一种用于瘦素免疫调节的口服重组酵母菌株的制作方法

[0001]
本发明属于免疫学和蛋白调节技术领域，涉及一种口服重组酵母菌株及其靶向肠道dc递送ob基因dna的应用。


背景技术：

[0002]
肥胖基因又称ob基因，ob基因的表达产物称为瘦素(leptin)，主要由脂肪组织合成和分泌，瘦素(leptin)的主要功能：控制能量代谢、抑制食欲、调节机体的免疫系统、骨的形成、肝脏组织代谢、调节生殖能力。
[0003]
最初基于瘦素的肥胖症药物疗法是根据脂平衡观点开发的，即血液中循环瘦素水平的升高促进负能量平衡。最近一系列独立的临床研究结果表明，循环瘦素水平的部分降低(通过外周限制性cb1受体反向激动剂或减肥手术)可能导致体重下降。通过基因突变或药物受体拮抗剂降低或消除瘦素受体活性可导致小鼠严重肥胖。通过瘦素中和抗体减少部分瘦素，可降低socs3的表达。此外，ptp1b对瘦素和胰岛素信号通路均有抑制作用，促进肥胖和2型糖尿病的发生。因此，在肥胖的情况下，瘦素作用受损的主要原因可能不是瘦素信号本身的缺陷，而是瘦素信号的结构性激活诱导的有效反馈机制，它也反馈胰岛素信号。部分减少瘦素在arh中的作用改善了瘦素信号的反馈机制，恢复了瘦素和胰岛素的敏感性。在低瘦素水平动物中，血液中循环瘦素水平降低，会产生体重增加、采食量增加的现象。
[0004]
树突状细胞(dendritic cells,dcs)是机体内功能最强的抗原呈递细胞(antigen presenting cells,apc)，能够高效地摄取、加工处理和呈递抗原，处于调控和维持免疫应答的中心环节。酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)在制药(疫苗)、畜牧(饲料添加剂)以及食品制造中广泛使用，是国际上公认的可以食用的对机体无害的安全菌。和细菌相比，酿酒酵母可以有效的抵抗抗生素作用，同时还可以高效的存活于活体动物的胃肠道环境而不被降解，可用于进行大规模、低成本的口服疫苗生产。
[0005]
中国专利201310647359.3公开了“一种口服重组酵母及其介导的靶向肠道dc呈递shrna的应用”，其通过基因工程酵母向活体动物肠道树突状细胞靶向递送shrna干扰载体，利用干扰rna调节树突状细胞中目的基因的表达，通过降低树突状细胞cd40蛋白表达，可用于治疗自身免疫病等疾病。但目前，尚未见到通过口服重组酵母，实现肠道dc呈递瘦素相关抗原，并通过体液免疫调节瘦素蛋白水平的报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种用于瘦素免疫调节的口服重组酵母菌株，实现对机体高瘦素导致的瘦素不敏感的肥胖的治疗。
[0007]
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0008]
一种口服重组酵母菌株，以酵母菌株作为宿主细胞，宿主细胞中转染有ob基因重组表达载体。
[0009]
优选的，所述重组表达载体选自jmb84-cmv-ob载体或jmb84-cmv-ova-ob载体，
jmb84-cmv-ob载体包括ob基因表达盒(具有cmv启动子-ob基因序列-polya的元件排列)；jmb84-cmv-ova-ob载体包括ova基因与ob基因的串联表达盒(具有cmv启动子-ova基因序列-ob基因序列-polya的元件排列)，cmv启动子使重组表达载体能够在哺乳动物细胞中表达出相应的蛋白，但在酵母菌中不表达，鸡卵清白蛋白(ova)用于增强重组表达载体在哺乳动物细胞中表达蛋白的免疫原性。
[0010]
优选的，所述重组表达载体是通过酶切连接将ob基因序列克隆到载体jmb84-cmv-ompg(参见seq.id.no.3)或jmb84-cmv-ova-ompg(参见seq.id.no.4)上，并替换ompg(细菌外膜蛋白g)基因序列而得到的。
[0011]
优选的，所述ob基因序列选自序列ob-1或序列ob-2，ob-1、ob-2是采用不同引物扩增的含有ob基因cds的dna片段，ob-1的核苷酸序列如seq.id.no.1所示，ob-2的核苷酸序列如seq.id.no.2所示。
