一种抑制肿瘤增殖的氨基富勒烯材料

本公开涉及生物医药领域，特别涉及一种具有抑制肿瘤增殖的氨基富勒烯材料。

背景技术：

癌症，又称为恶性肿瘤，是机体在各种致癌因素的刺激下，局部组织的细胞失去了正常的基因调控而导致的细胞异常性增殖和转移。开发高效安全的抗肿瘤药物已成为当代医学中亟需解决的重大问题之一。

富勒烯是由不同数目的碳原子组成的具有封闭结构的原子团簇，具有独特的分子结构与理化性质，在肿瘤治疗、放化疗保护、抗氧化损伤、保健等生物医学领域展示了重要的应用前景。大量研究结果发现富勒烯及金属富勒烯具有一定的抑瘤效果，且本身没有毒副作用、安全可代谢。研究最为广泛的羟基化富勒烯衍生物主要是通过阻断肿瘤血管或抑制血管新生、增强免疫浸润、减低氧化应激等多重机制调控肿瘤微环境，进而抑制肿瘤生长。与羟基化富勒烯相比，氨基化修饰的富勒烯衍生物容易进行结构鉴定，可以进一步化学修饰；并对生物膜结构具有很强的亲和性，容易被细胞摄取，具有显著抗病毒、抗菌活性；但是目前还没有氨基化富勒烯衍生物在直接治疗肿瘤的基础与应用研究。

技术实现要素：

本公开的目的在于提供一种新的抑制肿瘤生长的富勒烯材料，将富勒烯进行氨基化修饰，修饰后得到一系列水溶性良好的氨基富勒烯衍生物，这些氨基富勒烯可以通过激活自噬流，诱导g0/g1细胞周期阻滞直接抑制癌细胞的增殖。

具体地，本公开提供了：

一种式(i)的氨基富勒烯衍生物在制备具有抑制肿瘤增殖作用的药物中的应用，

其中f为富勒烯，所述富勒烯选自含空心富勒烯、金属富勒烯、杂环富勒烯和内嵌富勒烯中的至少一种；

其中r为所述富勒烯的氨基修饰基团，r的一端通过含氮基团、苯基、巯基与所述富勒烯结合，r的另一端为任一含氮基团，所述含氮基团包括伯氨、叔胺、仲胺、季胺的任一种或几种；

优选地，r为-nr¹-r’-nr²r³,其中r¹，r²，r³可独立的或同时是氢，或任选的被取代的c1-c6烷基、环烷基、含杂原子的烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基，或r¹和r²和/或r³一起形成环化的取代基；优选地，r²、r³同时为氢；

r’是任选的被取代的c1-c6烷基、环烷基、含杂原子的烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基，或r¹和r’一起形成环化的取代基；其中当r¹和r²和/或r³一起形成环化的取代基时，r’不存在；

其中m选自1-12的整数。

本公开一方面，如式(i)的氨基富勒烯衍生物，其中富勒烯为空心富勒烯、金属富勒烯、杂环富勒烯和内嵌富勒烯中的至少一种，优选地富勒烯选自c2n、m@c2n、m2@c2n、ma@c2n、m3n@c2n、m2c2@c2n、m2s@c2n、m2o@c2n和mxa3-xn@c2n中的任一种或其混合物，其中，m和a均为金属元素，所述m和a均选自sc、y和镧系金属元素中的任意一种；优选地，所述富勒烯选自含c2n的一种或多种富勒烯分子，其中2n为碳原子数，30≤n≤60；优选地，所述富勒烯选自c60、c70、c76、c78、c80、c84的一种或多种；更优选的，所述富勒烯选自c60、c70的一种或多种。

本公开一方面，如式(i)的氨基富勒烯衍生物，其中所述富勒烯的氨基修饰基团r选自(2-氨基乙基)氨基、(3-氨基丙基)氨基、(4-氨基丁基)氨基、(5-氨基戊基)氨基、(2-氨基苯基)氨基、(3-氨基苯基)氨基、(4-氨基苯基)氨基、(甲氨基苯基)氨基、(4-氨基)哌啶基、哌嗪基、4-氨基苯基、(4-氨基甲基)苯基、(4-氨基苯基)巯基、(4-氨基环己基)巯基、4-哌啶基巯基、(1-氨基乙基)巯基、(1-氨基丙基)巯基、(1-氨基丁基)巯基、(1-氨基戊基)巯基的一种或几种；其中m选自1-12的整数；优选3、4、5、6、10。

本公开的另一方面，如前所述的任一项的氨基富勒烯衍生物，其在制备阻断肿瘤细胞周期药物中的应用，其中优选地，所述阻断肿瘤细胞周期药物为降解细胞周期蛋白的药物，更优选地，所述细胞周期蛋白选自cyclind1。

本公开的另一方面，如前所述的任一项的氨基富勒烯衍生物，其在制备cdk抑制剂药物中的应用；优选地，所述cdk选自cdk4、cdk6的一种或多种。

本公开的另一方面，如前所述的任一项的氨基富勒烯衍生物，其在制备上调肿瘤细胞自噬激活蛋白的药物中的应用；优选地，所述自噬激活蛋白选自psap、ctsl、ctsd或其中间体或成熟蛋白的一种或多种。

