黄芩苷在制备预防和/或治疗无症状高尿酸血症和/或尿酸性肾病的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体地，涉及黄芩苷在制备预防和/或治疗无症状高尿酸血症和/或尿酸性肾病的药物中的应用。


背景技术：

2.近年来，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，无症状高尿酸血症以及尿酸性肾病的发病率显著增高。人体产生的尿酸约有2/3经肾脏随尿液排出，因此，高尿酸血症可导致肾功能的减退。尿酸性肾病是指大量尿酸盐结晶短时间沉积于肾脏集合管、肾盂及输尿管并堵塞肾小管，引起肾小管近端扩张，导致肾功能急性、严重损伤，引发急性肾功能衰竭，亦或是长期的血清高尿酸刺激肾脏，导致肾脏炎症和纤维化等损伤。目前治疗尿酸性肾病的药物主要以化学药为主，主要有黄嘌呤氧化酶抑制剂，例如：别嘌醇、非布司他等；或者促进尿酸排泄的药物，例如：丙磺舒、苯溴马隆等。但是上述药物都有严重的副作用，例如：肾毒性、过敏反应、心血管毒性、肝肾毒性等，在临床上使用受到了严重的限制。可见，传统的治疗药物毒副作用大，患者顺应性差。
3.近年来，由于中药毒副作用小，疗效确切，显示较强优势，因此中药治疗尿酸性肾病得到广泛重视。


技术实现要素：

4.本发明拟在解决现有治疗尿酸性肾病药物的毒副作用大、患者不易耐受、临床使用受到限制的特点。提出以毒副作用小的天然产物-黄酮类化合物作为高尿酸血症肾病的治疗。已有文献报道黄酮类化合物槲皮素对尿酸性肾损害的保护作用。本发明首次提出黄酮化合物黄芩苷能够治疗尿酸性肾病，从动物和细胞水平上面研究了黄芩苷抗高尿酸血症肾病的作用。本发明旨在解决开发出高效、低毒的抗高尿酸血症肾病的药物，以解决现临床上使用药物的毒性问题，提高患者的耐受性和顺应性。
5.本发明的第一方面提供黄芩苷在制备预防和/或治疗无症状高尿酸血症和/或尿酸性肾病的药物中的应用。
6.黄芩苷是一种淡黄色粉末，分子式c
21
h
18
o
11
，分子量446.37，其主要是从中药黄芩根中所提取分离得到一种黄酮化合物，是中药黄芩的主要活性成分之一，具有广泛的药理活性，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等药理活性，且毒性较低。将黄芩苷用于治疗尿酸性肾病，能安全有效地发挥降尿酸和保护其肾功能的作用，本发明为研发治疗尿酸性肾病的高效低毒的天然药物提供实验依据。
7.其中，黄芩苷可单用或与别嘌醇组成复合物的形式，在20-200mg/kg/d的剂量范围内均能降低血清尿酸与肾脏氧化应激水平，保护肾脏功能的作用，可以治疗高尿酸血症性肾病。因此，所述药物中还可以含有别嘌醇。
8.根据本发明，所述尿酸性肾病可包括急性尿酸性肾病、慢性尿酸性肾病和尿酸性
肾石症。
9.黄芩苷可通过口服给药，或采用注射途径的给药方式，因此，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。实验证明，腹腔注射50mg/kg/d的黄芩苷，能显著降低尿酸性肾病小鼠的血尿酸水平和保护肾功能，效果优于同剂量的灌胃给药组。
10.本发明中，通过体内实验的方法，制备了高尿酸血症肾病的小鼠模型，并采用灌胃25mg/kg/d、50mg/kg/d、100mg/kg/d的黄芩苷，结果表明黄芩苷能显著降低尿酸性肾病小鼠的血清尿酸、尿素氮和肌酐水平，因此，本发明的第二方面提供黄芩苷在制备降低血清尿酸、尿素氮和肌酐水平的药物中的应用。黄芩苷能抑制小鼠肝脏的黄嘌呤氧化酶的活性，从而减少尿酸生成；黄芩苷能显著降低高尿酸血症肾损伤小鼠的肾脏系数接近正常小鼠水平。综上所述，黄芩苷能抑制黄嘌呤氧化酶的活性，抑制尿酸生成，降低高尿酸血症肾病小鼠的血清尿酸水平，并能显著改善小鼠肾功能。
