重楼皂苷的制作方法

重楼皂苷
ⅶ
和多发性骨髓瘤临床药物的组合物及用途
技术领域
[0001]
本发明涉及一种多发性骨髓瘤治疗药物，具体涉及重楼皂苷
ⅶ
和多发性骨髓瘤临床药物的组合物及用途。属于医药技术领域。


背景技术：

[0002]
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,mm)是第二常见的血液肿瘤(13％)，是一种遗传复杂的克隆性血浆细胞恶性肿瘤，占所有新诊断肿瘤的1％。mm好发于中老年人，随着国内外人口的老龄化，mm发病率逐年增高。尽管近年来随着蛋白酶体抑制剂硼替佐米和一些免疫调节剂等新的靶向治疗不断涌现，使得mm患者的治疗缓解率明显提高。但是细胞耐药和对治疗抵抗引起的疾病复发，会让mm进入难治阶段，这对mm的治疗提出了新的挑战。因此针对mm治疗，寻找副作用小、特异性高、效果显著的新药物具有重要的临床意义。
[0003]
硼替佐米(bortezomib，商品名：velcade)，一种硼酸二肽，是一种26s蛋白酶体的高选择性可逆抑制剂，其作用于错误折叠蛋白的降解，并且对细胞周期的调控是必要的。硼替佐米目前是治疗多发性骨髓瘤的临床主要药物之一。硼替佐米会降低nf-κb活性，从而抑制mm细胞的增殖能力；它能够稳定p21，p27，和p53，从而抑制细胞周期；还可使促凋亡基因表达升高并激活capase通路，促进mm细胞凋亡。硼替佐米在mm的临床治疗上已得到广泛认可，但随着它的广泛应用，临床上出现了对硼替佐米的耐药，导致了复发/难治性mm患者的出现。
[0004]
阿霉素(doxorubicin，或adriamycin)，是一种抗菌的蒽环霉素，在肿瘤细胞中抑制dna拓扑异构酶ⅱ，并诱导dna损伤和凋亡。虽然阿霉素的使用价值受其慢性和急性毒副作用所限制，但是在治疗多发性骨髓瘤、乳腺癌、食道癌和非霍奇金淋巴癌方面仍然是必需的。
[0005]
重楼皂苷
ⅶ
(polyphyllin
ⅶ
，pp7)是重楼的生物活性成分之一，现代医学研究其在抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、止血等方面发挥着重要的作用。临床前研究表明，pp7具有广谱的抗肿瘤活性，包括肺癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、口腔癌、结肠癌等，但目前在mm中尚未有研究。重楼皂苷
ⅶ
广泛存在于重楼等植物中，而这类天然药物资源丰富，故重楼皂苷
ⅶ
在抗mm等肿瘤的临床治疗中有着巨大的潜在价值。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供重楼皂苷
ⅶ
和多发性骨髓瘤临床药物的组合物及用途。
[0007]
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008]
1、重楼皂苷
ⅶ
作为治疗多发性骨髓瘤药物的增效剂的用途。
[0009]
优选的，所述多发性骨髓瘤临床药物为硼替佐米或阿霉素。
[0010]
2、重楼皂苷
ⅶ
和多发性骨髓瘤临床药物的组合物。
[0011]
优选的，所述多发性骨髓瘤临床药物为硼替佐米，重楼皂苷
ⅶ
与硼替佐米的摩尔
比为100～400：1～2。
[0012]
优选的，所述多发性骨髓瘤临床药物为阿霉素，重楼皂苷
ⅶ
与阿霉素的摩尔比为0.5～2：0.5～1。
[0013]
3、重楼皂苷
ⅶ
和多发性骨髓瘤临床药物的组合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的用途。
[0014]
优选的，重楼皂苷
ⅶ
和多发性骨髓瘤临床药物的组合物在制备治疗复发/难治性多发性骨髓瘤药物中的用途。
[0015]
优选的，所述多发性骨髓瘤临床药物为硼替佐米，重楼皂苷
ⅶ
与硼替佐米的摩尔比为100～400：1～2。
[0016]
优选的，所述多发性骨髓瘤临床药物为阿霉素，重楼皂苷
ⅶ
与阿霉素的摩尔比为0.5～2：0.5～1。
[0017]
4、一种治疗多发性骨髓瘤的药物制剂，其有效成分为所述的重楼皂苷
ⅶ
和多发性骨髓瘤临床药物的组合物。
[0018]
本发明的有益效果：
[0019]
本发明将中药单体重楼皂苷
ⅶ
与多发性骨髓瘤临床药硼替佐米或阿霉素的组合物用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物。与重楼皂苷
ⅶ
或多发性骨髓瘤临床药物单用相比，本发明采用重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米或重楼皂苷
ⅶ
和阿霉素两者联用，具有更好的抑制细胞增殖作用。该组合物大大提高了多发性骨髓瘤细胞对硼替佐米或阿霉素的敏感性，特别适用于治疗复发/难治的多发性骨髓瘤患者。
[0020]
当采用重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米两者联用时，比两者单用具有更好的抑制细胞增殖作用，且重楼皂苷
ⅶ
也可显著抑制硼替佐米耐药株的增殖，该组合物大大提高了多发性骨髓瘤对硼替佐米的敏感性。当采用重楼皂苷
ⅶ
和阿霉素两者联用时，比两者单用具有更好的抑制细胞增殖作用，且该组合物大大提高了多发性骨髓瘤对阿霉素的敏感性。重楼皂苷
ⅶ
特别适用于治疗复发/难治性的多发性骨髓瘤。