本公开的另一方面，如前所述的任一项氨基富勒烯衍生物的任一项应用，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、胆管癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤、淋巴瘤、脑胶质瘤、白血病或肉瘤中的一种或多种；优选地，所述肿瘤选自非小细胞肺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、肝癌、前列腺癌中的一种或多种。

本公开的另一方面，如前所述的任一项氨基富勒烯衍生物的任一项应用，所述药物包括所述氨基富勒烯衍生物的一种或多种，以及药学上可接受的载体，优选地，所述药物的制剂形式选自溶液剂、颗粒剂、冻干粉剂、乳状剂、混悬剂、油剂、纳米制剂中的一种或多种；优选地，所述溶液剂为注射剂。

本公开的另一方面，如前所述的任一项氨基富勒烯衍生物的任一项应用，所述药物还可以包括另一种或多种抗肿瘤药物。

本公开的氨基富勒烯衍生物在低浓度下就可以很好地抑制肿瘤细胞活性，抑制肿瘤细胞增殖效果显著且呈浓度依赖性，并且具有生物相容性和高安全性。本公开的氨基富勒烯衍生物具有良好的应用前景。

附图说明

图1示出了氨基富勒烯tapc-3的分子结构(左)和高分辨质谱(右)；

图2示出了氨基富勒烯tapc-4的分子结构(左)和高分辨质谱(右)；

图3示出了氨基富勒烯分子tapc-3的液相色谱；

图4示出了氨基富勒烯分子tapc-4的液相色谱；

图5示出了氨基富勒烯混合物c70-eda的分子结构(左)和基质辅助激光解析-飞行时间质谱(右)；

图6示出了由c60富勒烯制备氨基富勒烯衍生物；

图7示出了由c60富勒烯经c60cl6前体制备氨基富勒烯衍生物；

图8示出了氨基富勒烯tapc-3和tapc-4对a549、du145、u87-mg细胞的半抑制浓度拟合曲线；

图9示出了氨基富勒烯tapc-4对a549、du145细胞周期的阻断；

图10示出了氨基富勒烯tapc-4动物抑瘤实验的模式图；

图11示出了氨基富勒烯tapc-4治疗后，肿瘤的光学照片(左)和相对肿瘤重量(右)；

图12示出了氨基富勒烯tapc-4治疗过程中，小鼠体重变化(左)和相对肿瘤体积变化(右)；

图13示出了氨基富勒烯混合物c70-eda的a549、du145、u87-mg细胞增殖的影响(细胞阻抗测定法)；

图14示出了氨基富勒烯混合物c70-eda的a549、du145、u87-mg、hepg2细胞生长的影响(cck-8实验)；

图15示出了氨基富勒烯混合物c70-eda对a549、du145、u87-mg细胞周期的阻断；

图16示出了氨基富勒烯混合物c70-eda对a549细胞周期调控蛋白cyclind1表达水平的影响；

图17示出了氨基富勒烯混合物c70-eda对a549细胞周期调控因子cyclind1、pcna、mk167、e2f1基因表达水平的影响；

图18示出了westernblot检测c70-eda对a549细胞自噬水平的影响；

图19示出了westernblot检测不同浓度c70-eda对a549细胞自噬流激活蛋白ctsl、ctsd、psap表达水平的影响；

图20示出了氨基富勒烯混合物c70-eda动物抑瘤实验的模式图；

图21示出了氨基富勒烯混合物c70-eda治疗后，肿瘤的光学照片(左)和肿瘤重量(右)；

图22示出了氨基富勒烯混合物c70-eda治疗过程中，肿瘤体积变化(左)和小鼠体重变化(右)。

具体实施方式

根据本公开的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本公开上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

i.定义

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有，与合理利益/风险比相称的，过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

术语“治疗”包括抑制、缓解、预防或消除与所治疗的疾病、病症或失调相关的一种或多种症状或副作用。

术语“减少”、“抑制”、“减轻”或“减小”的使用是相对于对照的。本领域技术人员将容易地确定用于每个实验的适当对照。例如，将用化合物处理的受试者或细胞中的降低了的反应与未用化合物处理的受试者或细胞中的反应进行比较。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻被治疗的疾病状态的一种或多种症状或以其它方式提供期望的药理学和/或生理学作用的剂量。精确的剂量将根据多种因素而变化，如受试者依赖的变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病或病，以及所施用的治疗。有效量的效果可以相对于对照。这些对照在本领域中是已知的并且在本文中讨论，并且可以是例如在药物或药物组合施用之前或没有施用时的受试者的状况，或在药物组合的情况下，可以将组合效果与仅施用一种药物的效果进行比较。

术语“赋形剂”在本文中用于包括可以包含在微粒中或其上的不是治疗或生物活性化合物的任何其它化合物。因此，赋形剂应当是药学上或生物学上可接受的或相关的，例如赋形剂通常对受试者无毒性。“赋形剂”包括单一的这种化合物，并且还旨在包括多种化合物。

术语“药物组合物”意指包含氨基富勒烯衍生物以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括但不限于：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。

如本文所用，术语“富勒烯”是一系列由偶数个碳原子组成，有12个五元环，其余为六元环组成的类球形团簇分子。富勒烯包括空心富勒烯、内嵌富勒烯，所述内嵌富勒烯为在富勒烯的碳笼结构内包入金属或金属原子簇。

