非洲猪瘟疫苗的制作方法

1.本发明涉及用于治疗和/或预防非洲猪瘟的疫苗。
2.发明背景
3.非洲猪瘟(asf)是由双链dna病毒，非洲猪瘟病毒(asfv)引起的家猪的毁灭性出血疾病。asfv是非洲猪瘟病毒科(asfarviridae)中唯一主要在细胞质中复制的成员。asfv的强毒株可在感染后约5-14天内杀死家猪，死亡率接近100％。
4.目前没有asf的治疗方法。非洲以外的国家已经尝试在全国范围内通过限制进口猪和猪肉产品、在饲喂猪前强制煮沸获得许可的废弃动物产品、以及在诊断出疾病时实施屠宰政策等方式进行预防。在非洲，预防由野生动物的传播基于让疣猪和被疣猪污染的材料远离猪群的措施。在家猪群中的传播基于良好的生物安全措施以及在受影响的农场实施猪的检疫和屠宰。
5.迄今为止，没有开发出有效的减毒或灭活病毒疫苗(参见http://www.thepigsite.com/pighealth/article/441/african-swine-fever-asf)。
6.通过使用从软蜱中回收的低毒力asfv毒株ourt88/3，对致死性攻击的实验性保护成为可能。ourt88/3是来自葡萄牙的asfv的非致病性分离物。先前的asfv ourt88/3感染已显示出可以对相关毒性病毒的攻击提供保护(boinas等人(2004)j gen virol 85:2177-2187；oura等人(2005)j.gen.virol.86:2445-2450)。此外，一些基因缺失的病毒也能有效地诱导对攻击的保护(例如beninδmgf和beninδdp148r)。
7.尽管这些病毒已显示出在某些动物中诱导保护性免疫应答，但这种效果似乎并不普遍。该免疫作用似乎不能有效地保护一些猪免受随后的攻击。其还可能与一些猪的不良临床反应的诱导有关，例如发烧或关节肿胀。
8.包含asfv多肽的亚基组合物诱导针对asfv的防护的能力也已得到研究。然而，这些研究已确定，asfv多肽诱导免疫原性应答的能力不一定能预测其诱导对asfv攻击的防护的能力(参见neilan等人；virology；319(2)；337-342；2004)。此外，asfv多肽可能只有在特定的组合中使用时才能诱导防护作用。例如，neilan等人(如上)报道p30、p54、p72和p22的组合不足以诱导防护作用。相比之下，argilaguet等人(antiviral res；98(1)；61-65；2013)报道，p30、p54和ep402r的组合在dna疫苗接种实验中对asfv具有部分防护作用。
9.因此需要替代措施来控制asfv感染并防止疾病的传播。
10.发明概述
11.本发明人确定了三种asfv多肽的最小组合，其在asfv攻击之前施用时能够诱导针对asfv的可重复防护作用。发明人已经确定，当不存在这三种asfv多肽中的任何一种时，均不能诱导防护作用。此外，发明人已经证明，这三种asfv多肽的最小组合可以与另外的asfv多肽组合以提供改进的疫苗组合物，以用于诱导针对asfv攻击的可靠防护以及asf的治疗和/或预防。
12.因此，在第一方面，本发明提供了一种asf病毒亚基疫苗，其包含：(i)一种或多种重组多核苷酸，该一种或多种重组多核苷酸编码如seq id no:1、2和3所示的多肽或其免疫
原性片段；或与seq id no:1、2或3之一或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体；其中由一种或多种重组多核苷酸编码的不同asf病毒(asfv)多肽的总数为10种或更少；或者(ii)如seq id no:1、2和3所示的重组多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:1、2和3之一或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体；其中疫苗包含10种或更少的不同asfv多肽。
13.本文中使用的术语亚基疫苗是指包含单独多肽或编码所述多肽的多核苷酸的疫苗；其是与包含整个病毒颗粒(如活病毒、减毒病毒和死病毒)的疫苗相对而言的。
14.由一种或多种重组多核苷酸编码的不同asfv多肽的数量可以是9种或更少、8种或更少、7种或更少、或6种或更少的asfv多肽；或者该疫苗可以包含9种或更少、8种或更少、7种或更少、或6种或更少的asfv多肽。
15.该疫苗可包含：(i)一种或多种另外的多核苷酸，该多核苷酸编码选自seq id no:4-8的asfv多肽或其免疫原性片段，或与seq id no:4-8或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体；或者(ii)一种或多种另外的多肽，该多肽选自seq id no:4-8或其免疫原性片段；或与seq id no:4-8之一或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
16.该疫苗可包含：(a)重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码包含seq id no:1-8的多肽或其免疫原性片段，或与seq id no:1-8或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体；或者重组多肽，该重组多肽包含seq id no:1-8或其免疫原性片段，或与seq id no:1-8或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体；(b)重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码包含seq id no:1-3和6-8的多肽或其免疫原性片段，或与seq id no:1-3和6-8或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体；或者重组多肽，该重组多肽包含seq id no:1-3和6-8或其免疫原性片段，或与seq id no:1-3和6-8或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体；或者(c)重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码包含seq id no:1-5的多肽或其免疫原性片段，或与seq id no:1-5或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体；或者重组多肽，该重组多肽包含seq id no:1-5或其免疫原性片段，或与seq id no:1-5或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
17.重组多核苷酸可包含seq id no:9、10和11或其具有至少70％序列同一性的变体。
