、抗原提呈细胞apc和nk细胞等。一旦皮肤的屏障作用被破坏，将会引起皮肤类疾病的发生，如红斑、变黑、皮肤衰老、皮肤过敏和皮肤炎症等。因此，保护皮肤屏障避免受损，减少过敏原对皮肤的刺激是目前化妆品研究的新领域。研究表明感觉神经功能异常是敏感性皮肤发病机制之一，由疼痛、瘙痒、热感以及化学性刺激激活皮肤神经纤维与角质形成细胞膜表面的辣椒素受体trpv1(transientreceptorpotentialvanilloid1)，引起钙离子内流增加，导致细胞凋亡，最终损伤皮肤屏障功能。同时，trpv1的激活会延缓损伤皮肤屏障的修复，通过给予外源性的trpv1拮抗剂则有效促进损伤屏障的修复，减少过敏性皮肤发病。由于敏感性肌肤发病机制复杂，目前皮肤科临床主要采用物理、药物以及抗过敏的化妆品进行治疗，但效果不明显，加之化妆品种类繁多，使用不当反而会加重过敏。因此，开发针对辣椒素受体trpv1的天然化妆品，对缓解由辣椒素受体trpv1引起的敏感性皮肤，具有重要作用。技术实现要素：有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种能够显著抑制trpv1表达的多糖组合物及其制备方法，使其可通过抑制trpv1表达达到预防或修复神经屏障的损伤，可用于抗过敏的化妆品或药物的制备中。一种能够显著抑制trpv1表达的多糖组合物，包括天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖和丹参多糖。其中，所述天山雪莲多糖浓度不高于0.4mg/ml，所述石斛多糖浓度不高于0.35mg/ml，所述银耳多糖浓度不高于0.2mg/ml，所述丹参多糖浓度不高于0.2mg/ml。天山雪莲作为药用植物，在民间习用已久，清代赵学敏所著《本草纲目拾遗》就有记载。天山雪莲具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民间用于治疗风湿性关节炎，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。含有丰富的蛋白质、氨基酸、黄酮类化合物、生物碱类化合物、苯丙素类化合物、多糖、挥发油等，可有效地调节人体酸碱度，可加速皮肤的新陈代谢，减少皱纹，使皮肤保持光泽、丰满。并且对面部雀斑、肝斑等有良好的疗效。银耳含有丰富的天然特性胶质，加上它的滋阴作用，长期服用可以润肤，并有祛除脸部黄褐斑、雀斑的功效。银耳多糖是一种植物源类透明质酸物质，是担子菌亚纲银耳的子实体和细胞发酵孢子中的主要活性成分。银耳多糖是由多种多糖组成的混合物。主要包括酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖和酸性低聚糖五种多糖。主链甘露聚糖是其活性中心，主链的2、4、6位上连接有葡萄糖、木糖、岩藻糖及半乳糖等残基组成的侧链。银耳多糖的分子量达到130万～175万。银耳多糖具有特殊的生物活性，如增强机体免疫力，同时具有保湿特性和稳定性，抗衰老、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射等多种生理功能。石斛具有“主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳赢瘦，强阴，久服厚肠胃，轻身延年”之功效。现代药理研究表明石斛具有增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤、保肝、抗疲劳等多种功能活性，石斛多糖作为石斛的重要功能活性物质，药理作用广泛，主要具有增强免疫力，抗氧化，抗肿瘤，降血糖等作用。丹参为唇形科(labiatae多年生草本植物丹参(salviamiltiorrhizabunge.)的干燥根和根茎。丹参所含化学药用成分主要分为4类，即脂溶性二萜醌类、水溶性酚酸类、挥发油类、多糖类。