[0012]
优选的，所述宿主细胞为酿酒酵母。
[0013]
优选的，所述重组表达载体通过liac的方法转染到宿主细胞中。
[0014]
上述口服重组酵母菌株在制备靶向肠道树突状细胞递送ob基因dna的免疫制剂中的应用或者在制备用于治疗肥胖症(高脂血症状态)的药物中的应用。
[0015]
优选，所述免疫制剂选自dna疫苗、用于增强体液免疫的佐剂或用于促进树突状细胞成熟的佐剂。
[0016]
优选的，所述口服重组酵母菌株通过向哺乳动物肠道树突状细胞靶向递送ob基因重组表达载体，在树突状细胞中表达出相应的重组瘦素蛋白，重组瘦素蛋白通过树突状细胞呈递，使黏膜免疫系统产生瘦素抗体，并通过免疫反应降低血液中的瘦素(循环瘦素)水平，从而调节哺乳动物的食量及体重，及调节肝脏中脂滴的沉积。
[0017]
本发明的有益效果体现在：
[0018]
本发明提供的口服重组酵母能够穿过活体生物的胃肠道环境，靶向肠道dc细胞递送ob基因dna(具体通过jmb84-cmv-ob、jmb84-cmv-ova-ob这两个载体递送)，从而通过黏膜免疫系统产生瘦素抗体，降低血液中的瘦素水平，对于高瘦素情况的肥胖，可以有效的恢复机体瘦素敏感性及瘦素的正常功能，降低总胆固醇和甘油三酯，以及减少体重的增加，抑制食欲、降低食量，降低肝脏中脂滴的沉积。
[0019]
本发明提供的口服重组酵母可以应用在缓解和治疗肥胖症的高脂血症状态(通过降低瘦素水平，提高瘦素敏感性，消除瘦素抵抗)，在应用中无需体外生产中性瘦素抗体(中性瘦素抗体制备、纯化方法复杂，通过注射治疗肥胖)，通过口服饲喂就能到达到明确的治疗效果，为肥胖症的高脂血症状态治疗提供新的途径。
[0020]
进一步的，酿酒酵母作为一种常用的安全模式生物，对生物体没有副作用，因此作为药物传递载体是可行的。
附图说明
[0021]
图1为ob基因pcr扩增产物的电泳图；其中，(a)ob-1扩增产物，(b)ob-2扩增产物(泳道1～8分别为扩增结果的八个重复)，m表示marker。
[0022]
图2为bamhi/xhoi酶切鉴定jmb84-cmv-ob载体的电泳图；其中，m表示marker。
[0023]
图3为jmb84-cmv-ob载体图谱；其中，leptin-f1和leptin-r1指的是ob基因cds(ob
基因表达出的相应蛋白叫瘦素，即leptin)的上游引物ob-f1和下游引物ob-r1。
[0024]
图4为nhei/xhoi酶切鉴定jmb84-cmv-ova-ob载体的电泳图；其中，m表示marker，泳道1、2分别为酶切鉴定jmb84-cmv-ova-ob载体的两个重复。
[0025]
图5为jmb84-cmv-ova-ob载体图谱；其中，leptin-f1和leptin-r1指的是ob基因cds(ob基因表达出的相应蛋白叫瘦素，即leptin)的上游引物ob-f2和下游引物ob-r1。
[0026]
图6为预实验组wb及elisa检测瘦素抗体(a)、抗体效价比较(b)和瘦素水平调节(c)的结果。
[0027]
图7为高脂组的测定结果。
[0028]
图8为高脂-正常组的测定结果。
具体实施方式
[0029]
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。
[0030]
一、jmb84-cmv-ob载体的构建
[0031]
1、以小鼠基因组cdna序列为模板(genbank:adm72802.1)，利用snapgene软件进行引物设计，设计能够特异扩增ob基因序列(cds)的引物ob-f1和ob-r1，并在上游引物ob-f1中引入bamhi酶切位点，下游引物ob-r1中引入xhoi酶切位点。引物序列如表1-1所示。
[0032]
表1-1.ob基因pcr扩增引物
[0033]
引物名称引物序列(5`-3`)ob-f1cgggatccatgtgctggagacccctgtob-r1ccgctcgagtcagcattcagggctaacat
[0034]