术语“金属富勒烯”、“内嵌富勒烯”是指在富勒烯的碳笼结构内包入各种不同的金属或金属原子簇，形成一类具有特殊结构和性质的化合物，此类化合物通常被称为内嵌富勒烯，一般用m@c2n形式表示，其中m代表金属元素。

术语“氨基富勒烯衍生物”是指对富勒烯进行氨基化修饰，修饰后的富勒烯外部包括一个或多个相同或不同的含氨基的取代基团，上述修饰方法均可按照现有技术公开的方法进行修饰。

如本文所用，术语“肿瘤”系指或描述了哺乳动物尤其是人的生理状况，其典型特点是细胞无调控地生长。肿瘤的实例包括但不限于实体瘤、癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。

如本文所用，术语“细胞周期”系指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。其中间期又分为三期，即dna合成前期(g1期)、dna合成期(s期)与dna合成后期(g2期)。细胞周期的调节主要是通过g1期的阻留而实现的，g0期即指细胞处于阻留的状态，g0期是脱离细胞周期暂时停止分裂的一个阶段，但在一定适宜刺激下，又可进入周期。

如本文所用，术语“cyclind1”系指g1/s-特异性周期蛋白-d1，属于一种细胞周期蛋白。“细胞周期蛋白”指与真核细胞的细胞周期呈同步周期性浓度升降的蛋白质，包括周期蛋白质a、b、d、e、g及h。它们与关键的蛋白质激酶(细胞周期蛋白依赖性激酶，cyclin-dependentkinases,cdks)结合，并调节它们的酶活性，从而帮助推动和协调细胞周期的进行。

如本文所用，术语“自噬(autophagy)”系指或描述了将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的过程。正常生理情况下，细胞自噬利于细胞保持自稳状态；在发生应激时，细胞自噬防止有毒或致癌的损伤蛋白质和细胞器的累积，抑制细胞癌变。自噬过程中，溶酶体参与自噬调节。ctsl(cathepsinl)和ctsd(cathepsind)是溶酶体蛋白酶，负责降解蛋白质和激活酶促前体。psap(prosaposin)将脂类底物与膜周围环境隔离开来，使可溶性降解酶更易接近。ctsl和ctsd均可刺激自噬的激活，而psap缺乏会引起自噬的功能障碍。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本公开的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本公开上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本公开上述内容所实现的技术均属于本公开的范围。

ii.具体实施方式

本公开的一个方面，涉及一种抑制肿瘤转移的氨基富勒烯衍生物。所述氨基富勒烯衍生物可由式(i)表示：

在一个实施例中，所述富勒烯选自含空心富勒烯、金属富勒烯、杂环富勒烯和内嵌富勒烯中的至少一种；

在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物，其中富勒烯为空心富勒烯、金属富勒烯、杂环富勒烯和内嵌富勒烯中的至少一种，优选地富勒烯选自c2n、m@c2n、m2@c2n、ma@c2n、m3n@c2n、m2c2@c2n、m2s@c2n、m2o@c2n和mxa3-xn@c2n中的任一种或其混合物，其中，m和a均为金属元素，所述m和a均选自sc、y和镧系金属元素中的任意一种；

在一个实施例中，所述富勒烯是一系列由偶数个碳原子组成，有12个五元环，其余为六元环组成的类球形团簇分子，可由c2n表示，其中2n为碳原子数，30≤n≤60；

在一个实施例中，所述富勒烯优选地包括c60、c70、c76、c78、c80和c84的一种或多种，更优选地包括c60和c70的一种或多种。

在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物，包括由一个或多个相同或不同的氨基修饰基团r的氨基衍生物组成的混合物。

在一个实施例中，如式(i)的氨基富勒烯衍生物，其中所述富勒烯的氨基修饰基团r可通过含氮基团、苯基、巯基的任一种或几种与所述富勒烯结合；r的另一端为任一含氮基团，所述含氮基团包括伯氨、叔胺、仲胺、季胺的任一种或几种；其中m选自1-12的整数。

在一个实施例中，如式(i)的氨基富勒烯衍生物，其中所述富勒烯的氨基修饰基团r可由-nr¹-r’-nr²r³表示，其中r1，r2，r3可独立的或同时是氢，或取代或未取代的c1-c6烷基、c3-c6环烷基、含杂原子的c1-c6烷基、c3-c6杂环烷基、芳基、杂芳基，或r1和r2和/或r3一起形成环化的取代基，其中当r1和r2和/或r3一起形成环化的取代基时，r’不存在；优选地，r2、r3同时为氢；r’是取代或未取代的c1-c6烷基、c3-c6环烷基、含杂原子的c1-c6烷基、c3-c6杂环烷基、芳基、杂芳基，或r¹和r’一起形成环化的取代基；其中m选自1-12的整数。

在一个实施例中，如式(i)的氨基富勒烯衍生物，其中所述富勒烯的氨基修饰基团r选自(2-氨基乙基)氨基(-nhch2ch2nh2)、(3-氨基丙基)氨基(-nhch2ch2ch2nh2)、(4-氨基丁基)氨基(-nhch2ch2ch2ch2nh2)、(5-氨基戊基)氨基(-nhch2ch2ch2ch2nh2)、(2-氨基苯基)氨基(3-氨基苯基)氨基(4-氨基苯基)氨基(4-氨基)哌啶基哌嗪基、4-氨基苯基、(4-氨基甲基)苯基、(甲氨基苯基)氨基(-nhphch2nh2)；其中m选自1-12的整数；

