金硫化银蛋白复合水凝胶及其制备方法与应用

本发明涉及纳米材料技术领域，尤其涉及金硫化银蛋白复合水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术：

恶性肿瘤是人类生命健康的巨大威胁之一。随着医学的进步，各种疾病被成功攻克，人类寿命逐渐增长，然而恶性肿瘤仍是世界医学界久攻不下的顽疾。舌癌是口腔最常见的恶性肿瘤，恶性程度高，转移率高。目前舌癌的治疗是以手术为基础的综合治疗，包括放疗和化疗。然而，当肿瘤侵犯较深时，常需要进行半舌或全舌切除术，严重破坏运动、感觉和语言功能。化疗对全身治疗有效，但对局部治疗效果有限。局部放疗还会引起炎症以及对口腔周围神经的损伤等副作用。虽然手术技术和辅助治疗不断提高，但由于手术难度和治疗不敏感，目前舌癌患者的5年生存率仍为6.6％-11.7％。因此，建立一种既能抑制肿瘤增殖，又能减少对头颈部瘤旁重要的神经、血管等造成副损伤的有效、精确的非手术治疗策略尤其具有临床应用意义。

热消融技术因其毒性低、副作用少而在癌症治疗中广为人知。尤其是光热疗法(ptt)，由于近红外(nir)光的侵入性最小、穿透深度大而受到广泛关注。ptt可以达到提高晚期肿瘤生存质量和延长生存期的目的，同时对早期肿瘤实现根治。ptt本身几乎无毒，其主要缺点是生物相容性差，光热转化率低，以及光热剂(ptas)带来的长期毒性问题。其中，有机光热材料具有良好的生物降解性，但光漂白性能不利于其光热转换。传统的静脉给药治疗减少了ptas的积累，减弱了肿瘤部位的光热效应。特别是由于体液循环引起的多次给药常引起耐药性。因此，开发具有原位植入和充分治疗效果的新型ptas具有重要意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供可以用于注射的金硫化银蛋白复合水凝胶及其制备方法，并将其应用于肿瘤的治疗。

本发明提供了金硫化银蛋白复合水凝胶，其原料包括：类弹性蛋白-绿色荧光蛋白复合蛋白、ag3aus2nps和壳聚糖；

所述类弹性蛋白-绿色荧光蛋白复合蛋白的质量分数为0.1％～10％；

所述ag3aus2nps的质量分数为0.1％～10％；

所述壳聚糖的质量分数为0.1％～10％；

所述类弹性蛋白的氨基酸序列为(vpgeg)n、(vpgdg)n、(vpgkg)n或(vpgrg)n，n＝50～100。

本发明提供的金硫化银蛋白复合水凝胶中，壳聚糖带正电荷，ag3aus2nps带正电荷，类弹性蛋白-绿色荧光蛋白复合蛋白带负电荷。一些实施例中，所述壳聚糖呈中粘度(200-400mpa·s)。

本发明中，类弹性蛋白-绿色荧光蛋白复合蛋白为(vpgeg)72-gfp。

一些实施例中，金硫化银蛋白复合水凝胶中，所述类弹性蛋白-绿色荧光蛋白复合蛋白、ag3aus2nps与壳聚糖的质量比为20：1：10。

一些具体实施例中，金硫化银蛋白复合水凝胶中，(vpgeg)72-gfp的质量分数为4％，ag3aus2nps的质量分数为0.2％，壳聚糖的质量分数为2％。

本发明所述金硫化银蛋白复合水凝胶的制备方法包括：

将壳聚糖溶于乙酸水溶液中，得到壳聚糖溶液；

将类弹性蛋白-绿色荧光蛋白复合蛋白溶于去离子水中，然后以edc、nhs活化复合蛋白的羧基，获得活化蛋白溶液；

将ag3aus2nps与壳聚糖溶液混合后与活化蛋白溶液混合，55～65℃搅拌反应10～20min，获得金硫化银蛋白复合水凝胶。

本发明中，所述ag3aus2nps的制备方法包括：

将haucl4·4h2o与agno3分散在油酸与油胺混合液中，55℃搅拌反应20h，加入含硫的油胺溶液，再经55℃搅拌反应2h，制备得到表面修饰油酸油胺配体的ag3aus2纳米颗粒；