18.另外的多核苷酸可包含seq id no:12-16中的一种或多种或其具有至少70％序列同一性的变体。
19.多核苷酸可以存在于载体中。载体可选自腺病毒载体、修饰的安卡拉牛痘病毒载体和假狂犬病病毒载体。
20.每种重组多核苷酸可以提供于相同载体中。
21.在另一方面，本发明提供了根据本发明第一方面的疫苗，其用于治疗和/或预防受试者的非洲猪瘟。
22.本发明还涉及用于治疗和/或预防受试者的非洲猪瘟的方法，其包括将治疗有效量的根据本发明的疫苗施用给受试者。
23.在另一方面，本发明涉及如本发明的第一方面所限定的重组多核苷酸、载体或重组多肽在制备用于治疗和/或预防受试者的非洲猪瘟的药物中的用途。
24.受试者可以是猪受试者。适当地，受试者可以是家猪。
25.疫苗可以根据初免-加强程序施用。例如，初免组合物可以包含一种或多种腺病毒
载体并且加强组合物可以包含一种或多种修饰的安卡拉牛痘病毒载体。
26.疫苗可以通过口服、静脉内、肌内、皮下、鼻内或皮内给药来施用。
附图说明
27.图1-腺病毒-mva初免-加强方法的方案
28.图2-用于本发明的asfv多肽的代表性氨基酸序列(seq id no:1-8和17)
29.图3-用于本发明的编码asfv多肽的代表性核酸序列(seq id no:9-16)
30.图4-表1
31.发明详述
32.非洲猪瘟病毒(asfv)
33.本发明人已经确定了能够诱导针对asfv的可重复防护的三种asfv多肽的最小组合。
34.非洲猪瘟病毒(asfv)是非洲猪瘟(asf)的起因。该病毒在猪中引起高死亡率的出血热，但持续感染的其自然宿主疣猪和丛林猪没有疾病迹象。该病毒还感染饨缘蜱属(ornithodoros)的软蜱，这些软蜱被认为可用作载体。
35.asfv在受感染细胞的细胞质中复制，是非洲猪瘟病毒科唯一如此的成员。asfv是撒哈拉以南非洲的地方性病毒，在野外通过蜱与野猪、丛林猪和疣猪之间的感染循环存在。asfv是在欧洲定居者将猪带入asfv流行地区后首次描述的，因此是“新发感染”的实例。
36.asfv是一种大型、二十面体、双链dna病毒，其具有包含至少150个基因的线性基因组。基因的数量在病毒的不同分离物之间略有不同。asfv与其他大型dna病毒，例如痘病毒、虹彩病毒和拟态病毒有相似之处。与其他病毒性出血热一样，其复制的主要靶细胞是单核细胞、巨噬细胞谱系。
37.基于编码主要衣壳蛋白p72的b646l基因c端区域的序列变异，已鉴定出24种asfv基因型(i-xxix)。所有asfv p72基因型都在东部和南部非洲流行。基因型i在撒丁岛和西部非洲流行。基因型ii在欧洲、中国、越南和柬埔寨流行。基因型viii被限制在四个东非国家。
38.下面给出来自一些基因型的毒株的实例。以粗体显示的毒株用于表2所示的同一性分析。
39.基因型i：ourt88/3；brazil/79；lisbon/60；ba715；asfv-pret；benin 97/1；ic/1/96；ic/576；cam/82；madrid/62；malta/78；zar85；katange63；togo；dakar59；ourt88/1；ben/1/97；dom_rep；val/76；ic/2/96；awoshie/99；nig/1/99；nig/1/98；ang/70；bel/85；spec120；lisbon/57；asfv-warm；gha/1/00；gam/1/00；ghana；hol/86；nam/1/80；nur/90/1；cam/4/85；asfv-teng；tengani；asfv-e75。
40.基因型ii:georgia 2007/1,belgium 2018/1,china/2018/anhuixcgq
41.基因型iii:bot 1/99
42.基因型iv:asfv-warthog；rsa/1/99/w
43.基因型vi:moz 94/1
44.基因型vii:vict/90/1；asfv-mku；rsa/1/98
45.基因型viii:nda/1/90；kal88/1；zam/2/84；jon89/13；kav89/1；dezda；malawi lil 20/1
46.基因型ix:uga/1/95；ken06.bus
47.基因型x:bur/1/84；bur/2/84；bur/90/1；uga/3/95；tan/kwh12；hindeii；asfv-ken；virulent uganda 65；ken05/tk1。
48.本发明人已经确定，包含asfv多肽seq id no:1-3的最小组合的组合物能够诱导针对asfv攻击的防护。
49.表2
[0050][0051]
表2中多肽的代表性氨基酸序列如图2所示(seq id no:1-8和17)。
[0052]
编码表2中多肽的代表性核酸序列如图3中的seq id no:9-16所示。
[0053]
多肽
[0054]
术语“多肽”在正常意义上使用，是指通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，通常是l-氨基酸。该术语与“蛋白质”同义。
[0055]
术语“重组多肽”用于表示从其自然环境分离的多肽，例如，从asfv提取或由其外部产生的多肽。特别是，重组多肽不是在asfv的背景下提供，而是由重组核酸，即人工产生的dna或rna表达。
[0056]
本发明的疫苗可以包含如本发明所限定的asfv多肽的组合。
[0057]
本发明的疫苗可以包含如seq id no:1、2和3所示的重组多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:1、2和3或其免疫原性片段之一具有至少70％序列同一性的变体。
[0058]
在本发明的任一实施方案中，seq id no:3的多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:3或其免疫原性片段之一具有至少70％序列同一性的变体，可以被seq id no:17或其免疫原性片段；或与seq id no:17或其免疫原性片段之一具有至少70％序列同一性的变体取代。
[0059]
seq id no:17是来自基因型ii毒株的代表性ep153r序列。
[0060]
适当地，变体可以包含与seq id no:1、2或3之一至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列；或其免疫原性片段。
[0061]
适当地，变体可以包含与seq id no:1至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列或其免疫原性片段。
[0062]
适当地，变体可以包含与seq id no:2至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列或其免疫原性片段。
[0063]
适当地，变体可以包含与seq id no:3至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列或其免疫原性片段。