注：ob-f1的序列中下划线部分为bamhi酶切位点；ob-r1的序列中下划线部分为xhoi酶切位点。
[0035]
2、以小鼠基因组cdna为模板(模板是通过采集脂肪组织、提取rna、反转录而获得，小鼠2019年4月购买自西安交通大学实验动物中心，反转录试剂盒primescript rt reagent kit with gdna eraser购买于takara公司)，ob-f1和ob-r1为引物，pcr扩增小鼠ob基因片段ob-1，pcr反应体系如表1-2所示，反应条件为(pcr常用的三步法程序)：98℃预变性5min，35个循环(98℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸50s)，72℃延伸10min，10℃保存。taq dna聚合酶的延伸速度为1kb/min，pcr扩增结果如图1a所示，ob基因片段ob-1的dna序列如seq.id.no.1所示。
[0036]
表1-2.ob基因pcr扩增体系
[0037]
组分体积小鼠基因组cdna1μlob-f10.5μlob-r10.5μl10
×
taq buffer5μl2.5mmol/l dntps4μltaq dna聚合酶1μlh2o38μl
[0038]
3、将ob基因克隆到jmb84-cmv-ova-ompg载体载体中，具体步骤如下。
[0039]
用bamhi/xhoi分别双酶切ob基因pcr产物(ob-1)和jmb84-cmv-ompg载体(该载体的核苷酸序列如seq.id.no.3所示，其包括目的基因表达元件cmv、polya，酵母质粒筛选标记元件micro、ura3，以及细菌质粒筛选标记元件amp)，酶切体系如表1-3所示。胶回收目的片段和jmb84-cmv-ompg载体骨架(指通过双酶切切除了细菌外膜蛋白g基因序列ompg后剩余的部分)后16℃连接过夜，连接体系如表1-4所示。转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂lb/amp平板，挑取单克隆并在lb/amp液体培养基中37℃培养8h。提取质粒后经bamhi/xhoi双酶切鉴定(阳性质粒鉴定结果如图2所示)。将阳性质粒送到北京奥科生物有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒(质粒图谱如图3所示)，即jmb84-cmv-ob载体，备用。
[0040]
表1-3.ob基因pcr产物和jmb84-cmv-ompg载体banhi/xhoi双酶切反应体系
[0041]
组分体积组分体积ob-125μljmb84-cmv-ompg载体5μlbamhi1μlbamhi1μlxhoi1μlxhoi1μl10
×
takara buffer3μl10
×
takara buffer3μl
ꢀꢀ
h2o20μl
[0042]
表1-4.jmb84-cmv-ompg载体骨架和ob-1连接反应体系
[0043]
组分体积jmb84-cmv-ompg载体骨架3μlob-15.76μlt4 dna ligase0.2μl10
×
ligase buffer1μlh2o0.04μl
[0044]
二、jmb84-cmv-ova-ob载体的构建
[0045]
1、以小鼠基因组cdna序列为模板(genbank:adm72802.1)，利用snapgene软件进行引物设计，设计能够特异扩增ob基因序列(cds)的引物ob-f2和ob-r1，并在上游引物ob-f2中引入nhei酶切位点，下游引物ob-r1中引入xhoi酶切位点。引物序列如表2-1所示。
[0046]
表2-1.ob基因pcr扩增引物
[0047]
引物名称引物序列(5`-3`)ob-f2ctagctagcatgtgctggagacccctgtob-r1ccgctcgagtcagcattcagggctaacat
[0048]
注：ob-f2的序列中下划线部分为nhei酶切位点；ob-r1的序列中下划线部分为xhoi酶切位点。
[0049]