附图说明
[0021]
图1为本发明采用cck-8方法检测不同浓度比例重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米对mm细胞anbl6细胞联用后对mm细胞的协同效应。pp7:重楼皂苷
ⅶ
；btz：硼替佐米。
[0022]
图2为本发明采用cck-8方法检测不同浓度比例重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米对mm细胞anbl6-br细胞联用后对mm细胞的协同效应。pp7:重楼皂苷
ⅶ
；btz：硼替佐米。
[0023]
图3为本发明采用cck-8方法检测重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米对mm细胞单用和联用后对mm患者原代cd138
+
细胞存活率的影响。pp7:重楼皂苷
ⅶ
；btz：硼替佐米；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
[0024]
图4为本发明采用cck-8方法检测重楼皂苷
ⅶ
和阿霉素对mm细胞单用和联用后对mm患者原代cd138
+
细胞存活率的影响。pp7:重楼皂苷
ⅶ
；dox：阿霉素；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
[0025]
图5为本发明采用cck-8方法检测不同浓度比例重楼皂苷
ⅶ
和阿霉素联用后对mm细胞anbl6细胞的协同效应。pp7:重楼皂苷
ⅶ
；dox：阿霉素。
[0026]
图6为本发明采用cck-8方法检测不同浓度比例重楼皂苷
ⅶ
和阿霉素联用后对mm
细胞arp1细胞的协同效应。pp7:重楼皂苷
ⅶ
；dox：阿霉素。
具体实施方式
[0027]
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0028]
本发明涉及的重楼皂苷
ⅶ
(购买自成都曼思特生物科技有限公司)，其纯度为98％。
[0029]
实施例1：
[0030]
采用cck-8方法检测不同浓度比例重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米对mm细胞anbl6细胞联用后对mm细胞的协同效应。
[0031]
实验步骤：
[0032]
(1)anbl6细胞(来自中南大学肿瘤研究所周文教授)长到对数期，将细胞重悬至15ml离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。
[0033]
(2)设置不加细胞只有完全培养基(rpmi-1640培基+10％bi胎牛血清+1％双抗)孔板组以及不加药物、只有细胞和完全培养基的对照组，每个浓度设置4个复孔。
[0034]
(3)分别加入不同浓度比例的重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米(浓度为0μm+0nm，0μm+5nm、0μm+7.5nm、0μm+10nm、0.5μm+0nm、0.5μm+5nm、0.5μm+7.5nm、0.5μm+10nm、0.75μm+0nm、0.75μm+5nm、0.75μm+7.5nm、0.75μm+10nm、1μm+0nm、1μm+5nm、1μm+7.5nm、1μm+10nm)，接种细胞(96孔板中每孔约7
×
103个细胞)于96孔板，每组4个复孔，使之生长24h。
[0035]
(4)在细胞培养液中直接加入1/10体积的cell counting kit-8(cck-8)，充分混合，保证孔中颜色均一性，尽量避免气泡产生。对96孔板，每100μl培养液加入10μl活性检测试剂。
[0036]
(5)继续培养3小时至颜色变为橙色，用酶标仪读取450nm光吸收值，根据下面公式计算药物作用下的细胞活力：
[0037]
细胞活力*＝[a(加药)-a(空白)]/[a(0加药)-a(空白)]
[0038]
a(加药)：具有细胞、cck8溶液和药物溶液的孔的吸光度
[0039]
a(空白)：具有培养基和cck8溶液而没有细胞的孔的吸光度
[0040]
a(0加药)：具有细胞、cck8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
[0041]
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
[0042]
(6)计算出细胞活力后，在compusyn软件中分别输入重楼皂苷
ⅶ
在0.5、0.75、1μm时的细胞活力，硼替佐米在5、7.5、10nm时的细胞活力，以及重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米两药联用时的细胞活力(浓度为0.5μm+5nm、0.5μm+7.5nm、0.5μm+10nm、0.75μm+5nm、0.75μm+7.5nm、0.75μm+10nm、1μm+5nm、1μm+7.5nm、1μm+10nm，依次标记为1～9)，输完数据后，compusyn软件会得出两药联用时对应的分数效应fa与组合指数ci值。协同效应见表1和图1。
[0043]
表1.重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米对anbl6细胞的协同效应