更优选的，r选自(2-氨基乙基)氨基(eda)、(4-氨基)哌啶基(tapc)；

优选地，其中m选自3、4、5、6、10。

在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物为tapc三加成(tapc-3)和/或四加成(tapc-4)的c60，或其混合物；

在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物结构为：

在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物为eda修饰的c70，或由不同数量eda修饰的c70中的一种或多种组成的混合物；

在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物结构为：

在一个实施例中，如式(i)的氨基富勒烯衍生物，其中所述富勒烯的氨基修饰基团r选自(4-氨基苯基)巯基、(4-氨基环己基)巯基、4-哌啶基巯基、(1-氨基乙基)巯基、(1-氨基丙基)巯基、(1-氨基丁基)巯基、(1-氨基戊基)巯基的一种或几种；其中m选自1-12的整数，优选3、4、5、6、10。

需要说明的是，形成氨基富勒烯衍生物的具体方法不受特别限制，本领域技术人员可以根据富勒烯的具体组成以及药物的具体要求，选择适当的方法合成氨基富勒烯衍生物。例如，根据本公开的实施例，可以通过亲核加成反应，将非取代的上述富勒烯进行氨基化修饰。例如，根据本公开的具体实施例，可根据不同氨基修饰基团反应物，在适当的条件下反应，得到固定数量或不同数量氨基修饰的富勒烯衍生物；例如，根据本公开的具体实施例，在不同反应温度下，得到加成了不同数量的eda的氨基衍生物及其混合物。

本公开另一方面，涉及前述任一种氨基富勒烯衍生物的在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够阻断肿瘤细胞周期；优选地，所述氨基富勒烯衍生物能够对g0/g1期细胞周期阻滞。优选地，所述氨基富勒烯衍生物选自tapc修饰的富勒烯c60、eda修饰的富勒烯c70中的一种或多种。

在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够降解细胞周期蛋白，从而阻断肿瘤细胞周期。

在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够降解细胞周期蛋白cyclind1；优选地，所述氨基富勒烯衍生物为eda修饰的富勒烯c70。

在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物可以用于制备阻断肿瘤细胞周期的药物。在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物可用于制备cdk抑制剂药物，优选地，所述cdk选自cdk4或cdk6的一种或多种。优选地，所述氨基富勒烯衍生物为eda修饰的富勒烯c70。

在另一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够上调肿瘤细胞自噬激活蛋白。

在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能上调肿瘤细胞自噬激活蛋白，优选地，所述自噬激活蛋白选自psap、ctsl、ctsd或其中间体或成熟蛋白的一种或多种。

在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够使psap蛋白表达增加。优选地，所述氨基富勒烯衍生物为eda修饰的富勒烯c70。

在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够剂量依赖性地增加ctsl、ctsd或其中间体或成熟蛋白的含量。优选地，所述氨基富勒烯衍生物为eda修饰的富勒烯c70。

在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物可以用于制备上调肿瘤细胞自噬激活蛋白的药物。

在另一个实施例中，前述任一种氨基富勒烯衍生物的应用，其中所述肿瘤包括肝癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、胆管癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤、肉瘤、淋巴瘤、脑胶质瘤或白血病中的一种或多种肿瘤细胞。

在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够抑制非小细胞肺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、肝癌、前列腺癌的肿瘤细胞增殖；优选地，所述氨基富勒烯衍生物选自tapc修饰的富勒烯c60、eda修饰的富勒烯c70中的一种或多种。

在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够抑制非小细胞肺癌、前列腺癌、脑胶质瘤、乳腺癌的肿瘤细胞增殖；优选地，所述氨基富勒烯衍生物为tapc修饰的富勒烯c60。

在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够抑制非小细胞肺癌、前列腺癌、脑胶质瘤、乳腺癌、肝癌的肿瘤细胞增殖；优选地，所述氨基富勒烯衍生物为eda修饰的富勒烯c70。

本公开的另一个方面，涉及抑制肿瘤增殖的药物，所述药物包括所述氨基富勒烯衍生物，以及药学上可接受的载体。

在一个实施例中，所述药物组合物的制剂形式包括但不限于溶液剂、注射剂、颗粒剂、冻干粉剂、乳状剂、混悬剂、油剂、纳米制剂中的一种或多种，优选注射剂。

在一个具体的实施例中，所述氨基富勒烯衍生物的应用方式选自口服、注射中的一种或多种，所述注射选自静脉注射、肌肉注射、腹腔注射等。

在一个实施例中，所述药物还包括另一种或多种抗肿瘤药物。

本公开还涉及所述氨基富勒烯衍生物的制备方法。

本公开还涉及所述氨基富勒烯衍生物在制备抗肿瘤的药物中的应用，所述药物还可以包括另一种或多种抗肿瘤药物。

iii.实施例

下面参照实施例进一步阐释本公开。对本公开的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本公开限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据本申请说明书的教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本公开的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本公开的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：制备氨基富勒烯分子

合成方法：5gc60溶于625ml氯苯中，加入13g4-(叔丁氧羰基氨基)哌啶和5ml过氧化氢异丙苯(80％)，室温搅拌(600rpm)48h，取反应液稀释10倍后进行hplc检测，反应完全，停止反应，反应液依次用300ml饱和氯化铵溶液和300ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，60℃浓缩蒸干，得红棕色固体。