11.本发明中，通过细胞实验的方法，采用大鼠肾小管上皮细胞(nkr-52e)为研究对象，建立了尿酸钠晶体诱导肾小管上皮细胞损伤模型，并用20μmol/l、40μmol/l、80μmol/l的黄芩苷干预，结果表明黄芩苷能显著性降低模型细胞上清液中的tnf-α、il-1β、no和乳酸脱氢酶的表达。综上所述，黄芩苷通过减少tnf-α、il-1β、乳酸脱氢酶、no的分泌，从而抑制尿酸钠晶体对大鼠肾小管上皮细胞的损伤。因此，本发明的第三方面提供黄芩苷在制备tnf-α、il-1β、no和乳酸脱氢酶抑制剂中的应用。
12.本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
13.通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
14.图1示出了细胞培养上清液中ldh释放水平(n＝3)，其中，与空白组相比，
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p<0.01；与模型组相比，
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p<0.05，
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p<0.01。
15.图2示出了细胞培养上清液中no释放水平(n＝3)，其中，与空白组相比，
***
p<0.001；与模型组相比，
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p<0.05。
16.图3示出了细胞培养上清液tnf-α表达水平(n＝3)，其中，与空白组相比，
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p<0.01；与模型组相比，
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p<0.05，
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p<0.01。
17.图4示出了细胞培养上清液il-1β表达水平(n＝3)，其中，与空白组相比，
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p<0.01；与模型组相比，
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p<0.05，
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p<0.01。
具体实施方式
18.下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
19.实施例
20.以下实施例采用动物和细胞实验的方法进行研究。
21.1、黄芩苷对小鼠尿酸性肾病的作用研究
22.1.1材料
23.1.1.1实验动物
24.spf级雄性昆明种小鼠，体重20～22g，斯备福(北京)生物技术有限公司提供，动物合格证：scxk(京)20119-0010。
25.1.1.2药品与试剂
26.黄芩苷(纯度>90％)，批号：c031b150902，购自四川协力制药有限公司；别嘌醇(纯度98％)，批号：y27o8c46913，购自上海源叶生物科技有限公司；氧嗪酸钾盐(纯度>98％)，批号：p137112，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；尿酸测定试剂盒(尿酸酶比色法)，批号：20191129；尿素氮试剂盒(脲酶法)，批号：20191211；肌酐试剂盒(肌酐氧化酶法)，批号：20191218；考马斯亮蓝试剂盒，批号：20191217；黄嘌呤氧化酶(xod)试剂盒，批号：20191218；均购自南京建成生物工程研究所；酵母膏，批号：20180902，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；羧甲基纤维素钠，二甲基亚砜，购自国药集团化学试剂有限公司；双蒸水为实验室制备。