[0044]
组别重楼皂苷
ⅶ
(μm)硼替佐米(nm)分数效应fa组合指数ci10.5050.450.95
20.507.50.580.9130.50100.740.8740.7550.441.1750.757.50.630.8860.75100.840.7271.0050.650.6681.007.50.810.6091.00100.860.69
[0045]
实施例2：
[0046]
采用cck-8方法检测不同浓度比例重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米对mm细胞anbl6-br细胞联用后对mm细胞的协同效应。
[0047]
实验步骤：
[0048]
(1)anbl6-br(来自中南大学肿瘤研究所周文教授)细胞长到对数期，将细胞重悬至15ml离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。
[0049]
(2)设置不加细胞只有完全培养基(rpmi-1640培基+10％bi胎牛血清+1％双抗)孔板组以及不加药物、只有细胞和完全培养基的对照组，每个浓度设置4个复孔。
[0050]
(3)分别加入不同浓度比例的重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米(浓度为0μm+0nm，0μm+40nm、0μm+80nm、0μm+160nm、0.5μm+0nm、0.5μm+40nm、0.5μm+80nm、0.5μm+160nm、1μm+0nm、1μm+40nm、1μm+80nm、1μm+160nm、2μm+0nm、2μm+40nm、2μm+80nm、2μm+160nm)，接种细胞(96孔板中每孔约7
×
103个细胞)于96孔板，每组4个复孔，使之生长24h。
[0051]
(4)在细胞培养液中直接加入1/10体积的cell counting kit-8(cck-8)，充分混合，保证孔中颜色均一性，尽量避免气泡产生。对96孔板，每100μl培养液加入10μl活性检测试剂。
[0052]
(5)继续培养3小时至颜色变为橙色，用酶标仪读取450nm光吸收值，协同效应见表2和图2。根据下面公式计算药物作用下的细胞活力：
[0053]
细胞活力*＝[a(加药)-a(空白)]/[a(0加药)-a(空白)]
[0054]
a(加药)：具有细胞、cck8溶液和药物溶液的孔的吸光度
[0055]
a(空白)：具有培养基和cck8溶液而没有细胞的孔的吸光度
[0056]
a(0加药)：具有细胞、cck8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
[0057]
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
[0058]
(6)计算出细胞活力后，在compusyn软件中分别输入重楼皂苷
ⅶ
在0.5、1、2μm时的细胞活力，硼替佐米在40、80、160nm时的细胞活力，以及重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米两药联用时的细胞活力(浓度为0.5μm+40nm、0.5μm+80nm、0.5μm+160nm、1μm+40nm、1μm+80nm、1μm+160nm、2μm+40nm、2μm+80nm、2μm+160nm，依次标记为1～9)，输完数据后，compusyn软件会得出两药联用时对应的分数效应fa与组合指数ci值。协同效应见表2和图2。
[0059]
表2.重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米对anbl6-br细胞的协同效应
[0060][0061][0062]
实施例3：
[0063]
采用cck-8方法检测重楼皂苷
ⅶ
和硼替佐米对mm细胞单用和联用后对mm患者原代cd138
+
细胞存活率的影响。
[0064]
实验步骤：
[0065]
(1)以淋巴细胞分离液(购自于天津灏洋生物制品科技有限公司)分离出mm患者(来自于湖南省肿瘤医院)的骨髓单个核细胞。
[0066]
(2)以cd138磁珠分选出单个核细胞中的cd138
+
细胞。
[0067]
(3)将cd138
+
原代细胞重悬至15ml离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。
[0068]
(4)设置不加细胞只有完全培养基(rpmi-1640培基+10％bi胎牛血清+1％双抗)孔板组以及不加药物、只有细胞和完全培养基的对照组，每个浓度设置4个复孔。
[0069]
(5)分别加入1μm重楼皂苷
ⅶ
、5nm硼替佐米以及1μm重楼皂苷
ⅶ
和5nm硼替佐米联合加入。接种细胞(96孔板中每孔约2
×
104个细胞)于96孔板，每组4个复孔，使之生长24h。
[0070]
(6)在细胞培养液中直接加入1/10体积的cell counting kit-8(cck-8)，充分混合，保证孔中颜色均一性，尽量避免气泡产生。对96孔板，每100μl培养液加入10μl活性检测试剂。
[0071]
(7)继续培养12小时至颜色变为橙色，用酶标仪读取450nm光吸收值，计算细胞存活率，见图3。
[0072]
实施例4：
