一种pickering乳液及其制备方法和作为疫苗免疫佐剂中的应用

1.本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种pickering乳液及其制备方法和 作为疫苗免疫佐剂中的应用。


背景技术：

2.传染性疾病一直是威胁人类健康最大的因素，尤其是新型病原体导致的 疾病往往给全球卫生事业带来巨大挑战，给人类生产生活带来严重影响甚至 是致命打击。佐剂可降低疫苗用量，增强免疫原性，在疫情爆发时有效应对 疫苗产量及供应问题。目前已批准使用的佐剂主要包括铝盐类、乳剂类，toll 样受体激动剂类等。传统铝佐剂虽已广泛应用于多种疫苗，但其只能增强体 液免疫不能增强细胞免疫且对亚单位疫苗作用有限，其它佐剂如脂质体、免 疫调节物类、寡核苷酸类、多糖类、细胞因子类等目前均尚未实现临床应用， 因此探索安全高效的新型佐剂仍是疫苗学研究的重点。
3.乳液(emulsion)是除铝佐剂外应用最广泛的佐剂类型。乳液作为佐剂 具有以下特征：保护抗原、增加抗原表面积，调节免疫应答、缓释抗原、物 化性质优良；加之制备方法简单，成本较低，适合大规模生产，因而被认为 是一种优良的疫苗佐剂。但仍存在以下几方面问题有待解决:
4.1.安全性和稳定性有待进一步改善；
5.2.免疫增强机制未予阐明，目前研究认为乳液类佐剂通常与免疫细胞募 集、抗原摄取有关，并倾向于th1型免疫反应，与tlr无关，但深层次的免 疫应答机制未知；
6.3.具体的剂量、免疫程序和节省抗原的程度未明晰，难以衡量乳液佐剂 对疫苗的辅助作用究竟到达何种程度，与目前已批准使用的佐剂对比是否效 果更好。因此，提供一种既能避免使用表面活性剂又能稳定油水界面的乳液 体系，并将其设计成新型的佐剂具有重要的现实意义。
7.pickering乳液是指采用固体粒子稳定油水体系的一种特殊乳液。相较普 通乳液，pickering不需添加表面活性剂，且引入固体粒子的浓度大大低于表 面活性剂的用量，对人体和环境的毒害作用远小于表面活性剂，故而安全性 可能更高；另外，固体粒子在油水界面发生不可逆吸附，形成的界面膜牢固， 可防止液滴聚并，因此pickering乳液体系不易受外界酸碱性、盐浓度、温度 及油相组成的影响，具有更强的稳定性。xia等构建了基于plga粒子稳定的 pickering乳液，发现其佐剂效果明显优于以传统表面活性剂稳定的普通乳液 佐剂，且优化的pickering乳液可激活抗原呈递细胞并增强抗原募集。沙眼衣 原体会引起眼部或生殖器感染，其主要并发症包括致盲性沙眼和生殖功能障 碍，例如尿道炎，宫颈炎和输卵管炎，根据世界卫生组织发布的最新估计， 每年登记的新病例超过1.3亿。可导致生殖后遗症，如盆腔炎(pid)，早产和 梗阻性不育。据估计，40％
‑
60％的pid病例和30％的异位妊娠是由沙眼衣原 体感染引起的，给人类医疗保健造成巨大的社会经济负担我国自2001年监控 以来，报告的ct病理数目已超过淋病，居8种性传播病原体首位。因此，合 理
设计一种新型的pickering乳液作为ct疫苗佐剂解决普通乳液的安全性和稳 定性问题，具有及其重要的价值和意义。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明提供了一种pickering乳液及其制备方法和其作为疫苗 免疫佐剂的应用。本发明提供的pickering乳液具有良好的稳定性和明显增强 的免疫效果，且安全性高。
9.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
10.本发明提供一种pickering乳液的制备方法，包括：
11.将氧化石墨烯(graphene oxide,go)和水混合，得到水相；
12.以液体石蜡(liquidparaffin,lp)为油相，将油相和水相混合、超声，得到 pickering乳液。