2、以小鼠基因组cdna为模板(模板是通过采集脂肪组织、提取rna、反转录而获得，小鼠2019年4月购买自西安交通大学实验动物中心，反转录试剂盒primescript rt reagent kit with gdna eraser购买于takara公司)，ob-f2和ob-r1为引物，pcr扩增小鼠ob基因片段ob-2，pcr反应体系如表2-2所示，反应条件为(pcr常用的三步法程序)：98℃预变性5min，35个循环(98℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸50s)，72℃延伸10min，10℃保
存。taq dna聚合酶的延伸速度为1kb/min。pcr扩增结果如图1b所示。ob基因片段ob-2的dna序列如seq.id.no.2所示。
[0050]
表2-2.ob基因pcr扩增体系
[0051]
组分体积小鼠基因组cdna1μlob-f20.5μlob-r10.5μl10
×
taq buffer5μl2.5mmol/l dntps4μltaq dna聚合酶1μlh2o38μl
[0052]
3、将ob基因克隆到jmb84-cmv-ova-ompg载体中，具体步骤如下。
[0053]
通过nhei/xhoi分别双酶切ob基因pcr产物(ob-2)和jmb84-cmv-ova-ompg载体(该载体的核苷酸序列如seq.id.no.4所示，其包括目的基因表达元件cmv、poly a，与目的基因串联表达的ova基因序列，酵母质粒筛选标记元件micro、ura3，以及细菌质粒筛选标记元件amp)，酶切体系如表2-3所示，胶回收目的片段和jmb84-cmv-ova-ompg载体骨架(指通过双酶切切除了ompg后剩余的部分)后16℃连接过夜，连接体系如表2-4所示。转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂lb/amp平板，挑取单克隆并在lb/amp液体培养基中37℃培养8h。提取质粒后经nhei和xhoi双酶切鉴定(阳性质粒鉴定结果如图4所示)。将阳性质粒送到北京奥科生物公司进行测序分析，保存测序正确的质粒(质粒图谱如图5所示)，即jmb84-cmv-ova-ob载体，备用。
[0054]
表2-3.ob基因pcr产物和jmb84-cmv-ova-ompg载体nhei/xhoi双酶切反应体系
[0055][0056][0057]
表2-4.ob-2和jmb84-cmv-ova-ompg载体骨架连接反应体系
[0058]
组分体积jmb84-cmv-ova-ompg载体骨架2μlob-22μlt4 dna ligase0.2μl10
×
ligase buffer1μlh2o4.8μl
[0059]
通过与leptin蛋白融合表达鸡卵清白蛋白(ova)，ova蛋白可以有效地提高ob基因dna质粒表达的leptin蛋白的免疫原性，jmb84-cmv-ova-ob载体为增强免疫原性的ob基因dna质粒。
[0060]
三、小鼠饲养实验
[0061]
1、构建重组酵母
[0062]
将测序正确的ob基因dna质粒(jmb84-cmv-ob载体、jmb84-cmv-ova-ob载体)和空载体(jmb84，参见中国专利201310647359.3)通过liac的方法(gietz and woods)分别转化酿酒酵母菌株jmy31[matα,his3
-△
1trp1-289rad1
-△
ura3-52]，具体步骤如下。
[0063]
将上述菌株jmy31单克隆接种于3ml ypd液体培养基，30℃、250rpm过夜摇菌；第二天按1:50接种至ypd液体培养基，30℃、250rpm摇菌至od＝0.6左右；3000g离心5min收集菌体，用等体积灭菌水重悬清洗两次，加入900μl水和100μl 1m li ac，颠倒混匀后30℃放置5min，离心收集菌体；用50μl质粒溶液(质粒质量约为1μg)轻轻重悬菌体后加入36μl 1m liac和25μl 94℃变性处理10min后冰上放置的ssdna(鱼精载体dna)，混匀后加入240μl 50％的peg6000，适当涡旋混匀；42℃热击(42℃水浴锅)45min，离心收集菌体，用1ml ypd液体培养基于30℃、200rpm下孵育1-2h；离心收集菌体，均匀涂在sd固体培养基上，培养4天(30℃)左右。