27.1.1.3实验仪器
28.al204电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；sps2001f电子天平(奥豪斯公司)；tgl-16c台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；uv-2000紫外分光光度计(unico)；fsh-2a可调高速匀浆机(金坛市医疗仪器厂)；xh-c涡旋混合器(金坛市医疗仪器厂)。
29.1.2、方法
30.1.2.1造模方法
31.采用酵母膏灌胃联合氧嗪酸钾腹腔注射建立小鼠尿酸性肾病模型。除正常组外，其余各组小鼠每天灌胃30g/kg酵母膏，连续15d，最后1d腹腔注射300mg/kg氧嗪酸钾。
32.1.2.2动物分组及给药
33.取雄性昆明种小鼠60只，适应性喂养3天后，按照体重随机分为6组，每组10只，分别为空白组、模型组、别嘌醇组(5mg/kg/d)、黄芩苷低剂量组(25mg/kg/d)、黄芩苷中剂量组(50mg/kg/d)和黄芩苷高剂量组(100mg/kg/d)。别嘌醇、黄芩苷和氧嗪酸钾均用0.8％的cmc-na的水溶液混悬。每天先灌胃给药(别嘌醇于第8d开始给药到第15d)，未给药组均给予相同体积的cmc-na的水溶液，后灌胃给予30g/kg的酵母膏水溶液造模，未造模组均给予相同体积的水溶液，第15d灌胃给予酵母膏后，腹腔注射300mg/kg氧嗪酸钾，后1h取血。灌胃和腹腔注射体积均为10ml/kg。
34.1.2.3测定指标
35.末次造模后1h，从小鼠眼后静脉取血，3500rpm/min离心全血，取上清液为血清，用于测定血清尿酸、bun、cr水平。脱臼处死小鼠后，取其肾脏、肝脏、脾脏、胸腺称重，脏器系数＝脏器质量(mg)/最后小鼠体质量(g)。用xod试剂盒测定血清和肝脏中的xod活性。
36.1.2.4统计学方法
37.采用graphpad prism 6对数据进行分析和作图，数据均采用表示，组间分析采用graphpad prism 6进行t检验，以p＜0.05为有统计学差异。
38.1.3结果
39.1.3.1黄芩苷对尿酸性肾病小鼠的血清尿酸、尿素氮和肌酐的影响
40.如表1所示，与空白组相比，模型组尿酸、尿酸氮和肌酐水平均显著性升高(p＜0.001)，表明尿酸性肾病模型建立成功。与模型组相比，阳性药别嘌醇能显著性降低尿酸水
平(p＜0.001)，但对尿素氮和肌酐水平没有明显影响，表明别嘌醇降尿酸水平效果显著，但对改善肾功能作用不明显。与模型组相比，黄芩苷低、中、高剂量组能显著性降低血清尿酸水平(低、中剂量组，p<0.01；高剂量组，p<0.001)，且呈现一定的剂量依赖性，表明黄芩苷在体内具有降尿酸作用；黄芩苷低、中、高剂量组显著降低血清尿素氮和肌酐水平(低剂量组，p<0.05；中、高剂量组，p<0.01)，表明黄芩苷对高尿酸血症所导致肾病有一定改善作用。
41.表1小鼠血清尿酸、尿素氮、肌酐水平(n＝10)
[0042][0043]
注：与空白组相比，
***
p<0.001；与模型组相比，
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p<0.05，
##
p<0.01，
###
p＜0.001
[0044]
1.3.2黄芩苷对尿酸性肾病小鼠的黄嘌呤氧化酶的影响