丹参多糖是丹参中除去脂溶性二萜成分和水溶性酚酸类成分外，一类不能忽视的成分，丹参多糖由半乳糖∶阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖∶核糖∶木糖∶鼠李糖以58.8∶15.3∶4.2∶12.7∶8.5∶1.0∶2.8的摩尔比例组成，具有延缓衰老、抗病毒、抗癌、增强免疫力、降血脂的作用。本发明的目的是充分发挥多糖的功效优势，提供一种安全有效且能预保护或者修复皮肤神经屏障的具有协同增效的多糖组合物。作为优选，所述天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖和丹参多糖的质量比(0.01-10)：(0.01-10)：(0.01-10)：(0.01-10)，更优选为(1-10)：(1-10)：(1-10)：(1-10)。在本发明具体实施方式中，所述天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖和丹参多糖的质量比为1:1:1:10、1:1:10:1、1:10:1:1、10:1:1:1或1:1:1:1。相对于各单糖以及其他多糖组合物，本发明多糖组合物能有效抑制trpv1通路的表达，从而预保护和修复皮肤神经屏障，可以用于预防和治疗皮肤过敏等问题。因此，本发明提出了所述多糖组合物在制备trpv1抑制剂中的应用，所述多糖组合物在制备预防或修复皮肤神经屏障损伤的化妆品或药物中的应用，以及所述多糖组合物在制备抗过敏的化妆品中的应用。所述化妆品可以是水剂、凝胶、洁面乳、面霜、乳液等多种剂型，具体配料或辅料参照化妆品领域各剂型的可选择用料使用。同时，本发明还提供了所述多糖组合物的制备方法，将天山雪莲，银耳，石斛和丹参分别脱色，然后分别用水提醇沉法提取各多糖，最后按比例混合各多糖获得多糖组合物。作为优选，所述制备方法将天山雪莲，银耳，石斛和丹参分别脱色，然后分别水煎一次或两次以上，合并每次水煎的滤液浓缩，加入乙醇醇沉，过滤收集沉淀获得各多糖，最后按比例混合各多糖获得多糖组合物。其中，所述脱色采用乙醇进行脱色。作为优选，所述乙醇与各原料药的体积比为1：1～10：1，脱色时间为4～10h；更优选为体积比为3：1～5：1，脱色时间为5～7h；在具体实施过程中，体积比为4：1，脱色时间为6h；在本发明具体实施方式中，本发明采用两次水煎，首次水煎按料液比1:5～1：30加入水，煮沸提取1～4h，第二次及以上水煎取滤渣加入5～20倍水，煮沸提取1～8h；更优选地，首次水煎按料液比1:12～1：18加入水，煮沸提取1.5～2.5h，第二次及以上水煎取滤渣加入8～12倍水，煮沸提取1.5～3h；在具体实施过程中，首次水煎按料液比1:15加入水，煮沸提取2h，第二次及以上水煎取滤渣加入10倍水，煮沸提取2h；作为优选，所述浓缩在40～90℃浓缩至适宜粘稠度(固含量为30％-50％)；所述乙醇醇沉为采用1-8倍的无水乙醇醇沉，优选采用4倍的无水乙醇醇沉。在本发明具体实施方式中，提取多糖后干燥至水分低于6％，粉碎待混合。由以上技术方案可知，本发明以天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖和丹参多糖作为活性成分，组成一种具有协同增效抑制trpv1通路的多糖组合物，其能够有效抑制trpv1通路的表达，从而预保护和修复皮肤神经屏障，可以用于预防和治疗皮肤过敏以相关化妆品和药物的制备中。附图说明图1所示为不同浓度的天山雪莲多糖、银耳多糖、石斛多糖、丹参多糖以及4-t叔基环己醇对bv2细胞活力的影响；图2所示为对比例1-13以及实施例1-5的单多糖/多糖组合物对辣椒素损伤的神经屏障的预保护作用；***表示与模型组相比p＜0.001；图3所示为对比例1-13以及实施例1-5的单多糖/多糖组合物对辣椒素损伤的神经屏障的修复作用；***表示与模型组相比p＜0.001。