[0064]
本发明的疫苗可以包含如seq id no:1、2和3所示的重组多肽；或与seq id no:1、
2和/或3之一具有至少70％序列同一性的变体。在一个实施方案中，疫苗可以组成为如seq id no:1、2和3所示的重组多肽；或与seq id no:1、2和/或3之一具有至少70％序列同一性的变体。
[0065]
在一个实施方案中，重组多肽可以由如seq id no:1、2和3所示的氨基酸序列或其具有至少70％序列同一性的变体组成。
[0066]
疫苗还可以包含一种或多种选自seq id no:4-8的多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:4-8之一或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
[0067]
适当地，变体可以包含与seq id no:4-8之一至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列；或其免疫原性片段。
[0068]
适当地，变体可以包含与seq id no:4至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列或其免疫原性片段。
[0069]
适当地，变体可以包含与seq id no:5至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列或其免疫原性片段。
[0070]
适当地，变体可以包含与seq id no:6至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列或其免疫原性片段。
[0071]
适当地，变体可以包含与seq id no:7至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列或其免疫原性片段。
[0072]
适当地，变体可以包含与seq id no:8至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列或其免疫原性片段。
[0073]
疫苗还可包含一种或多种选自seq id no:4-8的多肽或与seq id no:4-8之一具有至少70％序列同一性的变体。
[0074]
疫苗可包含至少2种、至少3种、至少4种或至少5种选自seq id no:4-8的多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:4-8之一具有至少70％序列同一性的变体。
[0075]
疫苗可包含2、3、4或5种选自seq id no:4-8的多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:4-8之一或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
[0076]
适当地，疫苗可包含含有seq id no:1-8的重组多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:1-8或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
[0077]
适当地，疫苗可包含含有seq id no:1-3和6-8的重组多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:1-3和6-8或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
[0078]
适当地，疫苗可包含含有seq id no:1-5的重组多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:1-5或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
[0079]
变体
[0080]
尽管可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑变体，但在本发明的上下文中，优选根据序列同一性来表示变体。
[0081]
序列比较可以通过肉眼进行，或者更常见的是借助现有的序列比较程序进行。这些公开和商业可用的计算机程序可以计算两个或多个序列之间的序列同一性。
[0082]
序列同一性可以在连续序列上计算，即一条序列与另一条序列对齐，一条序列中的每个氨基酸直接与另一条序列中的相应氨基酸进行比较，每次一个残基。这称为“无空位”对齐。通常，这种无空位对齐仅在相对较短数量的残基(例如少于50个连续的氨基酸)上
进行。
[0083]
虽然这是一种非常简单和一致的方法，但其没有考虑到，例如，在另一对相同的序列中，一个插入或删除将导致后续氨基酸残基无法对齐，从而可能导致当进行全局比对时，同源性百分比会大大降低。因此，大多数序列比较方法旨在产生考虑可能的插入和缺失的最佳对齐方式，以免过度惩罚整体同源性得分。这是通过在序列对齐中插入“空位”以尝试最大化局部同源性来实现的。
[0084]
然而，这些更复杂的方法将“空位罚分”分配给对齐中出现的每个空位，因此，对于相同数量的同一氨基酸，具有尽可能少的空位的序列对齐(反映了两个比较序列之间更高的相关性)将比有很多空位的序列对齐达到更高的分数。通常使用“仿射空位成本”，其对空位的存在收取较高的成本且对空位中的每个后续残基有较小的罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生具有更少空位的优化对齐。大多数的对齐程序允许修改空位罚分。但是，在使用此类软件以进行序列比较时，优选使用默认值。例如，当使用gcg wisconsin bestfit软件包(见下文)时，氨基酸序列的默认空位罚分是一个空位-12和每个延伸段-4。
[0085]
因此，序列同一性最大百分比的计算首先需要产生最佳对齐，同时考虑到空位罚分。用于进行这种对齐的合适的计算机程序是gcg wisconsin bestfit程序包(university of wisconsin,u.s.a；devereux等人,1984,nucleic acids research 12:387)。能进行序列比较的其他软件的示例包括但不限于blast包(参见ausubel等人，1999ibid-第18章)、fasta(atschul等人，1990，j.mol.biol.，403-410)和geneworks比较工具套件。blast和fasta都可用于离线和在线搜索(参见ausubel等人，1999ibid，第7-58至7-60页)。然而，优选使用gcg bestfit程序。
[0086]
在一个实施方案中，在选自seq id no:1-8或seq id no:9-16的序列的整体上确定序列同一性。在一个实施方案中，在与选自seq id no:1-8或seq id no:9-16的序列比对的候选序列的整体上确定序列同一性。
