槲皮素与山奈酚的新用途

1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及槲皮素与山奈酚的新用途。


背景技术：

2.遗传性扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，dcm)的特点是心室扩张、心脏收缩功能下降。其中，dcm病患随着心力衰竭承受着生活质量下降、高额的经济负担以及心脏猝死的风险。目前我国特发性/家族性心衰患者在使用β
‑
受体阻滞剂(β
‑
blocker)以及血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin
‑
converting enzyme inhibitors,acei)等药暂缓了心衰的进展，然而除了少数的心脏移植患者，大多数患者的病情仍然持续恶化。
3.杜氏肌营养不良症(dmd)由营养不良蛋白(dystrophin)表达缺失引起，是一种x
‑
连锁遗传疾病，在世界范围内有大约1:3500至1:5000的男性受到影响。dystrophin通过与糖蛋白形成复合物(dgc)把细胞内骨架锚定到细胞外基质，在骨骼肌和心肌的机械稳定性、细胞信号传导和细胞完整性维持中起到重要的作用。dmd患者会经历进行性肌肉丧失，导致肌肉无力，到了20多岁时，伴发扩张性心肌病和呼吸衰竭的发生。呼吸机的使用在一定程度上延长了患者生存率，然而dmd并发的心肌病作为dmd患者的主要死亡原因，迫切需要开发有效的治疗dmd并发的心肌病和预防心力衰竭的方法。
4.目前，dmd的治疗方法主要是使用类固醇(用以减缓肌肉退化)和β受体阻滞剂(用以缓解心功能衰竭)，但是慢性类固醇使用具有包括体重增加、生长阻滞和骨折风险在内的显著副作用。


技术实现要素：

5.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供槲皮素与山奈酚的新用途，用于解决现有技术中的问题。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供槲皮素、槲皮素的衍生物、山奈酚、山奈酚的衍生物中的任意化合物在制备预防或治疗遗传性心肌病产品中的用途。
7.优选地，所述槲皮素、山奈酚或各自的衍生物选自天然化合物或人工合成化合物。
8.优选地，所述遗传性心肌病包括扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病。
9.优选地，所述产品为药物、保健品或食品。
10.如上所述，本发明的槲皮素与山奈酚的新用途，具有以下有益效果：本发明中所选用的槲皮素和山奈酚，属于植物天然化合物。通过对杜氏肌营养不良症病人诱导多能干细胞来源的心肌细胞(dmd hipsc
‑
cms)及线粒体中活性氧水平与心肌功能的检测，本发明证明槲皮素和山奈酚靶向于cat活性，可以防止细胞内h2o2和ros累积，降低dna损伤，增强dmd hipsc
‑
cms的收缩功能。总的来说，本发明为遗传性扩张型心肌病预防或治疗药物的开发提供了新的选择。本发明基于dmd hipsc
‑
cms作为药物筛选平台来筛选出中草药中的活性化合物，并验证出化合物对dmd hipsc
‑
cms的影响。本发明开拓了槲皮素和山奈酚作为中草药提取物的应用范围，为临床治疗遗传性扩张型心肌病及dmd心肌病提供新的方向，也为中草
药物质的临床应用带来新的生机。
附图说明
11.图1显示为不同组心肌细胞内活性氧(cellrox)染色情况，图1(b)是图1(a)中cellrox染色强度的数字化统计结果；##表示对照组与正常心肌细胞组相比具有统计学意义，*表示槲皮素(que)组或山奈酚(kae)组与对照组相比具有统计学意义。
12.图2显示为不同组心肌细胞内线粒体超氧化物(mitosox)染色情况，图2(b)是图2(a)中mitosox染色强度的数字化统计结果；##表示对照组与正常心肌细胞组相比具有统计学意义，*表示槲皮素组或山奈酚组与对照组相比具有统计学意义。
13.图3显示为不同组心肌细胞内过氧化氢(h2o2)的水平测定；#表示对照组与正常心肌细胞组相比具有统计学意义，*表示槲皮素组或山奈酚组与对照组相比具有统计学意义。
14.图4显示为不同组心肌细胞dna损伤情况，图4(b)是图4(a)中dna损伤的数字化统计结果。
15.图5显示为不同组心肌细胞收缩力与收缩频率检测结果,图5(b)是图5(a)中心肌细胞收缩力(impedance)的数字化统计结果，图5(c)是图5(a)中心肌细胞收缩频率的数字化统计结果；###表示对照组与正常心肌细胞组相比具有统计学意义，*表示槲皮素组或山奈酚组与对照组相比具有统计学意义。
具体实施方式
