一种具有皮肤美白淡斑作用的组合物及其护肤品的制作方法

本发明涉及护肤用品
技术领域：
，提供了一种具有美白淡斑作用的组合物及其护肤品。
背景技术：
：长期以来，肤色与亚洲文化对青春和美丽的诠释密不可分。在亚洲国家，特别是在中国，印度和日本的市场推动下，美白剂的需求与投资逐年增加。皮肤的颜色受许多内在因素的影响，包括皮肤类型和遗传背景，以及外在因素，包括日光照射的程度和环境污染。皮肤的颜色取决于黑素体的数量及其在皮肤中的分散程度。在生理条件下，色素沉着可以保护皮肤免受有害的紫外线伤害。然而，过量产生黑色素的可导诸多皮肤美学问题，包括晒斑、黄褐斑，雀斑、老年斑、妊娠斑和炎症后色素沉着等。皮肤色素沉着的重要因素是皮肤黑色素细胞中黑色素的产生。黑色素生成是一个复杂的过程，涉及黑色素体内部的一系列酶促反应和化学反应，具体为l-酪氨酸通过酪氨酸酶和其他中间产物的催化作用转化为l-dopa，然后转化为l-多巴醌。l-多巴醌经过分子内环化和氧化，进而形成黑色素。中国专利申请cn110974720a公开了一种美白亮肤组合物，其下质量份数的组分：羟基酪醇0.1～1.5份，凝血酸0.1～1.5份，烟酰胺0.1～3.0份，肌肽0.01～2.0份，包裹水杨酸0.01～1.0份。中国专利申请cn110302136a公开了一种美白护肤组合物，其重量份数如下：0.01-0.2份尿囊素、0.01-3份凝血酸、0.01-2份烟酰胺、0.01-0.1份4-甲氧基水杨酸钾盐和0.01-2.5份芽孢杆菌发酵产物。传统的美白淡斑组合物只能从一个或几个方面发挥美白功效。本发明所述组合物能够选择性抑制酪氨酸酶的活性、清除自由基、抗糖基化、抑制黑色素转移、促进黑色素的代谢从而全方位、多途径、多靶点减少色素沉着过多，同时又避免了对正常健康的黑素细胞的细胞毒性。技术实现要素：针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种具有美白淡斑功效的组合物及其护肤品，本发明基于能够选择性抑制酪氨酸酶的活性、清除自由基、抗糖基化、抑制黑色素转移、促进黑色素的代谢从而全方位、多途径、多靶点减少色素沉着过多，同时又避免了对正常健康的黑素细胞的细胞毒性。为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种具有美白淡斑作用的组合物，包括白藜芦醇、肌肽、十肽-12、烟酰胺和4msk。进一步地，所述白藜芦醇、肌肽、十肽-12、烟酰胺和4msk的重量比为1～5:1～3:1～3:1～3:1～2。进一步地，所述白藜芦醇、肌肽、十肽-12、烟酰胺和4msk的重量比为4:2:2:2:1。其中，十肽-12(tyr-arg-ser-arg-lys-tyr-ser-ser-trp-tyr，也称为十肽p4)能有效抑制酪氨酸酶的合成，从而有效减少黑色素的生成，并且对细胞无毒性；白藜芦醇作为黄酮类化合物，不仅可以降低酪氨酸酶活性，还可以降低b16小鼠黑色素瘤细胞中mitf基因的表达；烟酰胺通过影响黑色素细胞与角质形成细胞之间的细胞间通讯来抑制黑色素小体由黑色素细胞向角质形成细胞的转运，从而下调黑色素合成；4msk(4-甲氧基水杨酸钾盐)能影响角质形成细胞的增殖分化，改善紫外线导致的角质形成细胞分化失衡的状态，促进黑色素的排出，达到皮肤光滑、增白，同时4msk能抑制酪氨酸酶活性，抑制黑色素的生成；肌肽(β-丙氨酰-l-组氨酸)，是一种较强的自由基清除剂，能够中和攻击细胞膜蛋白的羰基，防止损伤性已交联的形成，并通过与糖的反应来代替皮肤纤维蛋白被糖基化，可以改善皮肤泛黄，提亮肤色。另外，本发明还保护了所述的具有美白淡斑作用的组合物在用于制备美白淡斑护肤品中的应用，尤其是针对晒斑、妊娠斑，所述美白淡斑护肤品为精华液、精华乳。针对现有技术存在的不足，本发明的第二目的在于提供一种具有美白淡斑作用的精华液，具有全方位、多途径、多靶点减少色素沉着过多，同时又避免了对正常健康的黑素细胞的细胞毒性。