[0045]
如表2所示，与空白组相比，模型组血清xod活性无显著性升高(p>0.05)。与模型组相比，别嘌醇组血清xod活性显著性降低(p<0.001)；黄芩苷各剂量组对血清xod活性无显著影响(p>0.05)。与空白组相比，模型组肝脏xod活性显著性升高(p<0.001)，说明高尿酸血症肾病会导致肝脏xod活性升高。与模型组相比，别嘌醇组肝脏xod活性显著性降低(p<0.001)，表明别嘌醇对肝脏中的xod活性也有显著抑制作用；黄芩苷低、中、高剂量组能显著抑制肝脏xod活性(低剂量组，p<0.01；中剂量组，p<0.001；高剂量组p<0.01)。
[0046]
表2小鼠血清和肝脏的黄嘌呤氧化酶水平(n＝10)
[0047][0048]
注：与空白组相比，
***
p<0.001；与模型组相比，
##
p<0.01，
###
p＜0.001
[0049]
1.3.3黄芩苷对尿酸性肾病小鼠的脏器系数的影响
[0050]
如表3所示，与空白组相比，模型组的肝脏系数、肾脏系数和脾脏系数均显著性升
高(p＜0.001)，胸腺系数无明显变化。与模型组相比，别嘌醇能进一步显著升高肝脏系数(p＜0.01)，降低肾脏系数(p＜0.05)，进一步升高脾脏系数(p＜0.01)；黄芩苷低剂量对肝脏系数无明显影响(p>0.05)，黄芩苷中剂量(p＜0.05)、高剂量(p＜0.001)能显著降低肝脏系数；黄芩苷低、中、高剂量组能显著降低肾脏系数(低剂量组，p<0.001；中剂量组，p<0.01；高剂量组，p<0.001)；黄芩苷低中高剂量组能显著降低脾脏指数(低剂量组，p<0.05；中、高剂量组，p<0.001)。
[0051]
表3小鼠各个脏器系数水平(n＝10)
[0052][0053]
注：与空白组相比，
***
p<0.001；与模型组相比，
#
p<0.05，
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p<0.01，
###
p＜0.001
[0054]
2、黄芩苷对尿酸钠晶体诱导大鼠肾小管上皮细胞损伤的影响
[0055]
2.1实验材料
[0056]
2.1.1药品与试剂
[0057]
尿酸(美国sigma公司，批号：bcbw1849，纯度≥99％)；dmem高糖细胞培养基(hyclone公司，批号：1559231)；dmem/f12培养基(gibco公司，批号：8118010)；胎牛血清(gibco公司，南美，批号：42a0378k)；二甲亚砜(美国sigma公司，批号：20161109)；磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，pbs)(上海双螺旋生物科技有限公司，批号：m0401a)；青霉素、链霉素(美国hyclone公司，批号：1677648)；胰蛋白酶(含0.02％edta)(美国gibco公司，批号：2042337)。氢氧化钠，盐酸均购自国药。tnf-α、il-1βelisa试剂盒购自武汉三鹰生物科技有限公司。no试剂盒，批号：20191116；ldh试剂盒，批号：20191116；购自南京建成生物研究所。黄芩苷(纯度>90％)，批号：c031b150902，四川协力制药有限公司。地塞米松(纯度>98％)，批号：l1904041，购自上海阿拉丁生物科技有限公司。实验用水为实验室自制双蒸水。
[0058]
2.1.3实验仪器
[0059]
电子分析天平(型号：al204，梅特勒-托利多公司)；漩涡混合器(型号：xh-c，江苏省金坛市医疗仪器厂)；酶标仪(型号：enspire，美国珀金埃尔默股份有限公司)；二氧化碳培养箱(型号：w200ir，金西盟(北京)仪器有限公司)；立式压力蒸汽灭菌器(型号：yxq-ls-30sii，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；离心机(型号：tgl-16c，上海安亭科学仪器厂)；超声波清洗器(型号：kq3200e，昆山市超声仪器有限公司)；超净工作台(型号：sw-cj-1fd，苏净安泰空气技术有限公司)。