将反应产物用甲苯溶解后，进行柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯/甲苯10％、12％、15％、20％。分离得到叔丁氧羰基保护的三加成和四加成的氨基富勒烯样品。

1g分离后的氨基富勒烯样品中加入375mltfa/chcl3(10％)，室温搅拌2h，浓缩蒸干蒸干，得红色固体(98.5％)，固体溶于水后进行透析，冻干后得脱保护的红色固体。将脱保护后的样品溶于水后，反复过离子交换柱3次，最后用水将柱子中残留的样品洗脱下来，样品水溶液经过孔径0.22μm滤膜过滤后进行透析，冻干，得到tapc三加成(tapc-3)和四加成(tapc-4)产物。

结构表征：利用电喷雾质谱(esi-ms，正离子模式)检测tapc-3和tapc-4的分子量(图1-2)；使用高效液相色谱(hplc，lc-2030，岛津)，c18色谱柱(4.6*250mm，安捷伦)，水-乙腈作为流动相，紫外检测器(检测波长：310nm)，流量为1ml/min，对tapc-3和tapc-4的纯度进行检测(图3-4)。

结论：esi-ms检测的分子量与tapc-3和tapc-4的理论分子量完全一致，hplc检测两者的纯度均在95％以上，能够用于进一步的生物试验。

实施例2：制备氨基富勒烯混合物c70-eda

合成方法：氨类分子能够通过其氨基与富勒烯碳笼进行亲核加成反应，该反应是吸热过程，反应温度是影响反应产物的关键性因数。将100mlc70的邻二甲苯溶液(2mg/ml)滴加到eda(100ml)中，在n2保护下于不同温度(包括50℃，100℃和130℃)下搅拌。直到溶液变成红棕色，并通过旋转蒸发除去过量的eda和溶剂。然后将粗产物在室温和氮气下继续与eda(100ml)反应12小时；除去eda，并将终产物用盐酸(1mm)溶解，并通过用超纯水透析两天而纯化。将多种eda改性的c70盐酸盐(缩写为c70-eda)冷冻干燥成粉末。通过元素分析来表征c70-eda，以确定经修饰的eda部分的数目，主要取决于反应温度。

结构表征：通过基质辅助激光解析-飞行时间质谱(maldi-tof-ms，正离子模式，α-氰基肉桂酸作为)检测50℃下合成c70-eda的分子量分布(图5)；使用元素分析测试c70-eda中c、h、n元素的质量含量，进而根据n与c的比例计算得到平均每个c70修饰的氨基数量。

表1示出了不同温度条件合成的氨基富勒烯混合物c70-eda的组成元素分析：

结论：根据元素分析结果，计算出反应温度为50℃、100℃和130℃时，c70反应加成的乙二胺分子的数量分别为10.2、7.0和4.4，反应温度越低加成数量越多。maldi-tof-ms检测结果显示50℃下制备的c70-eda是由加成了不同数量的乙二胺的氨基衍生物组成混合物，其中乙二胺的数量主要分布在6到11区间。

实施例3：其他氨基富勒烯衍生物的制备

1.由c60富勒烯制备氨基富勒烯衍生物

5gc60溶于氯苯中，加入10倍于c60摩尔量的叔丁氧羰基保护的胺类(加入5ml过氧化氢异丙苯(80％))、苯胺类或溴代苯胺类，室温搅拌48h，取反应液稀释10倍后进行hplc检测，反应完全后，反应液依次用饱和氯化铵溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，60℃浓缩蒸干，得到反应产物。

将反应产物用甲苯溶解后，进行柱层析分离，洗脱剂为不同比例的乙酸乙酯/甲苯溶液。分离得到叔丁氧羰基保护的不同加成数的氨基富勒烯。之后加入tfa/chcl3(10％)溶液，室温搅拌2h脱除叔丁氧羰基，浓缩蒸干，固体溶于水后进行透析，冻干，得到不同类型的氨基富勒烯(图6)。

2.由c60富勒烯经c60cl6前体制备氨基富勒烯衍生物

由c60制备c60cl6前体：将1g的c60溶于100ml氯苯中，滴加入4g的氯化碘，室温下搅拌1h后，将产物经溶剂过滤器(尼龙滤膜，0.22μm)过滤后，加入500ml的乙醇沉淀，过滤收集沉淀，使用乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥24h，制备得到红色固体产物c60cl6；

氨基富勒烯衍生物制备：将1g的c60cl6溶于500ml甲苯中，滴入7倍于c60cl6摩尔量的叔丁氧羰基保护的胺类、巯基胺类的甲苯冰醋酸溶液(甲苯与冰醋酸的体积比为100:1)，再加入3.84gna2co3，室温搅拌20h。过滤收集滤液，分别用na2co3溶液和水洗涤，在40℃下旋转蒸发干燥，得到深棕红色固体粗产物；使用甲苯溶解后，进行硅胶柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯/甲苯(v/v)25％、50％，分离得到不同加成数的产物。将分离后产物溶于氯仿中，加入10％的三氟乙酸，室温搅拌反应10h，旋转蒸发干燥除去氯仿和三氟乙酸，得到不同加成数的氨基富勒烯衍生物(图7)。