[0073]
采用cck-8方法检测重楼皂苷
ⅶ
和阿霉素(购买自美国selleck生物科技有限公司)对mm细胞单用和联用后对mm细胞存活率的影响。
[0074]
实验步骤：
[0075]
(1)anbl6、arp1细胞(来自中南大学肿瘤研究所周文教授)长到对数期，将细胞重悬至15ml离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。
[0076]
(2)设置不加细胞只有完全培养基(rpmi-1640培基+10％bi胎牛血清+1％双抗)孔板组以及不加药物、只有细胞和完全培养基的对照组，每个浓度设置4个复孔。
[0077]
(3)分别加入0.5μm重楼皂苷
ⅶ
、1μm阿霉素以及0.5μm重楼皂苷
ⅶ
和1μm阿霉素联合加入。接种细胞(96孔板中每孔约8
×
103个细胞)于96孔板，每组4个复孔，使之生长24h。
[0078]
(4)在细胞培养液中直接加入1/10体积的cell counting kit-8(cck-8)，充分混
合，保证孔中颜色均一性，尽量避免气泡产生。对96孔板，每100μl培养液加入10μl活性检测试剂。
[0079]
(5)继续培养3小时至颜色变为橙色，用酶标仪读取450nm光吸收值，计算细胞存活率，见图4。
[0080]
实施例5：
[0081]
采用cck-8方法检测不同浓度比例重楼皂苷
ⅶ
和阿霉素对mm细胞anbl6和arp1细胞联用后对mm细胞的协同效应。
[0082]
(1)anbl6、arp1细胞长到对数期，将细胞重悬至15ml离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。
[0083]
(2)设置不加细胞只有完全培养基(rpmi-1640培基+10％bi胎牛血清+1％双抗)孔板组以及不加药物、只有细胞和完全培养基的对照组，每个浓度设置4个复孔。
[0084]
(3)分别加入不同浓度比例的重楼皂苷
ⅶ
和阿霉素(浓度为0μm+0μm、0μm+0.5μm、0μm+0.75μm、0.μm+1μm、0.5μm+0μm、0.5μm+0.5μm、0.5μm+0.75μm、0.5μm+1μm、0.75μm+0μm、0.75μm+0.5μm、0.75μm+0.75μm、0.75μm+1μm、1μm+0μm、1μm+0.5μm、1μm+0.75μm或1μm+1μm)，接种细胞(96孔板中每孔约8
×
103个细胞)于96孔板，每组4个复孔，使之生长24h。
[0085]
(4)在细胞培养液中直接加入1/10体积的cell counting kit-8(cck-8)，充分混合，保证孔中颜色均一性，尽量避免气泡产生。对96孔板，每100μl培养液加入10μl活性检测试剂。
[0086]
(5)继续培养3小时至颜色变为橙色，用酶标仪读取450nm光吸收值，根据下面公式计算药物作用下的细胞活力：
[0087]
细胞活力*＝[a(加药)-a(空白)]/[a(0加药)-a(空白)]
[0088]
a(加药)：具有细胞、cck8溶液和药物溶液的孔的吸光度
[0089]
a(空白)：具有培养基和cck8溶液而没有细胞的孔的吸光度
[0090]
a(0加药)：具有细胞、cck8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
[0091]
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
[0092]
(6)计算出细胞活力后，在compusyn软件中分别输入重楼皂苷
ⅶ
在0.5、0.75、1μm时的细胞活力，阿霉素在0.5、0.75、1μm时的细胞活力，以及重楼皂苷
ⅶ
和阿霉素两药联用时的细胞活力(浓度为0.5μm+0.5μm、0.5μm+0.75μm、0.5μm+1μm、0.75μm+0.5μm、0.75μm+0.75μm、0.75μm+1μm、1μm+0.5μm、1μm+0.75μm或1μm+1μm，依次标记为1～9)，输完数据后，compusyn软件会得出两药联用时对应的分数效应fa与组合指数ci值。协同效应见表3、4和图5、6。
[0093]
表3.重楼皂苷
ⅶ
和阿霉素联用对anbl6细胞联用后的协同效应
[0094]
组别重楼皂苷
ⅶ
(μm)阿霉素(μm)分数效应fa组合指数ci10.500.500.530.7320.500.750.730.3630.501.000.730.4140.750.500.780.3450.750.750.820.3060.751.000.840.28
71.000.500.840.3181.000.750.920.1691.001.000.920.17
[0095]
表4.重楼皂苷
ⅶ
和阿霉素联用对arp1细胞联用后的协同效应
[0096]
组别重楼皂苷
ⅶ
(μm)阿霉素(μm)分数效应fa组合指数ci10.500.500.370.8120.500.750.470.7430.501.000.560.7040.750.500.460.7150.750.750.500.7760.751.000.570.7671.000.500.470.8081.000.750.520.8291.001.000.620.70
[0097]
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。