13.一些实施方案中，所述水相和油相的质量比为10：(1～4)。一些具体实施 例中，所述水相和油相的质量比为10:1、10:2或10:4。
14.一些实施方案中，所述水相中，氧化石墨烯的浓度为1～3mg/ml。一些具 体实施例中，所述水相中，氧化石墨烯的浓度为1mg/ml。
15.本发明中，氧化石墨烯的厚度1
‑
3nm，片径小于5μm。一些具体实施例 中，氧化石墨烯的片径具体可为＜15nm、15nm～200nm或0.5μm～5μm。本 发明对氧化石墨烯的来源没有特殊限定，可通过市售获得，也可通过本领域 的常规方法制得，如hammer法。
16.一些实施方案中，所述超声为每间隔5s～15s超声5s～10s，超声的功率为 300～400w，超声的总时间为5min～15min。一些具体实施例中，所述超声为每 间隔10s超声10s，超声的功率为325w，超声的总时间为10min。
17.本发明还提供了由以上制备方法制得的pickering乳液。
18.其中，所述pickering乳液的平均粒径为1981
‑
4203nm。
19.本发明还提供了所述pickering乳液在制备疫苗免疫佐剂中的应用。
20.所述疫苗为减毒/灭活疫苗、重组蛋白疫苗或核酸疫苗。
21.一些实施方案中，所述疫苗为沙眼衣原体疫苗。一些具体实施例中，所 述沙眼衣原体疫苗具体为
p
orf5重组蛋白疫苗。
22.本发明制备的go
‑
pickering乳液经稳定性测试和体外评估，显示出良好 的稳定性和明显增强的佐剂效果；以ctporf5重组蛋白疫苗为模式抗原，建 立小鼠生殖道抗ct感染模型，评估了go
‑
pickering佐剂对机体的免疫保护力 和安全性，结果显示，本发明提供的go
‑
pickering乳液能够显著增强小鼠体 液免疫，且安全性较高。
23.1.本发明go
‑
pickering乳液的平均粒径为1981
‑
4203nm，其中，go的准 二维结构和巨大的比表面积利于吸附抗原，减缓抗原释放，促进抗原识别和 呈递。
24.2.go表面有大量含氧官能团，可使不同片层之间相互排斥，因而在水油 体系中的分散性良好；同时这些官能团大多具有亲水性，使其易于结合到油 乳界面防止液滴聚集，故而本发明go
‑
pickering乳液体系不易受ph值、盐浓 度、温度及油相组成等因素的影响，注入机体后可保持稳定，实现抗原缓慢 释放。
25.3.go
‑
lppickering佐剂组igg抗体高于单独疫苗组和铝佐剂组，其igg 平均值约
为单独疫苗组的10
‑
100倍，约为铝佐剂组的2
‑4‑
倍，因此go
‑
lppickering佐剂能显著增强小鼠的体液免疫。同时，go
‑
lp pickering佐剂能有 效刺激免疫增强的细胞因子ifn
‑
γ及il
‑
2产生，并降低免疫抑制的细胞因子 il
‑
10的量。综合以上结果可知，go
‑
lppickering佐剂能显著促进机体的体液 免疫，促使小鼠获得强大的免疫保护力，其效果强于现有的铝佐剂。
26.4.本发明go
‑
pickering乳液体系中，go的浓度远远小于表面活性剂的 用量，因此可较大程度上降低生物毒性，可有效解决传统乳液佐剂的安全性 问题。
附图说明
27.图1示实施例1～3go
‑
lp pickering乳液的形貌观察结果图；其中，1
‑
a 从左到右依次为示实施例3、实施例1和实施例2的go
‑
lp pickering乳液， 1
‑
b为1mg/ml的go分散液(片径为0.5～5μm)；
28.图2示实施例1～3go
‑
lp pickering乳液的显微镜观察结果，2
‑
a示实施 例2的go
‑
lp pickering乳液(水/油相比10:1)，2
‑
b示实施例1的go
‑
lp pickering乳液(水/油相比10:2)，2
‑
c示实施例3的go
‑
lp pickering乳液(水 /油相比10:4)，400
×
；
29.图3示实施例1～3go
‑