实施例4：氨基富勒烯分子tapc-3和tapc-4抑制肿瘤细胞生长

细胞：a549(非小细胞肺癌细胞系)、du145(前列腺癌细胞系)、u87-mg细胞(恶性脑胶质瘤细胞系)

分组：对照组：正常培养基；实验组：浓度分别为0、2、4、5、6、8、10、12.5、15、20μm的tapc-3或tapc-4的水溶液。

实验方法：cck-8检测法

a549细胞使用含10％胎牛血清(mediatech，35-081)的dmem培养基(mediatech，10-013)培养，du145和u87细胞使用含10％胎牛血清(mediatech，35-081)的1640培养基(mediatech，10-040)培养。将细胞正常培养24小时后，使用0.25％的胰酶(mediatech，25-053)将细胞消化计数，以2000个/孔的密度种于96孔板中，培养24小时，使用不同剂量的待测样品处理细胞72小时。之后使用新鲜培养基替换原培养基，用10μl/孔的cellcountingkit-8(cck-8，dojindo)处理细胞，并使用酶标仪(infifinitem1000)测量每孔450nm处的吸光度以评估细胞活力，对各数据点进行半抑制浓度(ic50)拟合，得到tapc-3和tapc-4分子对不同肿瘤细胞的ic50值。

结论：经过不同浓度tapc-3和tapc-4溶液处理后，a549、du145、u87肿瘤细胞的活性都出现了明显下降(图8)，tapc-4对上述三种细胞的ic50值分别为7.45μm、15.41μm、8.88μm，tapc-3对上述三种细胞的ic50值分别为12.33μm、13.18μm、9.83μm，很低浓度的tapc-3和tapc-4就可以很好地抑制肿瘤细胞活性。

实施例5：氨基富勒烯分子tapc-4阻断细胞周期

细胞：a549、du145细胞

分组：对照组：正常培养基；饥饿组：无血清的培养基；peg-po实验组：100μmpeg-po；tapc-4实验组：peg-po(100μm)包覆的浓度分别为5、10μm的tapc-4。由于tapc-4材料在pbs(磷酸盐缓冲液)中容易发生聚集，使用peg-po(磷酸化聚乙二醇，peg分子量为1900)包覆tapc-4材料，增强材料的溶解性和稳定性。c70-eda在细胞实验用浓度下不会有聚集情况发生，所以在实施例7-12不使用peg-po包覆，在动物实验即实施例13中，使用peg-po包覆。

细胞周期测定：以密度为2×10⁵个/孔的方式将细胞接种至6孔板中，用tapc-4处理或饥饿处理72小时，之后用胰酶将细胞分散，在-20℃下使用预冷的乙醇固定细胞。将固定的细胞用含有pi和rnasea的细胞周期试剂盒(dojindo)在黑暗中染色30分钟，然后重悬于500μlpbs中，用流式细胞仪进行分析(nxt，thermofischer)。使用modfit计算相对的g1/g0，s和g2/m细胞周期阶段占比。

结论：饥饿组作为阳性对照，较对照组细胞g0/g1期占比增多，tapc-4处理之后，a549、du145肿瘤细胞也有剂量依赖性的g0/g1期增加(图9)，因此，tapc-4在癌细胞增殖中的抑制能力主要归因于g0/g1期细胞周期阻滞。

实施例6：氨基富勒烯分子tapc-4体内抗肿瘤治疗

动物品系：balb/c雌鼠，5周，体重在16-20g之间。

肿瘤模型：小鼠乳腺癌4t1瘤株

实验分组：对照组：生理盐水；peg-po实验组：20mm的peg-po；实验组：peg-po(20mm)包覆的浓度分别为1和2mm的tapc-4。

给药方式：腹腔注射0.1ml。

实验方法：皮下接种100μl浓度为2×10⁶/ml的4t1乳腺癌细胞，接种两天后，腹腔注射1mmtapc、2mmtapc各100μl，对照组腹腔注射等剂量的生理盐水和peg-po，连续给药数天，开始给药第0、3、6、8、10、12、14天测量肿瘤大小，观察治疗组对肿瘤的抑制情况。当空白组肿瘤长度超过10mm，停止给药治疗，解剖小鼠，取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器及肿瘤，用4％的多聚甲醛固定液固定。

实验结果：对比治疗组和对照组能明显发现，tapc-4治疗后肿瘤重量(图11)及体积(图12右)明显小于对照组，说明tapc-4肿瘤抑制效果显著，并且呈现出浓度依赖性，高剂量组抑瘤率高于低剂量组。同时小鼠体重没有明显变化(图12左)，证明了tapc-4具有高安全性。

实施例7：氨基富勒烯混合物c70-eda抑制肿瘤细胞生长—细胞阻抗测定法

细胞：a549、du145、u87-mg细胞

分组：对照组：正常培养基；实验组：浓度分别为5、10、20、40μm的c70-eda。

细胞增殖测定：细胞阻抗测定法

将a549，du145和u87-mg细胞以每孔2000个细胞的密度种于表面镀金的96孔板中。正常培养细胞使细胞粘附过夜，然后使用不同浓度的c70-eda处理96小时，通过实时细胞分析仪(xcelligence，aceabiosciences)每15分钟自动监测细胞间阻抗来反映细胞的增殖水平。