用氯仿重悬表面修饰油酸油胺配体的ag3aus2纳米颗粒，然后与ctab水溶液混合，50℃搅拌反应3h，而后洗涤得到带正电荷的ag3aus2nps。

一些实施例中，所述壳聚糖溶液中乙酸的体积分数为1％，壳聚糖的质量分数为3％。

一些实施例中，所述类弹性蛋白-绿色荧光蛋白复合蛋白溶于去离子水至质量分数为13％。

一些实施例中，所述ag3aus2nps与壳聚糖的质量比为1:10。

一些实施例中，所述壳聚糖溶液与活化蛋白溶液的体积比为2:1。

本发明所述的金硫化银蛋白复合水凝胶，或本发明所述制备方法制得的金硫化银蛋白复合水凝胶在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

本发明中，所述恶性肿瘤为实体瘤；优选的所述恶性肿瘤为非转移性实体瘤；更优选的，所述恶性肿瘤为舌癌。

本发明中，所述治疗肿瘤的药物为光敏剂。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的光敏剂，其包含本发明所述的金硫化银蛋白复合水凝胶，或本发明所述制备方法制得的金硫化银蛋白复合水凝胶。

本发明还提供了一种肿瘤的治疗方法，其为给予治疗肿瘤的光敏剂。

所述给予的方式为注射。

所述治疗肿瘤的方法为，在肿瘤组织旁注射本发明所述的光敏剂，然后给予808nm激光照射。

与现有技术相比，本发明提供了一种可注射用的负载有ag3aus2nps的(vpgeg)72-gfp-壳聚糖光热水凝胶，包括：带负电荷的(vpgeg)72-gfp和带正电荷的壳聚糖以及带正电荷的金硫化银异质纳米颗粒；所述带正电荷的金硫化银异质纳米颗粒为ag3aus2nps。

本发明中的(vpgeg)72-gfp与壳聚糖通过化学交联作用形成水凝胶，此外(vpgeg)72-gfp与壳聚糖通过静电作用实现光热纳米颗粒的掺入，最终形成了具备可注射性、高效光热治疗效果及生物相容性的水凝胶材料，光热效率可达到39.0％。通过瘤旁注射的方式将其均匀分散在肿瘤的周围，然后经照射产生光热转换，实现肿瘤的有效杀灭，减少肿瘤复发。此外，凝胶具有高生物相容性，且能够减缓纳米颗粒在体内的代谢。本研究放眼于舌相关肿瘤的光热治疗，与其他同类型光热材料相比，不但拥有较高的光热转换效率，还具有较高的生物相容性、缓慢代谢作用从而稳定发挥其治疗功效。这种一举两得的治疗策略将为临床舌相关恶性肿瘤非手术治疗提供新的思路。

附图说明

图1为本发明实施例1中的金硫化银异质纳米颗粒的合成示意图；

图2为实施例1中可注射金硫化银-蛋白-壳聚糖复合水凝胶的剪切流变结果；

图3为实施例1中可注射金硫化银-蛋白-壳聚糖复合水凝胶的光热转换效率；

图4为实施例1中可注射金硫化银-蛋白-壳聚糖复合水凝胶的光热转换结果；

图5为金硫化银蛋白复合水凝胶注射入小鼠舌根部的光热转换效果图；

图6为可注射金硫化银蛋白复合水凝胶针对舌癌小鼠模型的抗瘤效果对比；

图7为主要器官的h&e染色结果。

具体实施方式

本发明提供了金硫化银蛋白复合水凝胶及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的高生物相容性金硫化银蛋白复合光热水凝胶由带相反电荷的蛋白与聚糖，以及带正电荷的光热异质纳米颗粒制得。所述带正电荷的光热异质纳米颗粒为金硫化银异质纳米颗粒(ag3aus2nps)。具体的本发明中，该水凝胶由带负电荷的类弹性蛋白-绿色荧光蛋白复合蛋白——(vpgeg)72-gfp和带正电荷的金硫化银异质纳米颗粒(ag3aus2nps)，以及带正电荷的壳聚糖(cs)。

前期实验采用了多种带负电荷的聚电解质材料进行实验，包括类弹性蛋白/聚丙烯酸(paa)、聚谷氨酸(γ-pga)等。实验表明，在水凝胶的形成方面，类弹性蛋白和paa、γ-pga起到了同样的作用，即都作为负电荷的提供者。但由于分子量和电荷密度的不同，导致水凝胶具有不同的性质。所产生的paa-壳聚糖水凝胶是呈泡沫塑料状的；而γ-pga-壳聚糖水凝胶是果冻状的，且容易破碎。更重要的是，这两种凝胶都不适于注射。而用类弹性蛋白合成的水凝胶则具有剪切减薄的特性，更均匀、粘度低、可注射。