一种具有美白淡斑作用的精华液，包括以下百分含量计的制备原料：所述的具有美白淡斑作用的组合物5～12％、保湿剂3.2～14.5％、ph调节剂0.01～0.15％和水73.35～91.79％。进一步地，所述的保湿剂至少包括芦荟胶、透明质酸钠中的一种；所述ph调节剂至少包括乳酸和氨甲基丙醇中的一种；所述精华液ph值范围为3.0～8.0。通过在护肤品中加入5～12％百分含量的由白藜芦醇、肌肽、十肽-12、烟酰胺和4msk按照一定比例组成具有美白淡斑作用的组合物，各组分具有明显的协同作用，能够基于黑色素生成相关机理，有效的抑制酪氨酸酶的活性、清除羟自由基，提高组合物的抗氧化性能，同时能够抑制黑色素转移，还能够促进黑色素的代谢，从而全通路、多途径、多靶点地达到美白淡斑效果。另外，向所述的精华液中加入乳酸和氨甲基丙醇等ph调节剂，调节护肤品的ph值范围为3.0～8.0，优选调节护肤品的ph值为5.0～7.0，使得制备得到的护肤品质量较佳。另外，本发明还提供了一种具有美白淡斑作用的精华乳的制备方法，包括以下步骤：1)将乳化剂投入溶解锅中，加热至70～80℃，均匀溶解后保温，制成a相；2)将保湿剂、抗氧化剂加入水中，加热至90～100℃，充分溶解，然后冷却至70～80℃，制成b相；3)然后将步骤1)制成的a相缓慢加入步骤2)制成的b相中，维持温度70～80℃，搅拌10～15min，控制搅拌速率为30～60rpm，接着进行高速均质5～10min，再保温搅拌15～30min，控制搅拌速率为60～80rpm；4)冷却温度至40～50℃，加入精华液、ph调节剂，搅拌均匀，得具有美白淡斑作用的护肤品。进一步地，所述乳化剂为山梨坦橄榄油酸酯、n～棕榈酰羟基脯氨酸鲸蜡酯、棕榈酸乙基己酯、辛酸/癸酸甘油三酯、尿囊素中的至少一种。进一步地，所述保湿剂为丁二醇、芦荟胶、水解透明质酸钠中的至少一种；所述抗氧化剂为苯氧乙醇。进一步地，所述ph调节剂至少包括乳酸和氨甲基丙醇中的一种；所述护肤品ph值范围为3.0～8.0。进一步地，本发明提供的具有美白淡斑作用的精华乳通过加入芦荟胶、透明质酸纳、尿囊素等保湿剂，使得护肤品滋润性较佳，增强皮肤的水分，在护肤品中加入山梨坦橄榄油酸酯、棕榈酸乙基己酯、n～棕榈酰羟基脯氨酸鲸蜡酯和辛酸/癸酸甘油三酯等构成的乳化剂，使得护肤品中的原料可以较为均匀的分布，增强护肤品的稳定性能。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明提供的具有美白淡斑作用的组合物包括白藜芦醇、肌肽、十肽-12、烟酰胺、4msk。基于黑色素生成相关机理，具体采用具有抑制酪氨酸酶的活性的白藜芦醇和十肽-12、清除自由基能力和抗糖基化的肌肽、抑制黑色素转移的烟酰胺、促进黑色素的代谢的4msk，从而全通路、多途径、多靶点地达到美白效果。(2)通过添加本发明提供的具有美白淡斑作用的组合物能够广泛用于制备祛除晒斑，妊娠斑的护肤品中，复配制得的美白淡斑精华液、精华乳、面膜或面霜，具有美白淡斑，提亮肤色的作用。附图说明图1为实施例2组合物对b16f10细胞毒性实验的结果图；图2为实施例2组合物对b16f10细胞内酪氨酸酶活性的影响结果图；图3为实施例2组合物对b16f10细胞黑色素含量的影响结果图；图4不同浓度实施例2组合物对体外酪氨酸酶活性抑制率的影响(阳性对照：α-熊果苷(200μg/ml))；图5不同浓度实施例2组合物对体外酪氨酸酶活性抑制率的影响曲线(阳性对照：α-熊果苷(200μg/ml))；图6不同浓度实施例2组合物对羟自由基的清除率的影响(阳性对照：vc(100μg/ml))；图7不同浓度实施例2组合物对羟自由基的清除率的影响曲线(阳性对照：vc(100μg/ml))；图8同时使用实施例5、实施例8产品前后ita°的变化；图9同时使用实施例5、实施例8产品前后前后mi值的变化。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。其中，本发明所用试剂均为常用试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买。