[0060]
2.1.4细胞株
[0061]
大鼠肾小管上皮细胞(nrk-52e)，上海吉凯基因化学技术公司提供(来源ctcc中科院上海细胞库)。
[0062]
2.2、方法
[0063]
2.2.1尿酸钠晶体的制备
[0064]
取0.8g尿酸，加入160ml水，后加热至水微沸，后加入1m的氢氧化钠使其溶解，后用稀盐酸调制ph＝7，使其自己析出，冷却后混悬取液体反复离心，得尿酸钠晶体用生理盐水混悬后高压蒸汽灭菌备用。
[0065]
2.2.2细胞处理
[0066]
将长满细胞的培养瓶，吸取旧培养基，后用pbs洗2次，弃掉pbs后，加入1.5ml的胰酶，放入培养箱消化2分钟，加入培养基终止消化，后离心得细胞备用。
[0067]
2.2.3造模及给药
[0068]
细胞长至85％时，吸取旧培养基，用pbs漂洗一次，加入不同药物和尿酸钠。组别为：空白组(完全培养基)，模型组(终浓度2mg/ml的msu的完全培养基)，地塞米松组(终浓度地塞米松40μmol/l+2mg/ml的msu的完全培养基)，黄芩苷低剂量(终浓度黄芩苷20μmol/l+2mg/ml的msu的完全培养基)，黄芩苷中剂量(终浓度黄芩苷40μmol/l+2mg/ml的msu的完全培养基)，黄芩苷高剂量(终浓度黄芩苷80μmol/l+2mg/ml的msu的完全培养基，每个重复三次实验。
[0069]
2.2.4生化指标测定
[0070]
取细胞上清液，1500rpm/min离心10分钟，取其上清液分装，保存至-20℃，用于测定tnf-α、il-1β、乳酸脱氢酶、no的含量。
[0071]
2.3结果
[0072]
2.3.1黄芩苷对尿酸钠晶体诱导nrk-52e细胞损伤的影响
[0073]
(1)细胞上清液ldh的释放量
[0074]
如图1所示，与空白组相比，模型组细胞在msu的刺激下，ldh释放量显著性升高(p<0.01)。与模型组相比，地塞米松组上清液中的ldh释放量显著降低(p<0.05)，说明地塞米松有一定的抗msu诱导nrk-52e细胞的损伤作用；黄芩苷低、中剂量组ldh释放量有降低趋势，但无显著性差异(p>0.05)，表明黄芩苷在20μmol/l、40μmol/l的浓度对msu所诱导ldh上调作用不明显；黄芩苷高剂量组可以显著性(p<0.01)降低ldh的释放，综述所述黄芩苷有一定抗msu所导致ldh大量释放的作用，且呈现一定的量效关系。
[0075]
(2)细胞上清液no释放量
[0076]
如图2所示，与空白组相比，模型组细胞上清液在msu的干预下no释放量显著上调(p<0.001)。与模型组相比，地塞米松组细胞上清液中no无显著降低(p>0.05)；黄芩苷低剂量组细胞上清液中no无显著降低(p>0.05)；黄芩苷中、高剂量组上清液中no显著性降低(p<0.05)。
[0077]
(3)细胞上清液中的tnf-α表达量
[0078]
如图3所示，与空白组相比，模型组细胞上清液在msu干预下tnf-α的表达水平显著升高(p<0.001)。与模型组相比，地塞米松组细胞上清液中tnf-α显著性降低(p<0.01)；黄芩苷低、中、高剂量组细胞上清液中tnf-α的表达均显著性降低(p<0.05或p<0.01)。
[0079]
(4)细胞上清液il-1β表达量
[0080]
如图4所示，与空白组相比，模型组细胞上清液中的上清液il-1β表达量显著性升高(p<0.01)。与模型相比，地塞米松组细胞上清液的il-1β表达量显著性降低(p<0.01)；黄芩苷低剂量组上清液il-1β表达量无显著性降低(p>0.05)；黄芩苷中、高剂量组细胞上清液il-1β表达均显著性降低(p<0.05)。