本发明中，所述类弹性蛋白(elastin-likepolypeptides，elps)是一种人工合成的蛋白质聚合物，具有良好的生物相容性。类弹性蛋白主要由五肽重复序列单元(val-pro-gly-xaa-gly,vpgxg)构成，将第四位氨基酸x选取为谷氨酸e或天冬氨酸d，使其带有高电荷密度的负电荷，从而便于与带有大量氨基的壳聚糖进行化学交联形成凝胶。另外，也可以将四号氨基酸x选取为赖氨酸k或精氨酸r，使其带有高电荷密度的正电荷，从而便于与带有大量羧基等负电的聚糖进行化学交联形成凝胶。研究表明，虽然形成的凝胶的理化形式相似，但相对于其他复合蛋白(xaa被替换为其他氨基酸，或者是不同的重复序列单元数量)，(vpgeg)72-gfp的抗肿瘤效果更具优势。

绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)是常用的荧光标记物，优势在于肉眼即可观察到其基因的稳定表达。将类弹性蛋白与绿色荧光蛋白复合进行表达，能够显著提高产物蛋白的产率与纯化效率。此外，其他荧光蛋白也具有相似功能。本发明通过实验表明，符合蛋白中gfp的添加并不会影响效果抗肿瘤效果。并且gfp作为一种分子伴侣，有助于提高工程蛋白的表达量。通过对gfp和阴离子多肽进行融合重组，提高了蛋白质实体的产量。同时，(vpgeg)72蛋白的低免疫原性、电负性和生物相容性均不受影响。

本发明利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)与n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，实现蛋白与壳聚糖的快速交联，从而形成稳定的水凝胶。诱导交联形成凝胶的edc/nhs反应是最常用的生物偶联反应之一，用于偶联羧基与氨基形成酰胺键。

研究表明，在本发明提供的制备方法中，试剂用量、反应温度、反应时间等条件都会对凝胶的效果产生影响。组成凝胶的基元——蛋白与聚糖的用量不足，则只能呈均匀溶液而无法形成凝胶；用量过大，则溶解不完全，产物凝胶不均匀。光热材料的用量也会影响光热治疗的效果，光热材料用量不足则无法产生足够的光热能量转换，因而无法实现肿瘤细胞的有效杀伤。光热材料和基元间的比例也需要控制在一定范围内，以保证光热材料通过静电作用被有效结合在凝胶内，且不发生聚集或泄露。此外，反应温度、反应时间对凝胶产物的生成也有一定影响，优选条件为反应温度控制在60℃左右，反应时间15min。反应温度低(如室温)，则反应难以进行，无法形成凝胶。反应温度过高，则凝胶生成过快，难以控制光热材料在其中均匀分散。相对来说，试剂用量对光热凝胶制备的影响更明显也更重要。

具体实施例中，本发明提供的可注射用体外化学合成蛋白复合光热水凝胶的制备方法，包括：

a)将带正电的壳聚糖溶于乙酸1％(v/v)水溶液中，分散得到壳聚糖溶液；

b)将带正电的ag3aus2nps与壳聚糖溶液混合；

c)将带负电荷的(vpgeg)72-gfp溶于去离子水中，分散得到(vpgeg)72-gfp水溶液；

d)将edc、nhs和(vpgeg)72-gfp进行混合，使得(vpgeg)72-gfp的羧基基团得到活化，便于下一步与壳聚糖的氨基基团进行化学交联；

e)将ag3aus2nps与壳聚糖的混合液与经活化的(vpgeg)72-gfp进行混合，在60℃搅拌15min，利用壳聚糖的氨基与(vpgeg)72-gfp的羧基的交联，并通过(vpgeg)72-gfp与ag3aus2nps静电作用实现nps的负载，形成具金硫化银蛋白复合光热水凝胶((vpgeg)72-gfp-chitosan-ag3aus2)。

一些实施例中，所述带正电荷的ag3aus2nps由如下方法制备：

将haucl4·4h2o与agno3分散在油酸与油胺混合液中，55℃搅拌20h，加入硫粉的油胺溶液，再经55℃搅拌2h，制备得到表面有油酸油胺配体的ag3aus2纳米颗粒；

通过离心洗去ag3aus2纳米颗粒分散液中过量的油酸油胺，用氯仿重悬ag3aus2纳米颗粒，随即与十六烷基三甲基溴化铵(ctab)水溶液混合，在50℃搅拌3h，而后洗涤得到带正电荷的ag3aus2nps。