具体实施方式本发明公开了一种抑制trpv1通路的多糖组合物及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述多糖组合物及其制备方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的多糖组合物及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在具体实施方式中，本发明提供了所述多糖组合物的制备方法：取天山雪莲药材，粉碎至16目筛碎粉，加入料液比(g/ml)为1:5-1:10的无水乙醇浸泡6-24h后，弃去乙醇，收集药材滤渣，加入按料液比为1:5～1:30的水，煮沸提取1～2h，过300目滤布，收集滤液，备用；再加入按料液比为1:5～1:20的水，煮沸提取1～2h，过300目滤布，收集滤液；合并滤液，55～70℃浓缩至固含量为25-40％；加入按浓缩液的4倍量无水乙醇进行醇沉，过滤收集多糖，置于45～75℃烘箱中干燥至水分低于8％，粉碎过100目，得到天山雪莲多糖。取银耳，粉碎至40目筛碎粉，加入料液比(g/ml)为1:8-1:12的无水乙醇浸泡24-36h后，弃去乙醇，收集药材滤渣，加入按料液比为1:25～1:45的水，煮沸提取1.5～3.5h，过300目滤布，收集滤液，备用；再加入按料液比1:10～1:20的水，煮沸提取1～2h，过300目滤布，收集滤液；合并滤液，置于5000r/min离心10min，滤液在55～70℃浓缩至固含量为30-40％；加入按浓缩液的3-4倍量无水乙醇进行醇沉，过滤收集多糖，置于45～75℃烘箱中干燥至水分低于8％，粉碎过100目，得到银耳多糖。取石斛药材，粉碎至16目筛碎粉，加入料液比(g/ml)为1:8-1:10的无水乙醇浸泡12-24h后，弃去乙醇，收集药材滤渣，加入按料液比1:12～1:25的水，煮沸提取1.5～2.5h，过300目滤布，收集滤液，备用；再加入按料液比1:10～1:15的水，煮沸提取1～2h，过300目滤布，收集滤液；合并滤液，60～70℃浓缩至固含量为25-35％；加入按浓缩液的4倍量无水乙醇进行醇沉，过滤收集多糖，置于45～75℃烘箱中干燥至水分低于8％，粉碎过100目，得到石斛多糖。取丹参药材，粉碎至16目筛碎粉，加入料液比(g/ml)为1:5-1:8的无水乙醇浸泡6-12h后，弃去乙醇，收集药材滤渣，加入按料液比1:5～1:15的水，煮沸提取1～2h，过300目滤布，收集滤液，备用；再加入按料液比1:5～1:8的水，煮沸提取1～2h，过300目滤布，收集滤液；合并滤液，55～65℃浓缩至固含量为25-35％；加入按浓缩液的4倍量无水乙醇进行醇沉，过滤收集多糖，置于45～75℃烘箱中干燥至水分低于8％，粉碎过100目，得到丹参多糖。更优选地，制备方法如下：取天山雪莲药材，粉碎至16目筛碎粉，加入料液比(g/ml)为1:10的无水乙醇浸泡12h后，弃去乙醇，收集药材滤渣，加入按料液比为1:10的水，煮沸提取1.5h，过300目滤布，收集滤液，备用；再加入按料液比为1:8的水，煮沸提取1h，过300目滤布，收集滤液；合并滤液，60℃浓缩至固含量为30％；加入按浓缩液的4倍量无水乙醇进行醇沉，过滤收集多糖，置于65℃烘箱中干燥至水分低于8％，粉碎过100目，得到天山雪莲多糖。取银耳，粉碎至40目筛碎粉，加入料液比(g/ml)为1:12的无水乙醇浸泡24h后，弃去乙醇，收集药材滤渣，加入按料液比为1:35的水，煮沸提取2h，过300目滤布，收集滤液，备用；再加入按料液比1:15的水，煮沸提取1h，过300目滤布，收集滤液；合并滤液，置于5000r/min离心10min，滤液在60℃浓缩至固含量为30％；加入按浓缩液的4倍量无水乙醇进行醇沉，过滤收集多糖，置于65℃烘箱中干燥至水分低于8％，粉碎过100目，得到银耳多糖。取石斛药材，粉碎至16目筛碎粉，加入料液比(g/ml)为1:8的无水乙醇浸泡12h后，弃去乙醇，收集药材滤渣，加入按料液比1:25的水，煮沸提取1.5h，过300目滤布，收集滤液，备用；再加入按料液比1:10的水，煮沸提取1h，过300目滤布，收集滤液；合并滤液，60℃浓缩至固含量为30％；加入按浓缩液的4倍量无水乙醇进行醇沉，过滤收集多糖，置于65℃烘箱中干燥至水分低于8％，粉碎过100目，得到石斛多糖。