[0081]
结论
[0082]
别嘌醇是临床应用广泛的一线抑制尿酸生成类药物，别嘌醇是次黄嘌呤的异构体，是xod的自杀性底物，是黄嘌呤氧化酶竞争性抑制剂，能抑制黄嘌呤和次黄嘌呤被xod氧化生成尿酸，从而降低尿酸水平。在临床上别嘌醇被广泛用于高尿酸血症或其相关病症的治疗，虽然别嘌醇降尿酸效果显著，但临床报道大量的不良反应，例如：包括损害肝功能、肾功能、皮疹和超敏反应综合症，其中超敏反应综合症会出现一定致死性，上述不良反应显著限制了别嘌醇的临床应用。黄芩苷是一种主要存在于中药黄芩中的一种黄酮类化合物，其药理作用广泛，且毒副作用较小。本发明上述实验中，与模型组相比，黄芩苷能显著性降低尿酸性肾病小鼠的的血清尿酸、尿酸氮和肌酐水平，并呈现一定的剂量依赖性，说明黄芩苷不仅能降低尿酸水平，还能改善由于高尿酸酸血症所导致小鼠的肾功能降低。与模型组相比，黄芩苷能显著性抑制肝脏的xod的活性，说明黄芩苷是通过抑制xod活性，降低血清尿酸水平。与模型组相比，黄芩苷能降低由于高尿酸血症所引起的小鼠肾脏、肝脏以及脾脏系数的升高，结果说明，黄芩苷能有效降低高尿酸血症所导致肾脏、肝脏和脾脏损伤，表明黄芩苷不仅能保护高尿酸血症导致的肾脏损伤，还对肝脏以及脾脏同时具有保护作用。
[0083]
长期的高尿酸血症患者，会导致尿酸盐晶体沉积导致肾小管处，从而引起肾脏的急性炎症损伤，症状表现为：肾脏区急性疼痛、腹部发热以及蛋白尿等。对于尿酸盐沉积性的高尿酸血症肾病的急性发作，临床上主要采用抗炎处理，常用的药物有地塞米松、秋水仙碱等。由于秋水仙碱的常用剂量和中毒剂量较为接近，故不良反应发生率较高，主要表现为腹泻、呕吐、恶心以及肝细胞坏死，所以现在临床上已少用；地塞米松不适合长期使用，易产生药物依赖性和药源性疾病。本发明以nrk-52e细胞为研究对象，采用尿酸钠晶体制备尿酸钠晶体损伤肾小管细胞的模型，并采用黄芩苷和阳性药地塞米松进行干预，采用no、ldh、tnf-α、il-1β炎症相关指标观察药物的作用。与空白组相比，模型组的细胞上清液中no、ldh、tnf-α、il-1β均显著性升高，表明尿酸钠晶体引发了肾小管上皮细胞产生了炎症损伤，说明模型建立成功。与模型组相比，黄芩苷能不同程度显著降低no、ldh、tnf-α、il-1β的水平，结果表明黄芩苷能保护由于尿酸钠刺激所导致肾小管上皮细胞的炎症损伤。
[0084]
综上所示，黄芩苷能通过抑制黄嘌呤氧化酶和抗炎作用发挥降尿酸和保护尿酸性肾病小鼠肾功能的作用。
[0085]
3、黄芩苷对高尿酸性肾损害小鼠的保护作用
[0086]
3.1材料
[0087]
3.1.1动物
[0088]
spf级昆明小鼠，雄性，体重20～22g，华中科技大学实验动物中心提供。动物生产许可证号：scxk(鄂)2016-0009。
[0089]
3.1.2药品与试剂
[0090]
别嘌醇(批号y27o8c46913)，购于上海源叶生物科技有限公司；黄芩苷(纯度≥90％)，购自四川协力制药股份有限公司；氧嗪酸钾盐(批号p137112)，购自上海阿拉丁生化
科技股份有限公司；酵母膏(批号20170802)，购于北京奥博星生物技术责任公司；尿酸(uric acid，ua)测定试剂盒(批号20181017)，黄嘌呤氧化酶测试盒(批号20180920)，尿素氮(blood urea nitrogen，bun)试剂盒(批号20181024)，肌酐(creatinine，cr)试剂盒(批号20181022)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)试剂盒，丙二醛(malondialdehyde，mda)试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，gpx)试剂盒，过氧化氢酶(catalase，cat)试剂盒，考马斯亮蓝试剂盒(批号20180921)，均购自南京建成生物工程研究所；二甲基亚砜(批号20161109)，购于国药集团化学试剂有限公司。