[0064]
对生长于sd固体培养基中的阳性克隆进行鉴定，即提取酵母中的质粒，酶切鉴定检测酵母克隆中是否含有相应ob基因dna质粒(jmb84-cmv-ob载体或jmb84-cmv-ova-ob载体)或空载体。将鉴定出的阳性克隆(即重组酵母)接种到1l的ypd液体培养基中，30℃、250rpm摇菌，待od600＝1.0后收集菌体，并用无菌pbs液体重悬洗涤2次，加入适量pbs重悬重组酵母并计数，保存于-20℃备用。
[0065]
2、小鼠饲喂重组酵母
[0066]
参见表3-1，根据饲喂酵母的要求分组：将pbs作为空白对照组(pbs组)；将转入了空载体的酿酒酵母jmy31作为实验对照组(jmb84组)；而将转入了jmb84-cmv-ob载体、jmb84-cmv-ova-ob载体的酿酒酵母jmy31分别作为实验组(jmb84-cmv-ob组、jmb84-cmv-ova-ob组)。两个实验组的重组酵母的区别在于jmb84-cmv-ova-ob载体融合了ova基因序列(cds)，在重组酵母表达抗原蛋白产生抗体的过程中，增加leptin的免疫原性，增强产生的抗体的免疫效果。
[0067]
表3-1.动物饲喂酵母分组
[0068][0069]
参见表3-2，将5周龄雌性昆明小鼠(购于西安交通大学动物实验中心)，选择性的根据实验目的动物饮食诱导分成三个组：预实验组、高脂组及高脂-正常组。
[0070]
预实验组(60d)：正常维持饲料饲喂60d，同时饲喂重组酵母，验证饲喂重组酵母效
果，即是否能够产生瘦素抗体，及降低瘦素水平。分成4组(参见表3-1)，每组6只(n＝6)，每3只1笼，每组2笼，共24只(n＝24)。
[0071]
高脂组(60d+60d)：高脂饲料(协同生物xthf45，45％脂肪)饲喂60d，获得高脂诱导小鼠。后面60天高脂饲料饲喂同时饲喂重组酵母，观测饲喂重组酵母效果，即对高脂饲喂导致的肥胖小鼠，是否能够在饲喂重组酵母之后减轻体重、抑制采食，及降低瘦素水平。分成4组(参见表3-1)，每组6只(n＝6)，每3只1笼，每组2笼，共24只(n＝24)。
[0072]
高脂(60d)-正常组(60d)：高脂饲料饲喂60d，获得高脂诱导小鼠，对高脂诱导小鼠正常维持饲料饲喂60d同时饲喂重组酵母，通过与高脂组饲喂重组酵母的效果进行对比，观测由于饲料的改变对体重的影响，验证重组酵母的作用。分成4组(参见表3-1)，每组6只(n＝6)，每3只1笼，每组2笼，共24只(n＝24)。
[0073]
表3-2.动物饲养实验分组
[0074][0075]
在饲喂重组酵母的0d、30d及60d采集血液，将采集的血液于4℃冰箱静置2h，4℃(3500g)离心10min。然后将分离的血清样品小容量分装，于-80℃保存直至分析使用。实验动物在进行酵母饲喂前采血检测血液指标：甘油三酯、总胆固醇以及血清中leptin含量。
[0076]
酵母饲喂实验结束，采集小鼠的肝脏组织，用冰冷的pbs清洗肝脏组织，将肝脏组织切成小块，置于4％中性甲醛固定液中。部分样品(指切成小块的肝脏组织)立即在液氮中冷冻，于-80℃保存直至分析使用。
[0077]
四、瘦素抗体检测及抗体效价的比较
[0078]
1、western blot检测瘦素抗体
[0079]
对饲喂重组酵母60d的小鼠(重组酵母产生的抗体的效果最好)，尾部取血，分离血清，以小鼠血清作为一抗进行蛋白免疫印迹(wb)检测。通过wb实验检测血液中是否存在结合重组leptin蛋白的抗体，以及饲喂重组酵母实验组和对照组之间免疫反应结果的差别。利用重组leptin蛋白作为抗原检测小鼠血液中的瘦素抗体的详细操作步骤如下。
[0080]
1)sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)
[0081]
重组leptin蛋白(原核表达系统表达、纯化得到)带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中向正极泳动。