本发明所述过量的油酸油胺的洗涤采用乙醇，洗涤2～3次。

所述带正电荷的ag3aus2nps的洗涤采用水，洗涤2～3次。

本发明通过表面活性剂ctab作为配体，将油相分散的ag3aus2纳米颗粒转至水相，增强了水溶性，进一步降低了生物毒性，提升了生物相容性。

本发明中，(vpgeg)72-gfp的制备采用基因工程的方式，首先构建转化表达载体的宿主菌，然后通过发酵宿主菌并诱导蛋白表达获得(vpgeg)72-gfp。本发明实施例中，采用大肠杆菌作为宿主菌。其表达载体的骨架载体为pet25b。经该体系表达获得的(vpgeg)72-gfp蛋白的末端还连接有6×his标签。具体的，(vpgeg)72-gfp的氨基酸序列为mvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelykelgvvglvprgshmgagpgvgvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgvgvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgvgvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgvgvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgvgvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgvgvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgvgvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgvgvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgegvpgwphhhhhh。

本发明所述的金硫化银蛋白复合光热水凝胶，通过凝胶的负载作用，提高光热纳米材料的生物相容性、减缓降解以及稳定持久发挥光热转换，实现恶性肿瘤的有效光热根治性治疗。可注射高生物相容性的金硫化银蛋白复合光热水凝胶经局部注射到肿瘤附近后，结合近红外光照可以精准且可控的完全杀灭癌细胞，且无复发。且由于凝胶对热量散射的阻隔，不但在肿瘤部位快速积聚了足以杀灭肿瘤的热量，同时对临近的正常组织起到了保护作用。光热治疗的同时，并未对瘤旁重要的神经、血管等造成副损伤。

本发明的上述可注射水凝胶利用808nm激光照射产生的热。注入生物体内后，相比于溶液型药物，凝胶型药物因血液循环导致的药效稀释更慢，因此拥有更稳定的光热转换效率(在低功率激光照射下三分钟内温度达到55℃)，从而有效溶解细胞膜并使蛋白变性，致使肿瘤细胞直接死亡或凋亡。

本发明提供的光热水凝胶具备可注射性，可作为操作更简便的肿瘤原位治疗手段。相比较于常规药物治疗，不但确保了有效的药物浓度，还减少了治疗过程中药物对正常组织的毒副作用。

本发明中的类弹性蛋白-绿色荧光蛋白复合蛋白与壳聚糖通过化学交联作用形成水凝胶，与壳聚糖通过静电作用实现光热纳米颗粒的掺入，最终形成了具备可注射性、高效光热治疗效果及生物相容性的水凝胶材料，具有39％的光热转换效果。经局部注射至瘤旁后，结合高组织穿透能力的近红外光，实现舌癌的精准、可控治疗。采用凝胶作为负载基体，可以提高光热纳米材料的生物相容性，还可以减缓纳米粒子在体内的降解，从而有效地杀灭肿瘤，减少肿瘤复发。从实验结果上看，不但对舌癌起到了近乎根治的效果，同时并未对舌体周围脉管及神经造成副损伤，这为临床舌癌光疗提供了新的思路及可借鉴办法。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：(vpgeg)72-gfp的表达与纯化

第一步：获得稳定表达(vpgeg)72-gfp的菌株。用(vpgeg)72-gfp蛋白的基因序列构建pet25b原核表达载体，随后转化e.coliblr(de3)大肠杆菌，诱导表达筛选获得稳定表达菌株。

第二步：(vpgeg)72-gfp的表达。菌株经lb培养基培养，随后接种到tb培养基，到达指数生长期后，加入iptg在28.5℃诱导蛋白表达12h，离心清洗并收集菌体，-80℃保存。

第三步：(vpgeg)72-gfp的纯化。菌体经高压破碎后，离心取上清，过滤除菌，最后用蛋白纯化仪经过镍亲和层析柱、除盐柱、q离子交换层析柱纯化，最终得到(vpgeg)72-gfp蛋白。

实施例2：带正电荷金硫化银纳米颗粒的合成

第一步：通过油溶剂加热法，制备异质结构的金硫化银纳米材料(ag3aus2nps)。具体如下：取haucl4·4h2o20mg，agno340mg加入到100ml圆底烧瓶中，后加入10ml油酸和20ml油胺，升温至55℃，搅拌20h。取25mg升华硫加入10ml油胺中，超声混匀后，加入到上述溶液中，55℃搅拌2h。乙醇洗3次，最后获得的异质结构的金硫化银纳米材料(ag3aus2nps)分散在5ml氯仿中。

