一种用于核酸转染的多肽载体及其应用的制作方法

本发明涉及多肽载体的制备及应用领域，尤其涉及一种用于核酸转染的多肽载体及其应用。

背景技术：

多肽是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由10-100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。一般肽中含有的氨基酸的数目为二到九,根据肽中氨基酸的数量的不同,肽有多种不同的称呼：由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等，一直到九肽。通常由10~100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于10,000da（dalton，道尔顿），能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献把由2~10个氨基酸组成的肽称为寡肽（小分子肽）；10~50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质，换言之，蛋白质有时也被称为多肽。多肽也简称为肽，是20世纪被发现的。

活性肽主要控制人体的生长、发育、免疫调节和新陈代谢，它在人体处于一种平衡状态，若活性肽减少后，人体的机能发生重要变化，对于儿童来说，他的生长、发育变得缓慢，甚至停止，长久下去就形成了侏儒，对成年人或老年人，缺少活性肽后，自身的免疫力就会下降，新陈代谢紊乱，内分泌失调，引起各种疾病的产生，如失眠、身体消瘦或浮肿。由于活性肽还作用于神经系统，因此人体就会变得动作迟缓，头脑不再聪慧，更主要的是活性肽减少，直接引起人身体各部位逐渐出现全面衰老，引发各种疾病。

受体导向的多肽靶向药物载体小片段多肽具有低毒性、靶向性、无免疫原性、良好的生物相容性等特点肿瘤细胞表面会高表达多肽类受体，因此一些短肽可作为导向物，以配体受体特异性结合的方式应用于靶向药物递送系统。但目前关于核酸转染的多肽载体的制备与应用并不完善，难以达到预期的效果。

技术实现要素：

本发明克服了现有技术的不足，提供一种用于核酸转染的多肽载体及其应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种用于核酸转染的多肽载体及其应用，包括：外壳以及由多肽与核酸组成的内核，其特征在于，所述多肽载体表面带负电荷或电中性的具有靶向基团的生物大分子药物输送纳米颗粒，所述外壳是由不规整的阳离子脂质膜和聚阴离子先后紧密覆盖包裹组成。

所述阳离子脂质膜具有阳离子双层磷脂膜，所述聚阴离子通过静电和氢键作用包裹在所述纳米颗粒的表面，所述阳离子脂质膜是由阳离子脂质与中性脂质或胆固醇或两亲性分子形成的阳离子脂质体或阳离子胶束，所述聚阴离子选自透明质酸或透明质酸衍生物。

本发明所采用的第二种技术方案为：

步骤s1：将多肽药物与阳离子多肽通过可降解键连接起来获得序列为seqidno.1的多肽，然后将多肽与阳离子脂质体混合，得到混合液。

步骤s2：将步骤s1中的混合液加入到核酸药物中孵育制备得到三元纳米颗粒。

步骤s3：向所述三元纳米颗粒中加入透明质酸钠，再加入到核酸中，常温孵育，制得表面带正电荷的纳米颗粒。

步骤s4：将所述表面带正电荷的纳米颗粒通过酰胺键将抗体赫赛汀与透明质酸连接的透明质酸-赫赛汀溶液混合均匀，组装成带负电荷或电中性的纳米颗粒即得到用于核酸转染的多肽载体。

本发明一个较佳实施例中，所述步骤s1制备得到的混合液中的多功能多肽序列为seqidno.2或seqidno.3。

本发明一个较佳实施例中，将靶向多肽或肿瘤细胞穿透肽与阳离子多肽通过不同的间隔肽序列来制备多功能多肽。

本发明一个较佳实施例中，所述多肽是阳离子多肽或在水溶液中带正电荷的蛋白质。

本发明一个较佳实施例中，所述阳离子脂质体、多肽和核酸药物的质量比为2:3-5。

本发明一个较佳实施例中，所述透明质酸与核酸的质量比为1：1-4。

本发明一个较佳实施例中，所述透明质酸与抗体赫赛汀的摩尔质量比为20：6-8。

本发明解决了背景技术中存在的缺陷，本发明具备以下有益效果：

（1）本发明通过细胞穿透或者受体介导的方式进入内涵体，外面的透明质酸与多肽在内涵体内降解，暴露出的脂质通过融膜作用进入细胞质。然后解组装释放出核酸药物和多肽药物。由于多肽分布在整个纳米颗粒内部，所以在进入细胞后通过调节多肽药物与聚精氨酸的连接键的降解速度来控制多肽药物的释放位点。

（2）本发明通过her2受体通道被细胞内吞，然后ha-her与剩余的纳米颗粒分离，暴露出来的阳离子脂质膜通过融膜作用突破内涵体膜，将多肽、核酸，以及二者的复合物释放在细胞浆中，实现了利用靶向her2高表达的癌症的抗体、多肽和核酸的联合治疗。