16.本发明提供槲皮素、槲皮素的衍生物、山奈酚、山奈酚的衍生物中的任意化合物在制备预防或治疗遗传性心肌病产品中的用途。
17.所述槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)或各自的衍生物均可选自天然化合物或人工合成化合物。
18.槲皮素的天然化合物来源于枳壳。枳壳具有理气宽中，行滞消胀之功效。常用于胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停，脏器下垂。
19.槲皮素属于黄酮醇类化合物，可以对抗自由基以防止机体脂质过氧化反应；能够直接抑制肿瘤，有效发挥防癌抗癌作用；在抗菌、抗炎、抗过敏、防止糖尿病并发症方面也有较强的生物活性。此外，槲皮素还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用，对冠心病及高血压患者也有辅助治疗作用。槲皮素的分子式为c
15
h
10
o7，化学结构如下：
[0020][0021]
山奈酚来源于车前子(plantaginis semen)。车前子为车前科植物车前或平车前的干燥成熟种子。性味甘寒，入肾、膀胱、肝、肺经，具有清热利尿、渗湿止泻、明目、化痰止咳、抗病原微生物、抗炎等功效作用。
[0022]
山奈酚属于黄酮类化合物，具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多种功效。山奈酚化学结构如下：
[0023][0024]
当本发明中的槲皮素、槲皮素的衍生物、山奈酚、山奈酚的衍生物选自天然化合物时，所述天然化合物均为分离的化合物，即是从植物中单独分离出而不与植物中其他有效成分混同的化合物。
[0025]
在一种实施方式中，槲皮素、山奈酚或其衍生物作为防治遗传性心肌病产品的唯一有效成分。即各分离的化合物作为有效成分单独作用于遗传性心肌病的样本或患者后即能够起到防治遗传性心肌病的作用。在另一种实施方式中，槲皮素、山奈酚或其衍生物也可作为防治遗传性心肌病产品的有效成分之一。此时，所述槲皮素、山奈酚或其衍生物可与其他可防治遗传性心肌病的有效成分共同发挥防治遗传性心肌病的作用。
[0026]
所述槲皮素的衍生物结构式如下：
[0027][0028]
其中r1、r2和r4各自独立地选自氢、甲基、卤素、烷基和卤代烷基、ia族和iia族元素的离子；r3选自以下化合物：
[0029][0030]
r5选自：
[0031][0032]
所述山奈酚衍生物的结构式如下：
[0033][0034]
其中r1可选自甲基，乙酰基，羟乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基；
[0035]
r2可选自甲基，乙酰基，羟乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基，半乳糖基，葡糖醛(苷)酸基，阿拉伯糖基，木糖基，3，4，5
‑
三羟苯甲酰葡萄糖基，香豆酰阿拉伯糖基，阿魏酰阿拉伯糖基；
[0036]
r3可选自甲基，乙酰基，羟乙基；
[0037]
r4可选自h，oh，甲氧基，
‑
o
‑
葡萄糖，
‑
o
‑
葡萄糖基，
‑
o
‑
鼠李糖基，
‑
o
‑
鼠李葡糖基，
‑
o
‑
葡糖鼠李糖基，
‑
o
‑
半乳糖基，
‑
o
‑
葡糖醛(苷)酸基，
‑
o
‑
阿拉伯糖基；
[0038]
r5可选自h，甲基，乙酰基，羟乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基。
[0039]
所述遗传性心肌病包括扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病。遗传性心肌病的第一表现是心源性猝死。
[0040]
以上种类为按病因和病理予以分类的，三种遗传性心肌病的特征如下：
[0041]
(1)扩张型心肌病(dcm)，以心室扩张且功能受损为特征。常发生充血性心力衰竭，所以也有称之为充血型心肌病。至少25％的扩张性心肌病是家族性的或由多样化基因突变引起。核纤层蛋白a/c突变是家族性dcm患者中最常见的基因异常情况；但目前至少有30余种基因突变与该病相关。在dcm形成过程中，心肌细胞会发生活性氧积累、电生理失常，及dna损伤并导致张缩功能的下降。
[0042]
(2)肥厚型心肌病(hcm)，以心室肥厚为特征。由于不少患者有室间隔不对称肥厚而造成心室流出道梗阻，故以往称之为梗阻型心肌病，实际上还有部分患者虽有心肌肥厚但并不造成梗阻。
[0043]
(3)限制型心肌病，以心内膜心肌瘢痕形成为特征，心室腔可能闭塞。过去以心肌瘢痕形成而无肥厚者为限制型心肌病；心室腔因纤维增生及附壁血栓而闭塞者为闭塞型心肌病，现在将这两种情况合并成限制型心肌病。