取丹参药材，粉碎至16目筛碎粉，加入料液比(g/ml)为1:5的无水乙醇浸泡6h后，弃去乙醇，收集药材滤渣，加入按料液比1:10的水，煮沸提取2h，过300目滤布，收集滤液，备用；再加入按料液比1:8的水，煮沸提取1h，过300目滤布，收集滤液；合并滤液，60℃浓缩至固含量为25％；加入按浓缩液的4倍量无水乙醇进行醇沉，过滤收集多糖，置于55℃烘箱中干燥至水分低于8％，粉碎过100目，得到丹参多糖。在本发明对比试验中，本发明多糖组合物中，各多糖的浓度至少为0.0077mg/ml；优选为0.0077-0.077mg/ml，可具体选择为0.025mg/ml、0.0334mg/ml、0.05mg/ml。对比试验中，各组除应有的差别外，其余试验条件均保持一致，以保证可对比性。在本发明试验中，本发明使用小鼠神经小胶质细胞金星细胞学验证；小鼠神经小胶质细胞分离自脑组织；小胶质细胞是神经胶质细胞的一种，相当于脑和脊髓中的巨噬细胞，是中枢神经系统(cns)中的第一道也是最重要的一道免疫防线。小胶质细胞大约占大脑中的神经胶质细胞的20％，小胶质细胞不停地清除中枢神经系统中的损坏的神经，斑块及感染性物质。无数临床上的和神经病理学研究表面激活的小胶质细胞在神经退化类疾病的发病机理中起到十分重要的左右，如帕金森病，多发性硬化和阿兹海默症等；但是过多激活或失控的小胶质细胞会引起神经毒性。它们是促炎因子和氧化应激的重要来源，如肿瘤坏死因子(tnf)，一氧化氮，白介素等有神经毒性的物质。神经小胶质细胞的主要功能：1.神经胶质出现在大脑发育早期向成熟阶段转化的过程中；2.当程序性细胞死亡时，或在大脑发育的过程中，中枢神经系统受损或受到病理损坏时，神经胶质可作为大脑的巨噬细胞，3.胶质细胞能在ii类组织相容性复合体表达cd-4阳性t细胞时表达抗原，能进行fe介导的巨噬左右，并且与造血细胞和巨噬细胞组织共享抗原。以下就本发明所提供的一种抑制trpv1通路的多糖组合物及其制备方法和应用做进一步说明。实施例1-5：本发明多糖组合物实施例1取上述天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖，丹参多糖粉末各1g，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有天山雪莲多糖，银耳多糖，丹参多糖的水溶液。其中天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖，丹参多糖终浓度各为0.25mg/ml。实施例2取上述天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖各0.4g，丹参多糖4g，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有天山雪莲多糖，银耳多糖，丹参多糖的水溶液。其中天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖，丹参多糖终浓度各为0.0077mg/ml、0.0077mg/ml、0.0077mg/ml、0.077mg/ml。实施例3取上述天山雪莲多糖，银耳多糖，丹参多糖粉末各0.4g，石斛多糖4g,溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有天山雪莲多糖，银耳多糖，丹参多糖的水溶液。其中天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖，丹参多糖终浓度各为0.0077mg/ml、0.0077mg/ml、0.077mg/ml、0.0077mg/ml。实施例4取上述天山雪莲多糖，石斛多糖，丹参多糖粉末各0.4g，银耳多糖4g,溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有天山雪莲多糖，银耳多糖，丹参多糖的水溶液。