（3）本发明与现有的脂质体/聚合物/核酸纳米颗粒相比，不仅避免了聚阳离子的毒性，而且有效突破了通过peg化实现体内长效循环的弊端。兼顾到达靶细胞之前的稳定性和进入靶细胞之后的生物响应性。

（4）本发明通过核酸、阳离子多肽即蜂毒素和阳离子脂质体，以及ha-her通过协同作用自组装构建的纳米载体的组成，利用蜂毒素和带正电荷并易于插在脂质膜上的性质，将阳离子脂质体、核酸和带正电荷的蜂毒素自组装形成表面带正电荷的纳米复合物，由于该复合物的各个组成部分不仅通过静电作用形成，而且脂质膜的密闭体系阻碍了蜂毒素的外泄，能够进一步阻止蜂毒素外泄，形成紧密的外壳。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明优选实施例多肽载体合成流程示意图。

具体地，1-脂质体，2-多肽，3-核酸，4-三元配合物，5-透明质酸，6-多肽载体。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

如图1所示，一种用于核酸转染的多肽载体及其应用，包括：一种用于核酸转染的多肽载体及其应用，包括：外壳以及由多肽与核酸组成的内核，其特征在于，多肽载体表面带负电荷或电中性的具有靶向基团的生物大分子药物输送纳米颗粒，外壳是由不规整的阳离子脂质膜和聚阴离子先后紧密覆盖包裹组成。

阳离子脂质膜具有阳离子双层磷脂膜，聚阴离子通过静电和氢键作用包裹在纳米颗粒的表面，阳离子脂质膜是由阳离子脂质与中性脂质或胆固醇或两亲性分子形成的阳离子脂质体或阳离子胶束，聚阴离子选自透明质酸或透明质酸衍生物。

本发明中多肽载体制备所采用的技术方案为：将多肽药物与阳离子多肽通过可降解键连接起来获得序列为seqidno.1的多肽，然后将多肽与阳离子脂质体混合，得到混合液。将混合液加入到核酸药物中孵育制备得到三元纳米颗粒。向三元纳米颗粒中加入透明质酸钠，再加入到核酸中，常温孵育，制得表面带正电荷的纳米颗粒。将表面带正电荷的纳米颗粒通过酰胺键将抗体赫赛汀与透明质酸连接的透明质酸-赫赛汀溶液混合均匀，组装成带负电荷或电中性的纳米颗粒即得到用于核酸转染的多肽载体。

本发明一个较佳实施例中，步骤s1制备得到的混合液中的多功能多肽序列为seqidno.2或seqidno.3。将靶向多肽或肿瘤细胞穿透肽与阳离子多肽通过不同的间隔肽序列来制备多功能多肽。

本发明一个较佳实施例中，多肽是阳离子多肽或在水溶液中带正电荷的蛋白质。阳离子脂质体、多肽和核酸药物的质量比为2:3-5。透明质酸与核酸的质量比为1：1-4。透明质酸与抗体赫赛汀的摩尔质量比为20：6-8。

本发明一个较佳实施例中，通过核酸、阳离子多肽即蜂毒素和阳离子脂质体，以及ha-her通过协同作用自组装构建的纳米载体的组成，利用蜂毒素和带正电荷并易于插在脂质膜上的性质，将阳离子脂质体、核酸和带正电荷的蜂毒素自组装形成表面带正电荷的纳米复合物，由于该复合物的各个组成部分不仅通过静电作用形成，而且脂质膜的密闭体系阻碍了蜂毒素的外泄，能够进一步阻止蜂毒素外泄，形成紧密的外壳。

本发明一个较佳实施例中，通过her2受体通道被细胞内吞，然后ha-her与剩余的纳米颗粒分离，暴露出来的阳离子脂质膜通过融膜作用突破内涵体膜，将多肽、核酸，以及二者的复合物释放在细胞浆中，实现了利用靶向her2高表达的癌症的抗体、多肽和核酸的联合治疗。

本发明一个较佳实施例中，与现有的脂质体/聚合物/核酸纳米颗粒相比，不仅避免了聚阳离子的毒性，而且有效突破了通过peg化实现体内长效循环的弊端。兼顾到达靶细胞之前的稳定性和进入靶细胞之后的生物响应性。

本发明一个较佳实施例中，通过细胞穿透或者受体介导的方式进入内涵体，外面的透明质酸与多肽在内涵体内降解，暴露出的脂质通过融膜作用进入细胞质。然后解组装释放出核酸药物和多肽药物。由于多肽分布在整个纳米颗粒内部，所以在进入细胞后通过调节多肽药物与聚精氨酸的连接键的降解速度来控制多肽药物的释放位点。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。