结论：细胞数量越多，粘连细胞产生的阻抗值越大，阻抗值通过细胞指数(细胞指数＝(药物处理不同时间后细胞阻抗-无细胞时阻抗)/(药物处理0h时细胞阻抗-无细胞时阻抗))表示，随着c70-eda浓度的增加，a549、du145、u87-mg细胞，实时细胞指数显著降低，并且细胞指数的降低与剂量有关，表明不同癌细胞系的增殖速率都受到了抑制(图13)。

实施例8：氨基富勒烯混合物c70-eda抑制肿瘤细胞生长—cck-8检测法

细胞：a549、du145、u87-mg、hepg2(肝癌细胞系)

分组：对照组：正常培养基；实验组：浓度分别为2.5、5、10、20、40μm的c70-eda。

实验方法：cck-8检测法

hepg2细胞使用含10％胎牛血清(mediatech，35-081)的1640培养基(mediatech，10-040)培养。将上述细胞正常培养24小时后，使用0.25％的胰酶将细胞消化计数，以2000个/孔的密度种于96孔板中，培养24小时，使用不同剂量的待测样品处理细胞72小时。之后使用新鲜培养基替换原培养基，用10μl/孔的cellcountingkit-8(cck-8，dojindo)处理细胞，并使用酶标仪(infifinitem1000)测量每孔450nm处的吸光度以评估细胞活力。

结论：用不同浓度的c70-eda处理后，各种癌细胞的活力出现明显下降(图14)。

实施例9：氨基富勒烯混合物c70-eda阻断细胞周期

细胞：a549、du145、u87-mg细胞

分组：对照组：正常培养基；饥饿组：无血清的培养基；实验组：浓度为20μm的c70-eda。

细胞周期测定：以密度为2×10⁵个/孔的方式将细胞接种至6孔板中，用c70-eda处理或饥饿处理72小时，之后用胰酶将细胞分散，在-20℃下用预冷的乙醇固定细胞。将固定的细胞用含有pi和rnasea的细胞周期试剂盒(dojindo)在黑暗中染色30分钟，然后重悬于500μlpbs中，用流式细胞仪进行分析(nxt，thermofischer，美国)。使用modfit计算相对的g1/g0，s和g2/m细胞周期阶段占比。

结论：饥饿组作为阳性对照，较对照组细胞g0/g1期占比增多，c70-eda处理之后，a549、du145肿瘤细胞也有浓度依赖性的g0/g1期增加(图15)，因此，c70-eda在癌细胞增殖中的抑制能力主要归因于g0/g1期细胞周期阻滞。

实施例10：氨基富勒烯混合物c70-eda降解细胞周期蛋白cyclind1

细胞：a549细胞

分组：对照组：正常培养基；实验组：浓度分别为25和50μm的c70-eda。

westernblot检测细胞蛋白水平：上述细胞在六孔板中正常培养24小时后，使用不同剂量的待测样品处理细胞48小时，将处理后细胞在含有蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(beyotime，p1048)的ripa裂解缓冲液(beyotime，p0013)中裂解，用12000g在4℃下离心十分钟收集蛋白质。随后，将蛋白提取物在5x上样缓冲液(beyotime，p0015)中煮沸5分钟，然后用sds-聚丙烯酰胺凝胶(genscript，m42012)溶解，然后转移至pvdf膜上(300ma,1.5小时)，将膜与一抗在4℃下孵育过夜，与二抗(cellsignalingtechnology，7074)在25℃下孵育1小时，所有抗体均已在封闭缓冲液中稀释，最后通过增强的化学发光试剂盒(absin，abs920)可视化抗原-抗体反应。实验中使用的一抗有anti-cyclind1(santacruzbiotechnology,sc-450)和anti-p-rb(santacruzbiotechnology,sc-271930)。

pcr检测基因表达水平：a549细胞在六孔板中正常培养24小时后，使用不同剂量的待测样品处理细胞48小时，使用trizols3(invitrogenlifetechnologies,15596-026)裂解液提取培养细胞的总rna，之后使用1ststrandcdnasynthesissupermix(novoscript,e044-01a)试剂盒，根据说明书将1μg总rna转换为cdna，再使用sybrone-stepqrt-pcrkit(novoscript,e092-01a)试剂盒以20μl反应体积进行荧光定量，定量过程中使用的参比基因为gapdh(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)，目的基因为cyclind1、pcna(proliferatingcellnuclearantigen)、mk167(midkine167)、e2f1(e2ftranscriptionfactor1)。所使用的引物序列如下：

结论：细胞周期蛋白cyclind1可以与cdk4或cdk6形成复合物，磷酸化rb蛋白，使e2f1转录因子转录细胞进入s期所需的基因，从而细胞通过g1期进入s期。氨基富勒烯混合物c70-eda以剂量依赖性的方式降解细胞周期蛋白cyclind1，进而减少磷酸化的rb蛋白(prb)(图16)，使细胞周期停滞在g1期。

c70-eda处理后，细胞周期调节因子cyclind1，e2f1，pcna和mki67的mrna水平没有明显变化(图17)，表明c70-eda是直接降解细胞周期蛋白cyclind1而不是调节细胞g1期至s期相关基因的转录过程。