其中天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖，丹参多糖终浓度各为0.0077mg/ml、0.077mg/ml、0.0077mg/ml、0.0077mg/ml。实施例5取上述银耳多糖，石斛多糖，丹参多糖粉末各0.4g，天山雪莲多糖4g，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有天山雪莲多糖，银耳多糖，丹参多糖的水溶液。其中银耳多糖，石斛多糖，丹参多糖浓度各为0.0077mg/ml、0.0077mg/ml、0.0077mg/ml，天山雪莲多糖为0.077mg/ml。对比例1-13：对照多糖和其组合物对比例1取上述天山雪莲多糖粉末10mg，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有天山雪莲多糖的水溶液。其中天山雪莲多糖浓度为0.1mg/ml。对比例2取上述银耳多糖粉末10mg，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有银耳多糖的水溶液。其中银耳多糖浓度为0.1mg/ml。对比例3取上述石斛多糖粉末10mg，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有石斛多糖的水溶液。其中石斛多糖浓度为0.1mg/ml。对比例4取上述丹参多糖粉末10mg，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有丹参多糖的水溶液。其中丹参多糖浓度为0.1mg/ml。对比例5取上述天山雪莲多糖，银耳多糖粉末各5mg，溶于蒸馏纯水中蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有天山雪莲多糖，银耳多糖的水溶液。其中天山雪莲多糖，银耳多糖浓度各为0.05mg/ml。对比例6取上述天山雪莲多糖，石斛多糖粉末各5mg，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有天山雪莲多糖，石斛多糖的水溶液。其中天山雪莲多糖，石斛多糖浓度各为0.05mg/ml。对比例7取上述天山雪莲多糖，丹参多糖粉末各5mg，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有天山雪莲多糖，丹参多糖的水溶液。其中天山雪莲多糖，丹参多糖浓度各为0.05mg/ml。对比例8取上述银耳多糖，石斛多糖粉末各5mg，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有银耳多糖，石斛多糖的水溶液。其中天山雪莲多糖，银耳多糖浓度各为0.05mg/ml。对比例9取上述银耳多糖，丹参多糖粉末各5mg，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有银耳多糖，丹参多糖的水溶液。其中银耳多糖，丹参多糖浓度各为0.05mg/ml。对比例10取上述石斛多糖，丹参多糖粉末各5mg，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有石斛多糖，丹参多糖的水溶液。其中石斛多糖，丹参多糖浓度各为0.05mg/ml。对比例11取上述天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖粉末各3.34mg，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖的水溶液。其中天山雪莲多糖，银耳多糖，石斛多糖浓度各为0.0334mg/ml。对比例12取上述天山雪莲多糖，银耳多糖，丹参多糖粉末各3.34mg，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有天山雪莲多糖，银耳多糖，丹参多糖的水溶液。