[0082]
测定出蛋白的浓度，然后加入sds-page缓冲液稀释到一定的浓度，煮沸10min。12000rpm离心5min去除细胞碎片，得上样样品。配制上层浓缩胶浓度为5％、下层分离胶浓度为10％的sds-page凝胶，每孔上样量为20μl，选用恒定电压80v，通电40min左右，观察溴酚蓝条带到达浓缩胶和分离胶的界限；转到恒定电压120v，通电60min左右，直到溴酚蓝条
带完全移动出分离胶，电泳结束。
[0083]
2)蛋白转移
[0084]
用甲醇浸泡pvdf膜(millipore，usa)30min，即用甲醇激活pvdf膜上的正电基团，然后将凝胶中带负电的重组leptin蛋白采用湿转法转移至pvdf膜上，进行蛋白转移的具体条件为：恒定电压120v，通电60min，目的蛋白大约为36.3kda(上述重组蛋白经snapgene软件预测)，用冰浴降低蛋白转移产生的热量。
[0085]
3)体外的抗原抗体结合
[0086]
将转膜后含有重组leptin蛋白条带的pvdf膜(相当于包被了抗原的固相载体)用5％脱脂奶粉室温封闭1h，将pvdf膜上未与蛋白结合的孔填充，然后洗去未填充到pvdf膜上的蛋白。接着加入小鼠血清:脱脂奶粉(1:50)，室温下于摇床孵育1h，然后于4℃过夜孵育(结合血清中的特异性抗体)。使用tbst缓冲液洗涤6次，每次5min，除去未结合的抗体。室温下与hrp-羊抗鼠二抗(碧云天生物技术公司)孵育1h，再使用tbst缓冲液洗涤6次，每次5min，除去未结合的二抗。再加入ecl发光显色液形成不溶性化学发光底物，从而使结合二抗的蛋白发光。使用leica dm2500m曝光仪显像、拍照、鉴定结果。
[0087]
2、elisa检测瘦素抗体效价
[0088]
用酶联免疫吸附试验对不同重组酵母产生的抗体进行效价检测和比较，详细操作步骤如下。
[0089]
用pbs缓冲液洗涤酶标板3次，将重组leptin蛋白用包被液(coating buffer)稀释到一定浓度，吸取100μl重组leptin蛋白到酶标板上，4℃过夜包被蛋白。使用300μl pbs缓冲液洗涤酶标板3次，使用200μl 5％脱脂奶粉对酶标板进行封闭(4℃过夜封闭)。使用300μl pbs缓冲液洗涤酶标板3次，用100μl不同稀释浓度(1:20；1:40；1:80；1:160；1:320；1:640；1:1280)的小鼠血清作为抗体结合重组leptin蛋白，4℃过夜孵育结合。使用300μl pbs缓冲液洗涤酶标板3次，用100μl的hrp-羊抗鼠二抗室温孵育2h。然后，用300μl pbs缓冲液洗涤酶标板3次，加入100μl tmb底物显色液，室温避光反应10-30min，加入100μl反应终止液。于450nm读取吸光度值。所有实验均做复孔。
[0090]
五、瘦素、甘油三酯及总胆固醇检测
[0091]
检测血清中的瘦素是为了验证饲喂重组酵母产生相应的抗体是否可以与血液中的瘦素发生免疫结合，并降低瘦素水平。对于血清中的瘦素的检测采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附实验。
[0092]
实验前30min将leptin mouse elisa试剂盒放于室温回温，保证试剂的准确性，如有结晶析出，需待结晶完全溶解。
[0093]
实验过程如下：首先，用300μl洗涤液清洗酶标板上结合的小鼠瘦素单克隆抗体3次，并甩干。按照需求用稀释液梯度稀释(8000、4000、2000、1000、500、250、125、0pg/ml)标准品蛋白(瘦素)，并将100μl梯度稀释(8000、4000、2000、1000、500、250、125、0pg/ml)的标准品蛋白和预稀释的血清样本加到酶标板中(第一次实验的血清需要稀释，找到合适的稀释比例，使检测范围在标准曲线内)，标准品蛋白和血清样本中的小鼠瘦素会与酶标板上的包被抗体发生特异性结合，封板膜封板，37℃培养箱孵育90min。加入100μl生物素化小鼠瘦素抗体，该抗体会与酶标板上固相包被抗体捕获的标准品蛋白和血清样本中的小鼠瘦素发生特异性结合，封板膜封板，37℃培养箱孵育60min。用300μl洗涤液清洗酶标板4次，并甩