[0087]
虽然最终的序列同一性可以根据同一性来衡量，但对齐过程本身通常不是基于全有或全无的配对比较。取而代之的是，通常使用规模化的相似性评分矩阵，其根据化学相似性或进化距离为每个成对比较赋予分数。这种矩阵常用的实例是blosum62矩阵-blast程序套件的默认矩阵。gcg wisconsin程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(在有提供的情况下)(有关详细信息，请参阅用户手册)。优选使用gcg包的公共默认值，或者在其他软件的情况下，优选使用默认矩阵，例如blosum62。
[0088]
一旦软件产生了最佳对齐，就可以计算序列同一性的百分比。该软件通常将此作为序列比较的一部分并生成数字结果。
[0089]
根据本发明的术语“变体”包括来自或者针对序列的一个(或多个)氨基酸的任何取代、变异、修饰、替换、缺失或添加，条件是所得氨基酸序列基本上保留与未修饰的序列相同的活性。
[0090]
例如，可以根据下表进行保守性取代。第二列中同一格中的氨基酸，优选第三列中同一行中的氨基酸可以相互替换：
[0091][0092]
至于功能方面，变体应当能够诱导免疫应答。举例来说，免疫应答的诱导可以通过证明从先前经多肽或其免疫原性片段免疫的受试者分离的外周免疫细胞或脾细胞的回忆应答来确定。例如，可以通过干扰素的产生(例如ifnγ)和/或经先前用于免疫受试者的抗原或多肽体外攻击后的增殖反应来证明回忆应答。优选地，当与本发明所述的选自seq id no:1-3的多肽或其变体或免疫原性片段组合施用时，变体应当能够在受试者中诱导保护性免疫应答，以抵抗随后的asfv攻击。
[0093]
多肽可以包含选自seq id no:1-8的氨基酸序列的免疫原性片段或与其具有至少70％序列同一性的变体。
[0094]
免疫原性片段是指能够诱导免疫应答的seq id no:1-8的部分或一部分。优选地，当与本发明所述的选自seq id no:1-3的多肽或其变体或免疫原性片段组合施用时，免疫原性片段应当能够在受试者中诱导保护性免疫应答，以抵抗随后的asfv攻击。
[0095]
seq id no:1-8的免疫原性片段或其变体可以是例如8至200个氨基酸，例如8至150个氨基酸，8至100个氨基酸，8至75个氨基酸，8至50个氨基酸，8至25个氨基酸，8至20个氨基酸，8至15个氨基酸或8至12个氨基酸。在一个实施方案中，seq id no:1-8的免疫原性片段或其变体的长度可以是例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。
[0096]
多核苷酸
[0097]
多核苷酸可以是任何合适的多核苷酸类型，如合成的rna/dna序列、cdna序列或部分基因组dna序列。
[0098]
如本发明所用，术语核酸序列和多核苷酸旨在彼此同义。“多核苷酸”一般是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的rna或dna或修饰的rna或dna。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链dna、作为单链和双链区域的混合物的dna、单链和双链rna、以及作为单链和双链区域的混合物的rna、包含dna和rna的杂合分子，所述杂合分子可以是单链的或更典型地是双链的或单链和双链区域的混合物。此外，“多核苷酸”指包含rna或dna或rna和dna的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一种或多种修饰碱基的dna或rna以及由于稳定性或其他原因具有修饰的骨架的dna或rna。“修饰的”碱基包括，例如，三甲基化的碱基和不寻常的碱基，如肌苷。dna和rna发生过多种修饰，因此，“多核苷酸”包括通常在自然界中发现的化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞特征的dna和rna的化学形式。“多核苷酸”还包括相对短的多核苷酸，通常称为寡核苷酸。
[0099]
术语“重组多核苷酸”用于表示多核苷酸是从其自然环境分离而来的，例如从asfv提取或在asfv之外产生。特别地，重组多核苷酸不在asfv的背景下提供，而是作为多核苷酸，即人工产生的dna或rna提供。
[0100]
技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，多种不同的多核苷酸可以编码相同的多肽。此外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响由本发明所述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映要在其中表达多肽的任何特定宿主生物的密码子使用。
[0101]
术语“变体”是指与目的序列不同的天然存在的核酸序列。变体可与目的序列具有至少70％或更高的序列同一性，并且包含20种突变。
[0102]
本技术的疫苗可包含一种或多种多核苷酸，其编码根据本发明疫苗的重组多肽的组合。
[0103]
编码seq id no:1-8中的每种多肽的示例性多核苷酸如表2所示。
[0104]
本发明的疫苗可以包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码如seq id no:1、2和3所示的重组多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:1、2和3之一或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
[0105]
本发明的疫苗可以包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码如seq id no:1、2和3所示的重组多肽；或与seq id no:1、2和/或3之一具有至少70％序列同一性的变体。在一个实施方案中，疫苗可以由一种或多种多核苷酸组成，所述多核苷酸编码如seq id no:1、2和3所示的重组多肽；或与seq id no:1、2和/或3之一具有至少70％序列同一性的变体。
[0106]
疫苗还可以包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自seq id no:4-8的一种或多种多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:4-8之一或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
[0107]