lp pickering乳液的马尔文粒度仪检测粒径和均匀 度检测结果图；3
‑
a示实施例2的go
‑
lp pickering乳液，3
‑
b示实施例1的 go
‑
lp pickering乳液，3
‑
c示实施例3的go
‑
lp pickering乳液，3
‑
d示各go
‑
lp pickering乳液的粒径和均匀度检测数据；
30.图4示实施例1go在pickering乳液液滴表面分布的荧光图，其中，4
‑
a 为荧光激发下的观察结果，4
‑
b为明场下观察结果；
31.图5示实施例1go
‑
lp pickering乳液的抗原缓释吸附、缓释折线图；
32.图6示实施例1go
‑
lp pickering乳液的抗原在pickering液滴表面分布结 果，5
‑
a为荧光激发下的观察结果，5
‑
b为明场下观察结果；
33.图7示实施例1的go
‑
lp pickering乳液作为porf5疫苗的免疫佐剂对小 鼠进行免疫，lgg抗体水平的检测结果；其中，7
‑
a为第4、6、8周的小鼠体 液中igg的抗体水平；7
‑
b为第8周各组igg、igg1、igg2a的抗体水平；7
‑
c 为不同佐剂剂量及不同免疫途径的小鼠igg、igg1、igg2a的抗体水平；
34.图8示实施例1中go
‑
lp pickering的稳定性观察结果，其中，9
‑
a示静 置过夜后的状态，9
‑
b示静置6个月后的状态；从左至右依次为水相/油相之 比为10:1、10:2、10:4的结果；
35.图9示go
‑
lppickering的安全性评价结果。
具体实施方式
36.本发明提供了一种pickering乳液及其制备方法和作为疫苗免疫佐剂的应 用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要 指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它 们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了 描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和 应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
37.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
38.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
39.实施例1本发明go
‑
lp pickering乳液的制备
40.将氧化石墨烯(片径为0.5～5μm)和水混合，得到氧化石墨烯浓度为 1mg/ml的水相；
41.以液体石蜡为油相，将水相和油相按照10:2的比例混合，在325w功率 下超声10s，间隔10s，如此反复超声，共超声10min，得到go
‑
lp pickering 乳液。形貌观察结果见图1
‑
b，显微镜观察结果见图2
‑
b，(400
×
),马尔文粒 度仪检测粒径和均匀度检测结果见图3
‑
b，经测定go
‑
lp pickering对bsa的 包埋率埋率为80％。
42.实施例2本发明go
‑
lp pickering乳液的制备
43.将氧化石墨烯(片径为0.5～5μm)和水混合，得到氧化石墨烯浓度为 1mg/ml的水相；
44.以液体石蜡为油相，将水相和油相按照10:1的比例混合，在325w功率 下超声10s，间隔10s，如此反复超声，共超声10min，得到go
‑
lp pickering 乳液。形貌观察结果见图1
‑
a，显微镜观察结果见图2
‑
a,马尔文粒度仪检测粒 径和均匀度检测结果见图3
‑
a。
45.实施例3本发明go
‑
lp pickering乳液的制备
46.将氧化石墨烯(片径为0.5～5μm)和水混合，得到氧化石墨烯浓度为 1mg/ml的水相；