干，加入100μl辣根过氧化物酶(hrp)标记的链霉亲和素，生物素化小鼠瘦素抗体与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合，封板膜封板，37℃培养箱孵育30min。用300μl洗涤液清洗酶标板4次，并甩干，加入100μl tmb底物显色剂，封板膜封板，37℃培养箱孵育避光显色15min。最后，加入50μl反应终止液，5min之内在波长450nm处测定反应孔中吸光度值(od)。以标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，根据绘制的标准曲线可计算出血清样本中的瘦素浓度。
[0094]
总胆固醇(total cholesterol)是机体血液内所有胆固醇之和，与机体的心脑血管疾病联系紧密，肝脏组织是合成胆固醇的主要场所。甘油三酯(triglyceride)是人体内含量最多的脂质，可以在肝脏中合成，在脂肪组织中储存。瘦素能够促进肝脏甘油三酸酯输出和减少脂肪生成，从而保护肝脏的脂肪变性(hackl et al.2019)。总胆固醇和甘油三酯能较好地反映机体瘦素的调控情况，检测过程如下。
[0095]
参见表3-3，将血清直接与试剂盒工作液混匀，置于96孔板中37℃孵育10min，利用酶标仪于波长510nm测定各孔的吸光度值。
[0096]
表3-3.总胆固醇和甘油三脂检测体系
[0097][0098]
注：总胆固醇和甘油三脂的检测体系的区别主要是工作液不同
[0099]
血清样本总胆固醇的计算公式：
[0100][0101]
血清样本甘油三酯的计算公式：
[0102][0103]
六、组织学分析
[0104]
对采集的肝脏组织进行组织石蜡切片观察分析。详细的步骤如下。
[0105]
载玻片的预处理：载玻片浸泡酸缸24h，流水冲洗干净，浸泡到无水乙醇中。载玻片粘附处理之前，取出过4-5遍ddh2o，晾干备用。用apes(3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)与丙酮按1:50体积比配制粘片剂。把要处理的载玻片放进粘片剂中浸泡45s，拿出片刻后放进纯丙酮中浸泡60s，拿出后放进另一纯丙酮中浸泡60s，拿出来晾干。
[0106]
固定：将肝脏组织切成小块，浸泡于4％中性甲醛固定液中6h，固定液的体积应为组织样品的20倍。
[0107]
洗涤：为了避免固定影响肝脏组织后续染色的效果，需要通过流水洗涤去除残存于组织中的固定液及其结晶沉淀，一般时间为3h。
[0108]
脱水：流水洗涤后采用浓度由低到高的梯度酒精脱掉组织中的水分，具体按以下顺序和时间进行。
[0109]
75％酒精2次/每次1h；85％酒精2次/每次1h；95％酒精2次/每次1h；当室内温度高于30℃时，100％酒精2次/每次40min；当室内温度低于10℃时，100％酒精2次/每次1h。
[0110]
透明：先置于二甲苯和无水乙醇等比例混合液中20min，再置于二甲苯中2次/每次15min。
[0111]
浸蜡：先将透明后的肝脏组织放在融化的石蜡和二甲苯的等比例混合液中浸泡2h，再移入另一融化的石蜡中浸泡2h，浸蜡应在高于石蜡熔点63℃的烘箱中进行，有利于石蜡浸入组织并取代有机溶剂二甲苯对组织起支撑作用。
[0112]
包埋：浸蜡后的肝脏组织放于装有蜡液的折叠纸盒容器中，如果组织切片有方向角度需求，要摆好在蜡中的位置，便于组合切片，待蜡液表层凝固即迅速放入4℃冷却保存，做成含有组织块的蜡块，并对不同组织蜡块进行标记编号。
[0113]
切片：将包埋好的蜡块修成方形，夹在轮转式切片机(leica)的蜡块钳内，旋紧固定。肝脏组织的切片厚度为8μm，一片接一片的切成连续蜡带。
[0114]
展片与烤片：将连续蜡带置于42℃水浴锅中展开，捞出石蜡切片，置于载玻片上并用滤纸将载玻片上的多余水分吸干，将带有石蜡切片的载玻片放入60℃烘箱中干燥1h。
[0115]