以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。注：以下各个护肤品的质量百分含量总和为100％；附图中*表示受检样品在该浓度作用下与空白处理组对比有显著性差异：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001实施例1～3：实施例1～3提供了本发明具有皮肤美白淡斑作用的组合物，所述组合物的配方如下表1所示。表1实施例1～3的具有皮肤美白淡斑作用的组合物的配方组分实施例1实施例2实施例3白藜芦醇145肌肽321十肽p4321烟酰胺3214msk211所述例1～3的组合物的制备方法为：分别按表1所示配方表称量白藜芦醇、肌肽、十肽-12、烟酰胺和4msk混合备用。实施例4～6、美白淡斑精华液本发明实施例4～6美白淡斑精华液的配方如表2所示。表2实施例4～6的美白淡斑精华液的配方注：“～”代表未添加至美白淡斑精华液中。所述的实施例4～6美白淡斑精华液的制备方法，包括以下步骤：1)将透明质酸钠成分加入到水中，搅拌均匀，加热至80～85℃，保温搅拌使其分散均匀，充分溶解；2)将温度降到40℃，然后再向步骤1)中加入甘油、神经酰胺3、辛甘醇和组合物，维持温度40℃，搅拌15min，搅拌速率为60rpm，使用氨甲基丙醇调节溶液的ph值至5.5，得美白淡斑精华液。实施例7～9、美白淡斑精华乳本发明实施例7～9美白淡斑精华乳的配方如表3所示。表3实施例7～9美白淡斑精华乳的配方注：“～”代表未添加至美白淡斑精华乳中。所述的美白淡斑精华乳的制备方法，包括以下步骤：1)将山梨坦橄榄油酸酯、n～棕榈酰羟基脯氨酸鲸蜡酯、棕榈酸乙基己酯、辛酸/癸酸甘油三酯、尿囊素等成分投入溶解锅中，加热至80℃，均匀溶解后保温，制成a相；2)将丁二醇、苯氧乙醇和水解透明质酸钠等成分加入去离子水中，加热至90℃，充分溶解，然后冷却至80℃，制成b相；3)然后将步骤1)制成的a相缓慢加入步骤2)制成的b相中，维持温度70～80℃，搅拌15min，控制搅拌速率为60rpm，接着进行高速均质10min，再保温搅拌30min，控制搅拌速率为80rpm；4)冷却温度至40℃，加入c相、d相，调节溶液ph值为5.6，搅拌均匀后出料得美白淡斑精华乳，以每小瓶15ml的体积分装成100小瓶。试验例一、b16f10细胞毒性试验1.试验材料：本发明实施例2的组合物2.试验方法：取对数生长期b16f10细胞，用胰酶(0.25％，含edta)消化，离心，以1*105个/ml密度接种于96孔板，每孔100μl细胞悬液。铺板24h后，弃除旧培养基，用pbs洗两遍，加入含有0.08％、0.16％、0.31％、0.63％、1.25％、2.5％、5％、10％浓度的实施例2的组合物于96孔板中，并把加好样的96孔板置于co2培养箱中，经过24h、48h后，用cck-8法在酶标仪下以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果，由公式(1)计算细胞存活率。细胞存活率＝(试验孔od450-空白空od450)/(对照孔od450-空白空od450)×100％(1)3、试验结论：由图1可知，在加样24h后，浓度在0.08～1.25％所对应的细胞生存率约在94～101％之间，几乎是无毒剂量，随着实施例2的组合物的浓度的逐渐升高，实施例2的组合物作用于b16f10小鼠源黑色素瘤细胞的细胞生存率也逐渐成降低的趋势。加样48h后，浓度在0.08～1.25％所对应的细胞生存率约在88～99％之间，且呈一定的浓度依赖性。由试验例一b16f10细胞毒性试验，可以得出实施例2的组合物设定的浓度梯度在0.08％、0.31％、1.25％时，对b16f10细胞几乎无毒性，可用于b16f10细胞内酪氨酸酶活性试验和b16f10细胞黑色素含量试验。试验例二、b16f10细胞内酪氨酸酶活性试验1、试验材料：本发明实施例2的组合物2、试验方法：取对数生长期b16f10细胞，用胰酶(0.25％，含edta)消化，离心，以1*105个/ml密度接种于96孔板，每孔100μl细胞悬液。