实施例11：氨基富勒烯混合物c70-eda激活细胞自噬流

细胞：a549细胞

分组：对照组：正常培养基；实验组：浓度为20μm的c70-eda。

westernblot检测细胞自噬蛋白水平：上述细胞在正常培养24小时后，分别使用100μm氯喹(cq)处理4h、20μmc70-eda处理36h、20μmc70-eda处理32h后用氯喹处理4h，将处理后细胞在含有蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(beyotime，p1048)的ripa裂解缓冲液(beyotime，p0013)中裂解，用12000g在4℃下离心十分钟收集蛋白质。随后，将蛋白提取物在5x上样缓冲液(beyotime，p0015)中煮沸5分钟，然后用sds-聚丙烯酰胺凝胶(genscript，m42012)溶解，然后转移至pvdf膜上(300ma，1.5小时)，将膜与一抗在4℃下孵育过夜，与二抗(cellsignalingtechnology，7074)在25℃下孵育1小时，所有抗体均已在封闭缓冲液中稀释，最后通过增强的化学发光试剂盒(absin，abs920)可视化抗原-抗体反应。实验中使用的一抗有anti-β-actin(cst,#4970)，anti-lc3a/b(abcam,ab128025)，anti-ubiquitin(cst,#3936)。

结论：使用氯喹(cq)来抑制溶酶体的酸化并阻止自噬体-溶酶体的融合，从而导致lc3-ii的积累。在c70-eda处理下，存在和不存在cq时lc3-ii水平的差异更为显着(图18)，表明c70-eda激活自噬流。未正确折叠的蛋白质将被泛素(ub)标记并被蛋白酶体降解。当自噬流被cq阻断时，总的泛素化蛋白水平增加。相比之下，c70-eda处理不会引起泛素化蛋白的积累，表明细胞自噬流没有受到抑制(图18)。

实施例12：氨基富勒烯混合物c70-eda上调自噬激活蛋白

细胞：a549细胞

分组：对照组：正常培养基；实验组：浓度分别为25和50μm的c70-eda。

westernblot检测细胞蛋白水平：上述细胞在六孔板中正常培养24小时后，使用不同剂量的待测样品处理细胞48小时，将处理后细胞在含有蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(beyotime，p1048)的ripa裂解缓冲液(beyotime，p0013)中裂解，用12000g在4℃下离心十分钟收集蛋白质。随后，将蛋白提取物在5x上样缓冲液(beyotime，p0015)中煮沸5分钟，然后用sds-聚丙烯酰胺凝胶(genscript，m42012)溶解，然后转移至pvdf膜上(300ma,1.5小时)，将膜与一抗在4℃下孵育过夜，与二抗(cellsignalingtechnology，7074)在25℃下孵育1小时，所有抗体均已在封闭缓冲液中稀释，最后通过增强的化学发光试剂盒(absin，abs920)可视化抗原-抗体反应。实验中使用的一抗有anti-β-actin(cst,#4970)，anti-ctsd(abcam,ab6313)，anti-psap(abcam,ab169910)和anti-ctsl(sinobiological,10486-r221)。

结论：自噬过程中，溶酶体参与自噬调节。ctsl和ctsd是溶酶体蛋白酶，负责降解蛋白质和激活酶促前体。psap将脂类底物与膜周围环境隔离开来，使可溶性降解酶更易接近。ctsl和ctsd均可刺激自噬的激活，而psap缺乏会引起自噬的功能障碍。25μm和50μm的c70-eda使psap蛋白表达增加70％和120％。ctsd是先被合成为52kda的蛋白质前体，然后经过酶辅助产生48kda的中间体，然后生成成熟蛋白(34kda和14kda)。类似地，ctsl也通过34kda中间体被加工成成熟形式(25kda)。c70-eda剂量依赖性地增加了ctsl和ctsd的总含量，包括中间体和成熟蛋白(图19)。

实施例13：氨基富勒烯混合物c70-eda体内抗肿瘤治疗

动物品系：balb/c雌鼠，5周，体重在16-20g之间。

肿瘤模型：小鼠乳腺癌4t1瘤株

实验分组：对照组：生理盐水组；peg-po实验组：浓度为40mm的peg-po；实验组：peg-po(40mm)包覆浓度分别为1、2、4mm的c70-eda组。

给药方式：瘤内注射50μl。

实验方法：皮下接种100μl浓度为2×10⁶/ml的4t1乳腺癌细胞，接种五天后，瘤内注射1mm、2mm、4mmc70-eda@peg-po各50μl，对照组瘤内注射等剂量的生理盐水和peg-po，每隔两天通过肿瘤内注射。用以下公式测量并计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)＝(长×宽²)。第1、3、5、7、9、11、14天测量肿瘤大小，观察治疗组对肿瘤的抑制情况。当空白组肿瘤长度超过10mm，停止给药治疗，解剖小鼠，取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器及肿瘤，用4％的多聚甲醛固定液固定。

实验结果：为了增加c70-eda在肿瘤组织的富集，使用磷酸化修饰的peg(分子量：1900，简称：peg-po)对c70-eda进行包覆(c70-eda@peg-po)。对比空白对照组与peg-po给药组发现peg-po对肿瘤没有显著的抑制作用；而c70-eda治疗后肿瘤重量和瘤体积显著小于对照组(图21)，说明c70-eda肿瘤抑制效果显著，并且呈现出浓度依赖性；高剂量组抑瘤率高于低剂量组，在最高剂量下其肿瘤体积减少了95％(图22左)，在治疗过程中未观察到用不同治疗方法治疗的小鼠体重发生明显变化，从而证明了c70-eda的生物相容性和安全性(图22右)。