疫苗还可以包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自seq id no:4-8的一种或多种多肽或与seq id no:4-8之一具有至少70％序列同一性的变体。
[0108]
疫苗可以包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码至少2种、至少3种、至少4种或至少5种选自seq id no:4-8的多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:4-8之一具有至少70％序列同一性的变体。
[0109]
疫苗可以包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码2种、3种、4种或5种选自seq id no:4-8的多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:4-8之一或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
[0110]
适当地，疫苗可以包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码包含seq id no:1-8的重组多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:1-8或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
[0111]
适当地，疫苗可以包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码包含seq id no:1-3和6-8的重组多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:1-3和6-8或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
[0112]
适当地，疫苗可以包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码包含seq id no:1-5的重组多肽或其免疫原性片段；或与seq id no:1-5或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
[0113]
编码如seq id no:1-3所示的多肽或其变体的多核苷酸可分别包含seq id no:9-11；或其与seq id no:9-11之一具有至少70％序列同一性的变体。
[0114]
编码如seq id no:1所示的多肽或其变体的多核苷酸可包含seq id no:9；或其与seq id no:9至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的变体。
[0115]
编码如seq id no:2所示的多肽或其变体的多核苷酸可包含seq id no:10；或其与seq id no:10至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的变体。
[0116]
编码如seq id no:3所示的多肽或其变体的多核苷酸可包含seq id no:11；或其与seq id no:11至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的变体。
[0117]
编码如seq id no:4-8所示的多肽或其变体的多核苷酸可分别包含seq id no:12-16；或其与seq id no:12-16之一具有至少70％的序列同一性的变体。
[0118]
编码如seq id no:4所示的多肽或其变体的多核苷酸可包含seq id no:12；或其与seq id no:12至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的变体。
[0119]
编码如seq id no:5所示的多肽或其变体的多核苷酸可包含seq id no:13；或其与seq id no:13至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的变体。
[0120]
编码如seq id no:6所示的多肽或其变体的多核苷酸可包含seq id no:14；或其与seq id no:14至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的变体。
[0121]
编码如seq id no:7所示的多肽或其变体的多核苷酸可包含seq id no:15；或其与seq id no:15至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的变体。
[0122]
编码如seq id no:8所示的多肽或其变体的多核苷酸可包含seq id no:16；或其与seq id no:16至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的变体。
[0123]
疫苗还可以包含一种或多种选自seq id no:4-8的多肽或与seq id no:4-8之一具有至少70％序列同一性的变体。
[0124]
适当地，疫苗还可以包含一种或多种包含seq id no:9-16的多核苷酸或与seq id no:9-16具有至少70％序列同一性的变体。
[0125]
适当地，疫苗还可以包含一种或多种包含seq id no:9-11和14-16的多核苷酸；或与seq id no:9-11和14-16具有至少70％序列同一性的变体。
[0126]
适当地，疫苗可以包含一种或多种包含seq id no:9-13的多核苷酸；或与seq id no:9-13或其免疫原性片段具有至少70％序列同一性的变体。
[0127]
组合
[0128]
本发明至少部分基于发明人对能够诱导针对asfv的防护的多肽或其免疫原性片段的最小组合的确定。
[0129]
应当理解，提及本发明提供的多肽或多肽组合意在同样适用于编码所述多肽的相应多核苷酸或多核苷酸组合。
[0130]
本发明的疫苗中不同的asfv多肽(或由一种或多种重组多核苷酸编码)的总数为10或更少。
[0131]
适当地，不同的asfv多肽的数量为9或更少，8或更少，7或更少，或6或更少。
[0132]
适当地，不同的asfv多肽的数量为3、4、5、6、7或8。
[0133]
适当地，不同的asfv多肽的数量为3。
[0134]
适当地，不同的asfv多肽的数量为5。
[0135]
适当地，不同的asfv多肽的数量为6。
[0136]
适当地，不同的asfv多肽的数量为8。
[0137]
载体
[0138]
如本发明所用，“载体”可以是能够在宿主细胞中递送或维持核酸的任何试剂，并且包括病毒、细菌和真核载体、质粒、裸核酸、与多肽或其他分子复合的核酸以及固定在固相颗粒上的核酸。