铺板24h后，弃除旧培养基，用pbs洗两遍，加入含有0.08％、0.31％、1.25％浓度的实施例2的组合物于96孔板中，并把加好样的96孔板置于co2培养箱中，待加样处理48h后，弃去上清，用pbs洗两遍，每孔加入90μl含1％tritonx-100的pbs缓冲液和10μl1mg/ml的左旋多巴，恒温孵育箱37℃孵育60min后，选择475nm波长，用酶标仪测定各孔od值，记录测定结果，由公式(2)计算细胞内酪氨酸酶的活性。3、试验结论：由图2可知，在加样48h后，浓度在1.25％所对应的细胞生存率约88％，b16f10细胞内酪氨酸酶活性约72％，抑制率约28％，与空白组有显著性。试验例三、b16f10细胞黑色素含量试验1、试验材料：本发明实施例2的组合物2、试验方法：取对数生长期b16f10细胞，用胰酶(0.25％，含edta)消化，离心，以1*106个/ml接种于6孔培养板，每孔2ml细胞悬液。铺板24h后，弃除旧培养基，用pbs洗两遍，加入含有不同浓度的实施例2的组合物于6孔培养板中，每个浓度设置3个复孔，对照组不加药物，用等量的新鲜培养液替换，置于二氧化碳培养箱继续培养。48h后弃上清，用pbs洗两遍，用胰酶(0.25％，含edta)消化后收集细胞于离心管中，离心，弃上清，向ep管中各加入1ml含有10％dmso的1moi/lnaoh溶液裂解细胞，于80℃水浴中孵育1h。分别移入96孔培养板中，酶标仪在405nm处测定吸光度，记录测定结果，由公式(3)计算细胞内黑色素的含量。3、试验结论：由图3可知，在加样48h后，浓度在1.25％所对应的细胞生存率约88％，黑色素含量约67.5％，对黑色素生成抑制率约32.5％，与空白组有显著性。试验例四、组合物对体外酪氨酸酶活性抑制试验1、试验材料：本发明实施例2的组合物2、试验方法：在96孔酶标板上加入80μl不同浓度梯度的实施例2的组合物，再加入预先在37℃保温的100μll-酪氨酸溶液(2mmol/l)，在37℃恒温培养箱中放置10min后，加入40μl酪氨酸酶溶液(40μg/ml)，混匀，继续在37℃反应10min，然后在酶标板迅速测定反应混合液在492nm处的吸光度值ac1，ac2，at1，at2。按公式(4)计算样品对酪氨酸酶活性的抑制率。式中，ac1为加酶而未加样品的反应混合液在492nm处的吸光度值；ac2为未加酶和样品的反应混合液在492nm处的吸光度值；at1为同时加酶和样品的反应混合液在492nm处的吸光度值；at2为同时加样品而未加酶的反应混合液在492nm处的吸光度值。3、试验结论：由图4可知，0.16～10％浓度的实施例2的组合物对体外酪氨酸酶活性抑制率约在13～96％范围内，具有显著的抑制作用，且呈一定的浓度依赖性；由图5可知，实施例2的组合物对体外酪氨酸酶活性抑制率的ic50值约为1.386％。试验例五、组合物对羟自由基清除试验1、试验材料：本发明实施例2的组合物2、试验方法：在96孔酶标板上加入1.24mg/ml的水杨酸溶液10μl、2.5mg/ml的硫酸亚铁溶液10μl、超纯水200μl，再分别加入15μl不同浓度梯度的实施例2的组合物，最后加入10μl0.03％的h2o2启动反应。使用酶标仪37℃孵育15min后，在510nm下测定吸光值。对照组用同等体积的超纯水代替h2o2，空白组用同等体积的超纯水代替样品，按公式(5)计算样品对羟自由基清除率。式中：样品组的吸光度为ai；对照组的吸光度为aj；空白组的吸光度为a0。3、试验结论：由图6可知，0.31～10％浓度的实施例2的组合物对羟自由基具有显著的清除作用，且呈一定的浓度依赖性，其中10％的实施例2的组合物对羟自由基清除率约为99％，由图7可知，实施例2的组合物对羟自由基清除率的ic50值约为3.047％。试验例六、志愿者使用实施例5和实施例8产品28天后皮肤ita°变化1、主要仪器、试剂和耗材1.1设备：courage+khazaka皮肤黑色素和血红色素测试探头mexametermx18；分析天平：精度0.1mg。