以上制备过程可参考附图1。

第二步：通过配体交换，将表面油酸和油胺分子置换成十六烷基三甲基溴化铵(ctab)。具体如下：取ctab0.5g加入到30ml玻璃瓶中，加入10ml去离子水，升温至50℃，搅拌至ctab溶解。将5mlag3aus2nps氯仿溶液加入ctab溶液中，敞口50℃搅拌3h。经水洗涤3次后，分散在1ml去离子水中。

在本发明中，异质结构ag3aus2纳米颗粒吸收808nm近红外激光，通过表面等离子共振产生光热转换。通过配体交换在ag3aus2nps表面包裹ctab后，可均匀分散在水溶液中，且由于带有高密度的氨基，所以保证了纳米材料在水溶液中带有正电荷。经透射电镜显示ag3aus2nps的尺寸约12nm。经电感耦合等离子体发射光谱仪测定每1mg异质结构ag3aus2nps中，含有au201.4μg。

实施例3：金硫化银蛋白复合水凝胶的制备

第一步：将带正电的壳聚糖(中粘度，200-400mpa·s)溶于乙酸1％(v/v)水溶液中，分散得到3％壳聚糖溶液。

第二步：将带正电的ag3aus2nps与上述壳聚糖溶液混合，使得ag3aus2nps与壳聚糖质量比为1:10，得到溶液a。

第三步：将带负电荷的(vpgeg)72-gfp溶于去离子水中，配制13w％(vpgeg)72-gfp水溶液。

第四步：称取edc与nhs，质量比为5:3，与(vpgeg)72-gfp溶液混合得到溶液b。edc与(vpgeg)72-gfp的质量比为1:1。此步骤目的是使得(vpgeg)72-gfp的羧基基团得到活化，便于下一步与壳聚糖的氨基基团进行化学交联。

第五步：将a与b按体积比2：1混合，60℃搅拌15min，得到可注射金硫化银蛋白复合光热水凝胶(含4w％(vpgeg)72-gfp、4w％壳聚糖、0.2w％ag3aus2nps)。

实施例4：金硫化银蛋白复合水凝胶应用于舌癌模型治疗

第一步：将舌癌cal-27细胞注射至裸鼠舌根部，构建裸鼠舌癌模型。

第二步：制备金硫化银蛋白复合水凝胶。

第三步：将金硫化银蛋白复合水凝胶注射至裸鼠舌根部。

第四步：用近红外光照射裸鼠舌根部。所用激光为808nm激光，功率为1w·cm^-2，照射时长为3分钟。

在本发明中，可注射金硫化银蛋白复合光热水凝胶用于舌肿瘤的光热治疗，治疗温度保持在55℃以上。同时，凝胶具有高生物相容性，且能够减缓纳米颗粒在体内的代谢，确保其稳定发挥治疗功效。

结果如图2～7，其中：

图2为实施例3中可注射金硫化银蛋白复合水凝胶的剪切流变结果，在所有剪切频率下，储存模量(g’)始终接近但大于损耗模量(g”)充分的证明了其水凝胶的特性。

图3为实施例3中可注射金硫化银蛋白复合水凝胶的光热转换结果，其光热转换效率为39％。

图4为实施例3中可注射金硫化银蛋白复合水凝胶的光热转换效果图。通过改变金硫化银光热纳米颗粒的负载浓度，经808nm激光照射后，水凝胶在单位时间内可上升至不同的温度。此外，由于水分子在凝胶骨架中被限定，因此发热非常局限，从而避免了体内应用时对临近非照射部位的损伤。

图5为实施例4中金硫化银蛋白复合水凝胶注射入小鼠舌根部的光热转换效果图。可以看出，在808nm激光照射下，局部温度迅速升高至50℃以上，足以起到肿瘤热杀伤的效果。

图6为实施例4中小鼠荷瘤(舌癌)实验。将50μl金硫化银蛋白复合水凝胶((vpgeg)72-gfp4w％、壳聚糖4w％、ag3aus2nps0.2w％)瘤旁注射到babl/c裸鼠中，随后接受单次激光照射(808nm激光，1.0w·cm^-2，持续3分钟)后所采集的图片。,相比对照组，凝胶组对舌根部舌癌起到了良好的杀伤效果，未造成局部的异常肿胀。肿瘤在治疗后瘤体逐渐萎缩，最终完全消失。

图7为实施例4中对舌癌模型的小鼠进行治疗后，主要器官的h&e染色结果，可以看出光热水凝胶未对小鼠主要器官造成明显损伤。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。