[0139]
根据本发明的多核苷酸可以通过病毒或非病毒技术递送。
[0140]
非感染性递送系统包括但不限于dna转染方法。在此，转染包括使用非感染性载体将本发明的核酸递送至靶细胞的过程。
[0141]
典型的转染方法包括电穿孔、核酸基因枪法、脂质介导的转染、压缩核酸介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂转染蛋白、阳离子试剂介导、阳离子表面两亲物(cfa)、多价阳离子如精胺、阳离子脂质或聚赖氨酸、1,2,-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(dotap)-胆固醇复合物及其组合。
[0142]
非病毒递送系统还可以包括但不限于细菌递送系统。细菌先前已被用作抗癌剂和抗癌药物的递送剂。
[0143]
细胞粘附分子是一大类参与各种细胞间相互作用和细胞与细胞外基质(ecm)相互作用的分子，并被开发为用作多种病原微生物进入细胞的受体。这些分子可用于靶向和吸收基因和药物递送系统。
[0144]
基因枪递送系统也可用于dna的递送。
[0145]
病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、改良的安卡拉牛痘病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、疱疹病毒载体如假狂犬病病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或杆状病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒(vee)、痘病毒例如金丝雀痘病毒、昆虫痘病毒、企鹅甲病毒以及基于甲病毒的dna载体。
[0146]
在一个实施方案中，载体可以是腺病毒载体。
[0147]
腺病毒是一种双链线性dna病毒，不能通过rna中间体复制。基于其遗传序列，超过50种不同的人类血清型腺病毒被分为6个亚组。
[0148]
腺病毒是双链dna无包膜病毒，能够在体内、离体和体外转导人类和非人类来源的多种细胞类型。这些细胞包括呼吸道上皮细胞、肝细胞、肌肉细胞、心肌细胞、滑膜细胞、原代乳腺上皮细胞和有丝分裂后终末分化的细胞，例如神经元。腺病毒载体也能够转导非分裂细胞。
[0149]
腺病毒已被用作基因治疗和异源基因表达的载体。大(36kb)基因组可容纳最高8kb的外来插入dna，并且能够在互补细胞系中有效复制，以产生最高1012个转导单位/ml的非常高的滴度。因此，腺病毒是研究原代非复制细胞中基因表达的最佳系统之一。来自腺病毒基因组的病毒或外源基因的表达不需要复制的细胞。腺病毒载体通过受体介导的内吞作用进入细胞。一旦进入细胞，腺病毒载体很少整合到宿主染色体中。相反，它们作为宿主细胞核中的线性基因组以游离形式(独立于宿主基因组)发挥作用。
[0150]
在一个实施方案中，载体可以是修饰的安卡拉牛痘(mva)载体。mva病毒与痘病毒科(poxviridae)正痘病毒属(orthopoxvirus)的成员牛痘(vaccinia)病毒有关。mva病毒是由安卡拉绒毛膜牛痘(chorioallantois vaccinia ankara)(cva)病毒在鸡胚成纤维细胞
上的516次连续传代产生的。在以鸡衍生材料作为生产底物的通过反复传代进行的减毒过程中，mva病毒在多个位点丢失了大约15％的基因组dna(mayr和munz 1964年于zentralbl bakteriol orig 195,24-35；meyer等人1991年于j gen virol 72(pt 5),1031-1038)。已经分析了mva病毒以确定其基因组相对于野生型cva毒株的改变。已鉴定出基因组dna的6种主要缺失(缺失i、ii、iii、iv、v和vi)，总计31000个碱基对(meyer等人1991年于j gen virol 72(pt 5),1031-1038)。mva不会在人类和非人类灵长类动物细胞中复制。
[0151]
牛痘载体的替代物包括禽痘载体，例如禽痘(fowlpox)或被称为alvac的金丝雀痘(canarypox)，以及由此衍生的可以感染并在人类细胞中表达重组蛋白但不能复制的毒株。
[0152]
其他载体的实例包括离体递送系统，其包括但不限于dna转染方法，例如电穿孔、dna基因枪法、脂质介导的转染和压缩dna介导的转染。
[0153]
载体可以是质粒dna载体。如本发明所用，“质粒”是指用于将异源dna引入细胞以进行其表达或复制的独立组分。
[0154]
在一个实施方案中，载体可以包含多于一种核酸序列，每种核酸序列编码用于本发明疫苗中的所述的不同多肽。
[0155]
适当地，一种或多种载体可以包含多种核酸序列，所述核酸序列之间编码用于本发明疫苗中的所述多肽的组合。
[0156]
在一个实施方案中，载体可以包含多于一种核酸序列，使得载体包含彼此之间编码用于本发明疫苗中的所述多肽的组合的核酸序列。
[0157]
为了使多于一种核酸序列表达，载体内可存在两个或多个转录单位，每个转录单位对应每种核酸序列。在一个实施方案中，内部核糖体进入位点(ires)用于启动多顺反子信息中的第二(和随后的)编码序列的翻译(adam等人1991j.virol.65,4985)。
[0158]
ires元件向逆转录病毒载体中的插入与逆转录病毒复制周期兼容，并允许由单个启动子表达多个编码区(adam等人(如上)；koo等人(1992)virology 186：669-675；chen等人1993j.virol 67:2142-2148)。ires元件首先在小核糖核酸病毒的非翻译5’末端发现，其促进病毒蛋白的非帽依赖性翻译(jang等人(1990)enzyme 44:292-309)。当位于rna中的开放阅读框之间时，ires元件通过促进核糖体在ires元件处的进入，随后启动下游翻译，从而允许下游开放阅读框的有效翻译。
[0159]
mountford和smith(tig may 1995 vol 11,no 5:179-184)对ires进行了综述。许多不同的ires序列是已知的，包括来自脑心肌炎病毒(emcv)(ghattas,i.r.等人,mol.cell.biol.,11:5848-5859(1991)；bip蛋白[macejak和sarnow,nature 353:91(1991)]；果蝇的触角足基因(外显子d和e)[oh等人,genes&development,6:1643-1653(1992)]以及脊髓灰质炎病毒(pv)[pelletier和sonenberg,nature 334:320-325(1988)；另见mountford和smith,tig 11,179-184(1985)]的ires。
[0160]
术语“ires”包括任何作为ires或改善ires功能的序列或序列的组合。
[0161]