1.2试剂：纯水1.3耗材：无屑干面巾纸，乳胶指套，注射器或移液器。2、操作2.1试验条件和志愿者要求2.1.1测试环境条件1)测试环境温度:20℃～22℃，湿度：40％～60％，并进行实时动态监测。2)测试过程中的测试条件应保持一致，如：测试者、场所、仪器等2.1.2有效志愿者例数不低于30例。2.1.3志愿者条件选择同时符合下列要求的志愿者作为受试对象：1)18岁～60岁符合试验要求的志愿者；2)面颊(受试区域)平均ita值10～41之间。不能选择有以下情况者作为受受试者1)胎记、太田痣等先天或遗传性色素异常症者；2)接受过化学剥脱、整形重塑激光祛斑等美容手术者；3)近一周内使用影响皮肤颜色或近一个月内试用影响表皮色素沉着程度的制剂者；4)近一周使用抗组胺药或近一个月内使用免疫抑制剂者5)近两个月内受试部位应用任何抗炎药物者；6)受试者患有炎症性皮肤病临床未愈者；7)胰岛素依赖性糖尿病患者；8)正在接受治疗的哮喘或其它慢性呼吸系统疾病患者；9)在近6个月内接受抗癌化疗者；10)免疫缺陷或自身免疫性疾病患者；11)哺乳期或妊娠妇女12)双侧乳房切除及双侧腋下淋巴结切除者；13)在皮肤待测试部位由于瘢痕、色素、萎缩、鲜红斑痣或其它瑕疵而影响试验结果的判定者；14)参加其它的临床试验研究者；15)体质高度敏感者；16)非志愿参加者或不能按试验要求完成规定内容者。2.2测定步骤2.2.1测试前的准备同一试验，所有受试者的受试部位统一为面部或前臂曲侧。每次测试前，受试者统一清洁受试部位，并用无屑吸水干纸巾吸干。在符合标准的测试环境中静坐至少20min，不能喝水和饮料。受试部位暴露，保持放松，避免触碰受试部位。样品涂抹区域和对照区域随机分布在受试部位，且间隔至少2cm，分被在样品涂抹区域和对照区域标记测量区域，各测量区域面积2cm×2cm。确保样品涂抹区域和对照区域肤色及色素沉着程度无明显差异。2.2.2测定1)按照仪器使用说明校正仪器后进行测试。2)样品使用前，分别测量受试者样品涂抹区域的ita°值和黑素指数mi，在各测试区域内不同位置测量至少5次，取平均值作为初始值。3)受试者按照《样品使用说明》使用样品，样品的涂抹需完全覆盖各测量区域，约2.5mg/cm2。4)受试者在设定的测量时间点返回实验室，测量样品涂抹区域和对照区域的ita°值和黑素指数mi，在各测量区域内不同位置测量至少5次，取平均值。5)设定的测量时间至少点间隔应不少于1周，可根据产品评价需要测定不同的时间点，整个测是周期至少为4周。6)同一个测试者的测试必须使用同一仪器由同一个人完成7)化妆品测试时，使用自身使用产品前后对照。8)样品使用期间如受试者皮肤出现不良反应，应立即终止测试，并对受试者进行医治。对不良反应应予以记录。注：测试过程中应避免受试者皮肤发红导致的数值异常。2.3实验结果皮肤明亮度(暗黄度)ita°值：ita°值为皮肤个体类型角(individualtypologicalangle,ita°)。ita°值越大，皮肤越明亮，反之，皮肤越暗黄。图8表明，测试区域，使用本发明实施例5和实施例8的美白淡斑精华液、精华乳28天后ita°的变大，且ita°的变化呈显著性差异(p＝0.0013，p<0.01)，表示该样品具有美白、提亮肤色的效果。皮肤黑色素含量mi值：mi值(melaninindex)表征黑色素指数，数值范围为0～999，数值越大，皮肤黑色素含量越高。图9表明，测试区域，使用本发明实施例5和实施例8的美白淡斑精华液、精华乳28天后mi值变小，且mi值的变化呈显著性差异(p＝0.0308，p<0.05)，表示该样品具有美白淡斑效果。综上，通过化妆品人体美白淡斑功效评价，发现连续使用含有美白组合物的美白淡斑精华液和美白淡斑精华乳28天，具有美白淡斑提亮肤色的效果注：该判定标准不是化妆品美白淡斑功效判定的唯一方法。具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。当前第1页12