其中天山雪莲多糖，银耳多糖，丹参多糖浓度各为0.0334mg/ml。对比例13取上述银耳多糖，石斛多糖，丹参多糖粉末各3.34mg，溶于蒸馏纯水中，充分搅拌溶解后，即得含有天山雪莲多糖，银耳多糖，丹参多糖的水溶液。其中银耳多糖，石斛多糖，丹参多糖浓度各为0.0334mg/ml。实施例6：mtt比色测定评价细胞毒性材料和方法bv2：小鼠神经小胶质细胞；在补充有10％胎牛血清和10μl/ml的链霉素/青霉素的dmem培养基中培养bv2细胞。培养维持在37℃下、5％co2的培养箱中，每2-3天更换培养基。然后将bv2细胞接种于96孔板上，培养24h后，根据表1的药物浓度，将药物和阳性对照，4-叔基丁基环己醇加入96孔板中，处理细胞24h。每组重复三次。表1类别药物浓度ts天山雪莲多糖0.1～1.0mg/mlt银耳多糖0.1～1.0mg/mld石斛多糖0.1～1.0mg/mls丹参多糖0.1～1.0mg/mlb4-叔基丁基环己醇60～480um结果见图1，不同浓度的天山雪莲多糖，石斛多糖，银耳多糖丹参多糖对bv2细胞活力影响，低浓度的天山雪莲多糖，石斛多糖，银耳多糖，丹参多糖对细胞无毒性，而高浓度的天山雪莲多糖，石斛多糖，银耳多糖，丹参多糖降低了细胞活性，对细胞有毒性作用。在实验中，一般认为细胞活力相比较对照组不低于20％就认为是没有毒性的，所以相对于bv2细胞，天山雪莲多糖细胞的临界毒性浓度是0.4mg/ml，石斛多糖细胞的临界毒性浓度是0.35mg/ml，银耳多糖细胞的临界毒性浓度是0.2mg/ml，丹参多糖细胞的临界毒性浓度是0.2mg/ml所以，天山雪莲多糖，石斛多糖，银耳多糖，丹参多糖作用于bv2细胞的安全浓度是0-0.4mg/ml，0-0.350mg/ml，0-0.20mg/ml，0-0.20mg/ml。实施例7：对bv2细胞的细胞内trpv1测定材料和方法bv2：小鼠神经小胶质细胞10％胎牛血清和10μl/ml的链霉素/青霉素的dmem培养基中培养了bv2细胞。培养维持在37℃下、5％co2的培养箱中，每2-3天更换培养基。_多糖损伤修复实验：将bv2细胞每孔5*104接种接种于6孔板上，培养24h后，然后每孔加入10umcapsaicin24h，一组做空白对照，30min后，根据表2的药物浓度，处理细胞24h，用240um4-t叔丁基环己醇做阳性对照，同样作用24h，收集细胞，用trpv1的elisa试剂盒定量测试trpv1的表达量通过活细胞免疫荧光特异性标记trpv1抗体，fitc染色，进一步定性确定细胞内trpv1的表达情况。多糖预保护实验：将bv2细胞每孔5*104接种接种于6孔板上，培养24h后，根据表2的药物浓度，处理细胞24h，用240um4-t叔丁基环己醇做阳性对照，然后每孔加入10umcapsaicin24h，一组做空白对照，30min后，去掉辣椒素，用pbs清洗3遍，37℃培养箱孵育24h，收集细胞，用trpv1的elisa试剂盒定量测试trpv1的表达量。通过活细胞免疫荧光特异性标记trpv1抗体，fitc染色，进一步定性确定细胞内trpv1的表达情况。表2图2的预保护试验结果显示，相比较模型组，各组trpv1的表达情况都有明显下降，本发明各多糖组合物整体较好，其中实施例1调控trpv1的表达量相比较其他各处理组最低也最为明显，接近阳性对照组的效果。同时在图3的修复试验中，通过活细胞免疫荧光特异性标记trpv1抗体进行fitc染色，相比较模型组，各组trpv1特异性表达都有明显下降，本发明各多糖组合物整体较好，其中实施例1调控trpv1的表达量相比较其他各处理组最低也最为明显，优于阳性对照组效果。在各组多糖总浓度基本一致的前提下，上述两方面实验结果证明了各多糖之间有相互促进的关系，这一点在实施例1多糖组合物中表现的尤为明显，这表明从预保护和修复两个方面，本发明多糖组合物都能够实现预期目的。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12