ires可以是病毒来源的(例如emcv ires、pv ires或fmdv 2a样序列)或细胞来源的(例如fgf2 ires、nrf ires、notch 2ires或eif4 ires)。
[0162]
为使ires能够启动每个多核苷酸的翻译，其应该位于载体基因组中的多核苷酸之间或之前。
[0163]
多核苷酸可以编码包含两种或更多种用于本发明疫苗的免疫原性多肽的多肽，其
中每种多肽通过切割位点连接。切割位点可以是自切割的，这样当多肽产生时，其立即被切割成单独的免疫原性多肽，而不需要任何外部切割活性。
[0164]
已知多种自切割位点，包括口蹄疫病毒(fmdv)2a自切割肽，其具有如下所示的序列：
[0165]
seq id no:19
[0166]
raegrgslltcgdveenpgp
[0167]
或者
[0168]
seq id no:18
[0169]
qctnyallklagdvesnpgp
[0170]“自切割肽”是指具有以下功能的肽，当包含用于本发明疫苗的两种或更多种多肽的新生多肽和自切割肽产生时，其立即被“切割”或分离成不同的离散asfv多肽，而不需要任何外部切割活性。
[0171]
在其中多肽包含用于本发明疫苗的多种asfv多肽(例如三种或更多种asfv多肽)的实施方案中，在每种asfv多肽之间可以存在自切割多肽。适当地，在第一和第二asfv多肽、第二和第三asfv多肽等之间可以存在自切割多肽。
[0172]
自切割肽可以是来自口疮病毒(aphtho-)或心脏病毒(cardiovirus)的2a自切割肽。口疮病毒或心脏病毒的初级2a/2b切割由在其自身c端的2a“切割”介导。在例如口蹄疫病毒(fmdv)和a型马鼻炎(equine rhinitis a)病毒等的口蹄疫病毒中，2a区域是约18个氨基酸短区段，其与蛋白质2b的n端残基(保守的脯氨酸残基)共同表示能够在其自身的c末端介导“切割”的自主元件。
[0173]
可以使用控制序列控制核酸序列的表达，控制序列包括启动子/增强子和其他表达调节信号。可以使用原核启动子和在真核细胞中起作用的启动子。可以使用组织特异性或刺激特异性启动子。还可以使用包含来自两个或更多个不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
[0174]
合适的启动序列是强启动子，其包含来自病毒基因组，例如多瘤病毒、腺病毒、禽痘病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(cmv)、逆转录病毒和猿猴病毒40(sv40)的启动子，或来自异源哺乳动物的启动子，例如肌动蛋白启动子、ef1a、cag、tk、sv40、泛素、pgk或核糖体蛋白启动子。替代地，组织特异性启动子，如视紫红质(rho)、视紫红质激酶(rhok)、含有锥杆同源框的基因(crx)、神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(nrl)、卵黄样黄斑营养不良2(vmd2)、酪氨酸羟化酶、神经元特异性神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子、星形胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白(gfap)启动子、人α1-抗胰蛋白酶(haat)启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pepck)、肝脂肪酸结合蛋白启动子、flt-1启动子、inf-β启动子、mb启动子、sp-b启动子、syn1启动子、wasp启动子、sv40/halb启动子、sv40/cd43、sv40/cd45、nse/ru5’启动子、icam-2启动子、gpiib启动子、gfap启动子、纤连蛋白启动子、内皮糖蛋白启动子、弹性蛋白酶1启动子、结蛋白启动子、cd68启动子、cd14启动子和b29启动子可用于驱动转录。
[0175]
通过将增强子序列插入载体可以进一步增加基因的转录。增强子是相对方向独立的和位置独立的；然而，可以使用来自真核细胞病毒的增强子，例如复制起点(bp 100-270)晚期的sv40增强子和cmv早期启动子增强子。增强子可以在启动子的5’或3’位处剪接到载
体中，但优选位于启动子的5’位点。
[0176]
启动子可以另外包括用于确保或增加在合适靶细胞中表达的特征。例如，该特征可以是保守区域，例如pribnow框或tata框。启动子可以包含其他序列以影响(例如维持、增强或降低)核苷酸序列的表达水平。合适的其他序列包括sh1-内含子或adh内含子。其他序列包括诱导元件，例如温度、化学、光或应力诱导元件。此外，可存在增强转录或翻译的合适元件。
[0177]
疫苗
[0178]
如本发明所用，术语“疫苗”是指当施用于受试者时诱导或刺激保护性免疫应答的制剂。疫苗可以使生物体对特定疾病，例如在本例中的asf，产生免疫力。本发明的疫苗因此在受试者中诱导免疫应答，该免疫应答对随后的asfv攻击具有保护性。
[0179]
本发明的疫苗可包含如本发明所述的载体、重组多肽和/或重组多核苷酸。
[0180]
在一个实施方案中，本发明的疫苗包含如本发明所述的多种载体、重组多肽和/或重组多核苷酸。
[0181]
术语“多种”在本文中用于表示多于一种如本发明所述的载体、重组多肽和/或重组多核苷酸。例如，多种可以是指如本文所限定的两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种重组多肽和/或重组多核苷酸。
[0182]
疫苗可用于预防非洲猪瘟。
[0183]
疫苗组合物可任选地包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的给药途径和标准药学实践来选择。疫苗组合物可以包含作为(或除了)载体、赋形剂或稀释剂、任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂和其他可能有助于或增加疫苗递送或免疫原性的载体剂。
[0184]
例如，这种制剂可以是适合于口服、静脉内、肌肉内、皮下、鼻内、皮内给药或栓剂途径或植入(例如使用缓释分子)的形式。
[0185]
疫苗可另外包含佐剂。佐剂的实例包括但不限于铝盐、油乳剂和细菌组分(例如lps和脂质体)。
[0186]
预防/治疗方法
[0187]
本发明还提供了通过施用有效量的本发明疫苗来预防和/或治疗受试者的asf的方法。
[0188]
本发明进一步提供了本发明第一方面的疫苗，其用于治疗和/或预防asf。
[0189]
术语“预防”旨在指避免、延迟、阻止或阻碍asf的感染。例如，疫苗可以预防或降低感染性asfv进入细胞的可能性。
[0190]
术语“治疗”旨在指减少或减轻现有asf感染的至少一种症状。
[0191]
施用
[0192]
疫苗可以以方便的方式施用，例如通过口服、静脉内、肌内、皮下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(例如使用缓释分子)。