[0044]
所述扩张型心肌病包括杜氏肌营养不良症(dmd)并发的心肌病。
[0045]
dmd并发的心肌病是进行性发展的，主要的心脏表型包括：心律失常、心电图异常、舒张功能障碍、纤维化、心室逐渐扩张、收缩功能障碍和终末期心力衰竭。
[0046]
槲皮素或山奈酚通过显著降低心肌细胞中活性氧和线粒体内超氧化物累积改善心肌病。
[0047]
槲皮素或山奈酚通过减轻ros累积导致的细胞内dna损伤，从而改善心肌病。
[0048]
槲皮素或山奈酚通过增加心肌细胞收缩力，从而改善疾病心肌细胞的收缩功能。
[0049]
本发明还提供槲皮素、槲皮素的衍生物、山奈酚、山奈酚的衍生物中的任意化合物在制备降低心肌细胞中活性氧产品中的用途。
[0050]
本发明还提供槲皮素、槲皮素的衍生物、山奈酚、山奈酚的衍生物中的任意化合物在制备降低心肌细胞线粒体内超氧化物累积的产品中的用途。
[0051]
本发明还提供槲皮素、槲皮素的衍生物、山奈酚、山奈酚的衍生物中的任意化合物在制备减轻心肌细胞内dna损伤产品中的用途。
[0052]
本发明还提供槲皮素、槲皮素的衍生物、山奈酚、山奈酚的衍生物中的任意化合物在制备增加心肌细胞收缩力产品中的用途。
[0053]
所述预防或治疗心肌病产品为药物、保健品或食品。
[0054]
进一步的，所述药物的有效成分包括槲皮素或山奈酚。
[0055]
所述药物还包括药学上可接受的药物载体或辅料。
[0056]“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
[0057]
更进一步的，所述药学上可接受的药物载体包含肠溶衣制剂、胶囊、微球/囊、脂质体、微乳液、复乳液、纳米颗粒、磁颗粒、明胶或凝胶中的一种或一种以上。
[0058]
更进一步的，药学上可接受的辅料应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
[0059]
本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂、吸入剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
[0060]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0061]
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0062]
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0063]
以下实施例利用健康人和dmd患者的人类诱导多能干细胞(hipsc)来源的心肌细胞(dmd hipsc
‑
cms)进行了单方有效成分对dmd心肌功能的药效评估。
[0064]
实施例1 ips细胞(ipsc)的培养及心肌细胞分化
[0065]
1.将健康人的诱导多能干细胞(hipsc)、杜氏肌营养不良症患者的诱导多能干细胞(dmd hipsc)分别在包被了matrigel(购自corning公司)的培养板中使用nutristem hpsc xf培养基(购自biological industries公司)培养，生长至70
‑
90％的密度时进行心肌方向分化。
[0066]
2.配制培养基：rpmi1640培养基+b27 minus insulin(按照10mlb27+500ml rpmi1640的比例配制)。取部分rpmi1640培养基+b27minus insulin加入chir(购自selleckchemicals公司)至于终浓度6μm。
[0067]
3.弃掉ips细胞培养皿内的培养基，加入步骤2)配制好的含有chir的rpmi1640+b27minus insulin培养基，连续培养48小时。
[0068]
4.之后更换为rpmi1640+b27 minus insulin培养基并加入iwr
‑
1(购自sigma公司)至终浓度5μm，继续分化48小时。
[0069]
5.更换为基础rpmi1640+b27 minus insulin培养基培养两天后换rpmi1640+b27with insulin培养基培养4天。
[0070]
6.使用无葡萄糖rpmi1640+b27with insulin培养基和4mm d
‑
乳酸钠(购自sigma公司)培养4天。培养基每2天更换一次，以维持健康人的心肌细胞和dmd心肌细胞正常生长(dmd hipsc
‑
cms)。
[0071]