[0091]
3.1.3仪器
[0092]
al204电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；sps2001f电子天平(奥豪斯公司)；tgl-16c台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；uv-2000紫外分光光度计(尤尼柯)；fsh-2a可调高速匀浆机(金坛市医疗仪器厂)。
[0093]
3.2、方法
[0094]
3.2.1动物分组与给药
[0095]
雄性昆明小鼠50只，适应性喂养3d后，按体重随机分为5组，每组10只。分为正常组，模型组，别嘌醇组(5mg/kg)，黄芩苷灌胃组(i.g，50mg/kg)，黄芩苷腹腔注射组(i.p，50mg/kg)。第1d开始上午定时给药，正常组和模型组小鼠灌胃生理盐水，黄芩苷i.g组与黄芩苷i.p组分别给予相应剂量黄芩苷，连续15d，别嘌醇组前8d灌胃0.5％cmc-na，最后7d灌胃给予别嘌醇。腹腔注射给药容积为0.15ml/10g，灌胃给药容积为0.2ml/10g。
[0096]
3.2.2高尿酸血症肾损害动物模型的建立
[0097]
采用酵母膏灌胃联合氧嗪酸钾腹腔注射建立小鼠高尿酸血症肾病模型。除正常组外，其余各组小鼠每天灌胃酵母膏(30g/kg)，连续15d，最后1d腹腔注射氧嗪酸钾(300mg/kg)，除别嘌醇组外，其余各组灌胃体积为0.2ml/10g，腹腔注射体积为0.15ml/10g，别嘌醇灌胃体积为0.1ml/10g。给予药物治疗后1h，除正常组外，其余各组灌胃酵母膏溶液，最后1d酵母膏灌胃后腹腔注射氧嗪酸钾溶液。
[0098]
3.2.3药物溶液的配制
[0099]
将黄芩苷溶解于dmso中，用生理盐水稀释配置成5mg/ml黄芩苷混悬液(dmso含量低于5％)。
[0100]
用0.5％cmc-na做溶媒，分别配制0.5mg/ml别嘌醇混悬液、3g/ml酵母膏混悬液20mg/ml氧嗪酸钾混悬液。
[0101]
3.2.4生化指标测定
[0102]
给药第15d，造模后1h，各组小鼠眼球取血，3500rpm离心10min，取上清液，于-20℃保存，用于测定血清ua、bun、cr水平，颈椎脱臼处死小鼠，称量全肾、肝脏、胸腺、脾脏重量，计算脏器指数。取肝脏，按照试剂盒说明书机械匀浆，测定肝脏xo水平。取小鼠同一侧的肾脏，按照试剂盒的说明机械匀浆，测定小鼠肾脏的氧化应激水平。
[0103]
3.3、结果
[0104]
3.3.1黄芩苷对高尿酸血症小鼠肾功能的影响
[0105]
实验结果见表4。由表4可知，与正常组比较，模型组小鼠血清尿酸、尿素氮、肌酐水平均极显著升高(p<0.01)，说明用酵母膏联合氧嗪酸钾能够造成小鼠高尿酸血症，并对肾脏有损害；与模型组比较，别嘌醇组小鼠血清尿酸水平极显著降低(p<0.01)，说明别嘌醇能
够降低小鼠血清尿酸，但小鼠血清尿素氮和肌酐水平无统计学意义(p>0.05)，说明别嘌醇对肾脏无保护作用；黄芩苷i.g组显著降低了血清ua水平(p<0.05)，但是对bun和cr无显著影响(p>0.05)。黄芩苷i.p组显著降低了血清ua水平(p<0.05)，且极显著降低bun水平(p<0.01)，显著降低cr水平(p<0.05)，说明腹腔注射黄芩苷在降低血清ua水平的同时还具有较好的肾脏保护作用。
[0106]
表4黄芩苷对尿酸性肾病小鼠血清尿酸、尿素氮、肌酐水平的影响(x
±
s,n＝10)
[0107][0108]