[0193]
通常，兽医或生产者将确定最适合个体受试者或受试者组的实际剂量，并且其可能随着例如特定受试者的年龄、体重和反应而变化。该剂量因而足以减轻和/或预防疾病症状。
[0194]
本领域技术人员将理解，例如，递送途径(例如，口服对静脉内对皮下对瘤内等)可
能影响剂量和/或所需剂量可能影响递送途径。例如，对于感兴趣的在特定位点或位置(例如，肿瘤内)内特别高浓度的药剂，集中递送(例如，在该示例中，肿瘤内递送)可能是期望的和/或有用的。当优化给定治疗方案的路线和/或给药方案时要考虑的其他因素可以包括，例如，正在治疗的特定癌症(例如，类型、阶段、位置等)、受试者的临床状况(例如，年龄、整体健康状况等)、联合治疗的存在与否、以及医生已知的其他因素。
[0195]
该剂量因而足以稳定或改善疾病的症状。
[0196]
可以根据初免-加强方案施用疫苗。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间后(例如3至21天、3至14天、5至14天或5至7天)接受第二次加强施用。例如，受试者可以在第一次接种后约3、5、7、14或21天接受第二次加强施用。
[0197]
在一个实施方案中，第一次接种可以作为一种或多种如本发明所述的腺病毒载体施用；并且第二次接种可以作为本发明限定的一种或多种mva载体施用。通常，加强施用的剂量高于初免施用。
[0198]
对于所有的脊椎动物用途，载体、免疫原性组合物或疫苗可以通过注射例如皮下或肌肉内非肠道给药。适用于其他给药方式的其他制剂包括栓剂和口服制剂。在免疫原性组合物或疫苗被冻干的情况下，冻干材料可以在施用之前重构，例如作为悬浮液。
[0199]
受试者
[0200]
受试者可以是易受asf感染的任何动物。asf易感动物包括家猪、疣猪、丛林猪和蜱。
[0201]
根据本发明的接种受试者可以是家猪。
[0202]
受试者可以易受asf感染。
[0203]
当疫苗用于治疗已确定的感染时，受试者可已被诊断为疾病阳性和/或表现出与感染相关的一种或多种症状。
[0204]
本公开不受本发明公开的示例性方法和材料的限制，并且与本发明所述的那些相似或等效的任何方法和材料都可以用于本公开的实施方案的实践或测试。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均以5’至3’方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。
[0205]
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确说明，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值至下限单位的十分之一也被具体公开。任何规定值或规定范围内的中间值与该规定范围内的任何其他规定或中间值之间的每个较小范围都包含在本公开内容内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括或排除在该范围内，并且其中任一限制、无一限制或两个限制均不包括在较小范围内的每个范围也包括在本公开内，但受制于规定的范围中任何明确排除的限制。在所述范围包括限制之一或两者的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本公开中。
[0206]
必须注意，如本发明和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
[0207]
如本发明所用的术语“包含”和“包括”与“具有”、“含有”或者“有”同义，并且是包含性或开放式的，并且不排除额外的、非列举的成员、元素或方法步骤。术语“包括”、“包含”和“含有”还包括术语“由...组成”。
[0208]
本发明所讨论的出版物仅因为它们在本技术的提交日期之前的公开而提供。本发
明中的任何内容均不应被解释为承认此类出版物构成所附权利要求的现有技术。
[0209]
现将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明并且不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
[0210]
实施例1-用亚基asfv多肽库对猪进行免疫并用asfv攻击
[0211]
将编码不同asfv多肽的各种多核苷酸分别克隆到重组腺病毒和修饰的安卡拉牛痘(mva)载体中。除了ep153r和mgf360-11l来自基因型i毒株benin 1997/1之外，克隆的序列来自基因型i ourt88/3菌株。
[0212]
10组猪如表1所示进行免疫。
[0213]
实验ar000737和ar000742中的猪用5e9 iu的腺病毒和7.5e7 pfu的mva进行初免。实验ar000750和ar000858中的猪用1.5
×
10
10
个感染单位的每种重组腺病毒载体进行初免，并用2
×
108个噬斑形成单位的每种重组mva载体进行加强免疫。
[0214]
表1中提供了抗原的不同组合、用于初免和加强剂量的载体以及诱导保护作用的详细信息。
[0215]
b602l、e183l和ep153r存在于攻击后观察到保护作用的所有组中。保护作用在当动物没有达到研究的预定人道终点时确定。
[0216]
然而，b602l和ep153r还存在于没有观察到保护作用的实验2的库b中。e183l存在于攻击后观察到保护作用的实验4的库5中。因此，单独的b602l和ep153r的组合不足以单独提供保护，同样，单独的e183l也不足以提供保护。
[0217]
材料&方法
[0218]
材料和方法
[0219]
非洲猪瘟病毒和细胞
[0220]
our t88/1分离株在来自猪骨髓的原代巨噬细胞中生长。从来自感染的猪的脾悬浮液制备病毒原种，通过使用血液吸附检测病毒感染细胞的有限稀释来确定滴度，并通过spearman-karber方法计算滴度。
[0221]
猪免疫和攻击
[0222]
猪来自良好健康状况农场的远系杂交大白猪长白猪，或远系杂交白猪长白猪和汉普郡猪。实验开始时猪的平均体重为20kg。
[0223]
重组腺病毒(rad)和修饰的安卡拉牛痘病毒通过肌内注射在两个不同的部位以至多5ml的总体积递送。mva或rad加强免疫在初始rad初免后4周递送至猪。加强免疫后四至八周，用104had
50 georgia 2007/1病毒对猪进行肌内攻击。观察猪的临床症状发展，并使用先前使用的评分系统对这些症状进行评分。收集血液和组织样品以测量病毒复制水平。
[0224]
上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应当理解，所要求保护的发明不应被过度地限制于这些具体的实施方案。实际上，对本领域技术人员显而易见的用于实施本发明的所述方式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。