7.进行以下实施例中的各项检测前将两种心肌细胞按照以下设置分成四组：健康的心肌细胞组(wt)，对照组(vehicle)，槲皮素组(que)，山奈酚组(kae)。槲皮素(quercetin)购买自sigma公司(货号q4951)，山奈酚(kaempferol)购买自sigma公司(货号60010)。对照组使用0.01％的dmso处理dmd心肌细胞，槲皮素组使用溶解于dmso的100nm的槲皮素处理dmd心肌细胞5天，山奈酚组使用溶解于dmso的10μm的山奈酚处理dmd心肌细胞5天。
[0072]
实施例2心肌细胞内活性氧(ros)水平的测定
[0073]
1.健康人的心肌细胞和dmd心肌细胞内活性氧水平的测量使用invitrogen公司cellrox染料。
[0074]
2.将两种心肌细胞与cellrox和细胞核染料hoechst 33342在37℃下孵育30min,pbs洗涤1次后采用20
×
数值孔径的operetta cls高含量成像系统测量荧光信号强度。结果如图1所示。
[0075]
实施例3心肌细胞线粒体超氧化物水平的测定
[0076]
1.两种心肌细胞内线粒体超氧化物水平的测量使用invitrogen公司mitosox染
料。
[0077]
2.将两种心肌细胞分别与mitosox和细胞核染料hoechst 33342在37℃下孵育30min,pbs洗涤1次后采用20
×
数值孔径的operetta cls高含量成像系统测量荧光信号强度。结果如图2所示。
[0078]
实施例4心肌细胞过氧化氢水平测定
[0079]
1.两种心肌细胞过氧化氢水平按照碧云天过氧化氢检测试剂盒(hydrogen peroxide assay kit)的要求冰上操作。
[0080]
2.收集细胞到离心管内，弃上清，按照每100万细胞加入100
‑
200微升过氧化氢检测裂解液，随后充分匀浆以破碎并裂解细胞。4℃约12000g离心3
‑
5分钟，取上清，用于后续测定。
[0081]
3.在检测孔或检测管内加入50微升样品或标准品。在每个孔内加入100微升过氧化氢检测试剂。
[0082]
4.轻轻振荡或敲打混匀，室温(15
‑
30℃)放置30分钟，然后立即测定a560。
[0083]
5.根据标准曲线计算出样品中过氧化氢的浓度。
[0084]
结果如图3所示。
[0085]
实施例5心肌细胞dna损伤鉴定
[0086]
1.两种心肌细胞分别在室温下用4％的甲醛pbs固定10分钟，pbs洗涤3次后，用染色液(含0.1％triton x
‑
100和20％胎牛血清的pbs)在室温下渗透并封闭细胞1小时。
[0087]
2.用染色液1:1000稀释兔单克隆抗体anti
‑
phospho
‑
histone h2ax(ser 139)(购自santa cruz公司)和鼠单克隆抗体anti
‑
ctnt(购自abcam公司)，4℃孵育过夜。
[0088]
3.除去抗体，孵育后的细胞用染色液洗涤3次，每次10分钟。
[0089]
4.用1：1000稀释的二抗(购自invitrogen公司)室温孵育1
‑
2小时。
[0090]
5.除去二抗，用染色液洗涤样品3次，然后用含有dapi的pbs孵育10分钟。
[0091]
6.vectashield(购自vector公司)封片，使用蔡司lsm880显微镜进行图像采集。
[0092]
结果如图4所示。
[0093]
实施例6心肌细胞收缩力(impedance)测量
[0094]
1.两种心肌细胞收缩力(impedance)测量是按照nanion公司对cardioexcyte 96机器的标准程序进行的。将cardioexcyte 96传感器板用含有1％纤维连接蛋白的磷酸盐缓冲盐水溶液包被，每孔接种50000个心肌细胞。
[0095]
2.使用100nm的槲皮素(que)或10μm的山奈酚(kae)与dmd hipsc
‑
cms共培养5天，隔天换液并在测定前2小时更换新鲜培养基。使用nanion公司的datacontrol 96软件进行数据分析。
[0096]
槲皮素或山奈酚对dmd心肌细胞治疗效果的评估如附图5所示，槲皮素或山奈酚处理可以作用于过氧化氢(cat)并显著降低dmd hipsc
‑
cms中总ros及线粒体超氧化物的积累。槲皮素或山奈酚处理可以显著降低ros产生的dna损伤并且能够提升dmd hipsc
‑
cms的收缩力(impedance)。
[0097]
因此，本发明首次描述和证实槲皮素和山奈酚对遗传性扩张型心肌病中的dmd并发心肌病具有令人满意的疗效，提示槲皮素和山奈酚在遗传性扩张型心肌病及dmd并发心肌病预防和治疗中具有良好的应用前景，为其治疗提供新的选择和药物研发思路。
[0098]
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。