注：与正常组比较，
*
p<0.05，
**
p<0.01；与模型组比较，
#
p<0.05，
##
p<0.01。i.g，灌胃；i.p，腹腔注射。
[0109]
3.3.2黄芩苷对尿酸性肾病小鼠脏器指数的影响
[0110]
实验结果见表5。由表5可知，与正常组比较，模型组的肾指数明显增大(p<0.01)，说明高尿酸血症小鼠肾脏增大，此造模方式对肾脏有一定损伤。与模型组相比，别嘌醇组小鼠肾指数显著降低(p<0.01)；黄芩苷i.g组小鼠肾指数明显降低(p<0.01)，黄芩苷i.p组小鼠肾指数显著降低(p<0.05)，说明黄芩苷对高尿酸血症性肾病小鼠肾损害有一定保护作用。与正常组比较，黄芩苷i.g组与黄芩苷i.p组小鼠的肾指数无统计学差异(p>0.05)，说明黄芩苷灌胃及腹腔注射能使高尿酸诱导的小鼠肾指数升高恢复至正常小鼠水平。
[0111]
表5黄芩苷对小鼠脏器指数的影响(mg/g)(x
±
s,n＝10)
[0112][0113][0114]
与正常组比较，
*
p<0.05，
**
p<0.01；与模型组比较，
#
p<0.05，
##
p<0.01。
[0115]
3.3.3黄芩苷对尿酸性肾病小鼠肝脏xo活性的影响
[0116]
实验结果见表6。由表6可知，与正常组比较，模型组xo活性明显升高(p<0.01)，说明高尿酸血症小鼠能够升高xo的活性。与模型组比较，别嘌醇组的xo活性极显著降低(p<0.01)，黄芩苷i.g组与黄芩苷i.p组的xo活性均显著降低(p<0.05)。
[0117]
表6黄芩苷对小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响(x
±
s,n＝10)
[0118][0119]
注：与正常组比较，
*
p<0.05，
**
p<0.01；与模型组比较，
#
p<0.05，
##
p<0.01。
[0120]
3.3.4黄芩苷对高尿酸血症性肾病小鼠肾脏氧化应激的影响
[0121]
实验结果见表7。由表7可知，与正常组相比较，模型组小鼠的肾脏sod水平显著降低(p<0.05)，mda极显著增加(p<0.01)，表明较高的血清尿酸水平打破了小鼠肾脏的氧化应激平衡，提高了氧化应激水平，这将进一步导致肾脏的严重损失。与模型组相比较，别嘌醇组、黄芩苷i.g组与黄芩苷i.p组均不同程度地改善了由高尿酸引起的sod水平降低与mda水平的升高(p<0.05，p<0.01)。该结果表明黄芩苷对由高尿酸引起的氧化应激水平的增加具有一定的疗效，可以保护由氧化应激水平增加引起的肾脏损伤。
[0122]
表7黄芩苷对高尿酸血症性肾病小鼠肾脏氧化应激水平的影响(x
±
s,n＝10)
[0123][0124]
与正常组比较，
*
p<0.05，
**
p<0.01；与模型组比较，
#
p<0.05，
##
p<0.01。
[0125]
结论
[0126]
近年来已有文献报道黄芩苷可以在体外抑制xo活性的报道，但未见其对高尿酸血症性肾病的体内研究报道。本研究结果表明，灌胃与腹腔给药黄芩苷，均能够显著降低高尿酸血症肾病小鼠的血清尿酸水平，并且腹腔注射黄芩苷能显著降低血清尿素氮、肌酐水平，
说明黄芩苷能够逆转由于高尿酸导致的小鼠肾脏功能的损害，进而保护高尿酸血症小鼠的肾脏功能。且黄芩苷灌胃与腹腔注射均能降低由于高尿酸血症引起的小鼠肾脏指数上升，对小鼠肾脏有保护作用。氧化应激的失衡是高尿酸引起肾脏损伤的重要途径，黄芩苷灌胃与腹腔注射均能改善高尿酸血症引起的小鼠肾脏氧化应激指标的变化。高尿酸血症可以通过多途径引起肾损伤，如诱导炎症、氧化应激反应、内皮功能障碍、间质损伤及加重肾纤维化等，黄芩苷具有抗炎、抗氧化等药理作用。
[0127]
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。