切片脱蜡及脱水：染色之前需要用二甲苯将干燥的石蜡切片脱去石蜡，二甲苯i 5-10min、二甲苯ii 5-10min(i、ii为相同的溶剂，但是不同的试剂瓶)。再用不同梯度酒精脱水，无水酒精i 2-5min、无水酒精ii 2-5min、95％酒精i 2-5min、95％酒精ii 2-5min、80％酒精2-5min、70％酒精2-5min、50％酒精2-5min、蒸馏水2min。
[0116]
染色：经典的苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色法是组织检验的常规染色，简称he染色。细胞中的细胞核是由酸性物质组成，它与碱性染料苏木素的亲和力较强，所以细胞核被苏木素染成鲜明的蓝紫色。而细胞质则含有碱性物质，和酸性染料伊红的亲和力较好，所以细胞质染成红色。经苏木素-伊红染色液染色后，组织的不同结构呈现出不同的颜色以便于观察，具体染色步骤如下。
[0117]
苏木精染色5-15min，自来水洗2min至不再变色，蒸馏水浸泡2min、1％盐酸酒精浸泡3s、45℃自来水蓝化5min，自来水中出现蓝色，去掉未与细胞核结合的苏木精染料。蒸馏水浸泡2min、50％酒精浸泡2-5min、70％酒精浸泡2-5min、80％酒精浸泡2-5min、伊红染色45s。
[0118]
切片脱水、透明和封片：95％酒精i 2-5min、95％酒精ii 2-5min、无水酒精i 2-5min、无水酒精ii 2-5min。彻底脱水后，进行二甲苯透明去除载玻片上多余的液体(二甲苯i 5min、二甲苯ii 5-10min)。晾干后，适当滴加中性树脂，盖上盖玻片，并注意避免中间气泡的产生，制成永久保存的组织切片，进行拍照鉴定。
[0119]
七、实验结果分析
[0120]
参见图6，预实验组的wb和elisa实验结果说明饲喂重组酵母之后能够产生相应的瘦素抗体。含jmb84-cmv-ova-ob的重组酵母能够增强leptin的免疫原性、增强免疫反应的效果，产生抗体的效果优于含jmb84-cmv-ob的重组酵母。检测血清中瘦素水平，发现含ob基因dna质粒的重组酵母可以使得血液中的瘦素水平降低，而且含jmb84-cmv-ova-ob的重组酵母降低瘦素水平效果是较好的。
[0121]
参见图7，在高脂组中对经饲喂重组酵母免疫产生的瘦素抗体进行定性和定量的检测，以及对瘦素抗体降低血液中的瘦素水平进行了检测，结果实验组饲喂重组酵母产生瘦素抗体，并降低了血液中的瘦素水平，在体重和采食量上的分析发现，和对照组相比能够有效的降低体重的同时减少采食量。甘油三脂和总胆固醇水平的与机体的肥胖有关，机体中这些激素的水平的降低能够说明机体肥胖的状态在发生改变，观察肝脏中的脂滴的大小发现，饲喂重组酵母的实验组的脂滴大小要小于对照组，表明饲喂含ob基因dna质粒的重组酵母能够降低肝脏中脂滴的大小。
[0122]
参见图8，高脂-正常组与高脂组实验的不同之处是饲料的改变，而饲料因素与重组酵母共同在抗体产生以及瘦素水平的降低中发挥作用，能够显著降低体重和采食量，甘油三酯和总胆固醇也降低，但是在肝脏中可能由于饲料的变化并没有观察到脂滴的出现。
[0123]
本发明通过含ob基因dna质粒的重组酵母对瘦素水平进行调节，在瘦素抵抗的原理之下，通过产生的瘦素抗体与瘦素结合，从而降低机体瘦素水平，使得瘦素抵抗状态发生改变。实验表明：饲喂含ob基因dna质粒的重组酵母的小鼠血清中能产生瘦素抗体，并且饲喂不同的重组酵母产生不同免疫效果的瘦素抗体，含jmb84-cmv-ova-ob的重组酵母要比含jmb84-cmv-ob的重组酵母产生的瘦素抗体免疫效果好。所产生的瘦素抗体通过结合瘦素，发生免疫反应，降低血液中的瘦素水平，从而可以对瘦素抵抗导致的肥胖等疾病发挥缓解、治疗作用，即便仍然未改变高脂饮食习惯。
[0124]
总之，本发明公开的口服重组酵母能够穿过活体生物的胃肠道环境，靶向肠道dc细胞递送ob基因dna，通过肠道黏膜免疫系统使机体产生瘦素抗体并进入血液中，可以通过产生的瘦素抗体有效的降低血液中的瘦素水平，消除瘦素抵抗的危害，能够应用于机体高瘦素导致的瘦素不敏感肥胖的治疗。