47.以液体石蜡为油相，将水相和油相按照10:4的比例混合，在325w功率 下超声10s，间隔10s，如此反复超声，共超声10min，得到go
‑
lp pickering 乳液。
48.实施例4go
‑
lp pickering乳液的测试和表征
49.实施例1～3的go
‑
lp pickering乳液形貌观察结果见图1，显微镜观察结 果见图2，马尔文粒度仪检测粒径和均匀度检测结果见图3；
50.由图1结果可知，上层为pickering乳液，下层为未结合的go水分散液， 下层颜色较原go分散液浅，说明go片层已进入pickering体系中。随着油 相减少，上层pickering乳液也变少，下层的透明度差异明显。
51.由图2～3可知，实施例1制得的go
‑
lp pickering乳液粒径更小更均匀。
52.实施例5荧光标记分析
53.透析法洗涤步骤：将go稀释成1mg/ml备用，取10ml与dmso溶解的 罗丹明b混合，避光慢摇使其吸附结合过夜。将以上混合物置于8000
‑
14000 的透析袋中透析48h，将未结合的荧光染料洗涤干净。
54.荧光标记完成后，超声制备10:2的go
‑
pickering乳液，荧光显微镜观察结 果见图4。
55.由图4结果可知，go
‑
lp pickering乳液中，go分布在液滴表面。
56.实施例6go
‑
lppickering抗原吸附试验
57.抗原缓释实验：3ml go或实施例1go
‑
lppickering乳液与1ml bsa (100mg/ml)混合冰上摇4h,将其置于透析袋中，外液为300ml双蒸水，透 析48h,每隔6小时取500ul外液检测蛋白浓度，计算蛋白析出率。结果见图5。
58.抗原吸附实验：将go
‑
lp pickering与fitc
‑
bsa冰上混合4h(混合比例 与动物实
验一致，1mlpickering乳液中含500μg bsa)，取乳液于荧光显微 镜下观察，结果见图6。
59.结果显示，bsa位于go
‑
lppickering乳液液滴的表面，具有较强的吸附 性，难以通过透析洗脱，从而有利于抗原提呈细胞的识别和呈递，增强免疫 反应。
60.实施例7体液免疫试验
61.每只雌性balb/c小鼠注射0.1ml含50μgporf5蛋白的实施例1的 go
‑
lppickering乳液，于0、2、4周免疫三次。取第4、6、8周的小鼠血清， 间接elisa法测定igg的抗体水平(图7
‑
a)，并比较第8周各组igg、igg1、 igg2a的抗体水平(图7
‑
b)，以及不同佐剂剂量及不同免疫途径的小鼠igg、 igg1、igg2a的抗体水平(图7
‑
c)，结果见图7。
62.由以上结果可知，各组小鼠的igg抗体随免疫时间变化，可以看出，各 组小鼠抗体随免疫次数增加基本呈增加趋势，说明该重组蛋白疫苗具有良好 的免疫原性，go
‑
lp pickering佐剂组igg抗体高于单独疫苗组和铝佐剂组， 其igg平均值约为单独疫苗组的10
‑
100倍，约为铝佐剂组的2
‑4‑
倍，因此 go
‑
lppickering佐剂能显著增强小鼠的体液免疫。
63.初免后第8周即三免后第4周，检测各组小鼠血清中igg及其亚型igg1, igg2a发现，go
‑
lppickering佐剂组小鼠igg,igg1,igg2a均高于单独疫苗， (p<0.05)且显著高于铝佐剂组(p<0.05)，，各组小鼠的igg1平均值高于igg2a, 可据此粗略推断各组佐剂辅助porf5重组蛋白疫苗激发机体产生倾向于th1 型的免疫反应。
64.go
‑
lp pickering佐剂5倍稀释后其佐剂不原始佐剂产生的igg水平无明 显差异，因此基于安全性和成本考虑，可采用5倍稀释的pickering作为实际 使用的佐剂，以节约成本。
65.实施例8稳定性测试
66.(1)离心测试
67.10000g离心10min，液滴加速浮于上层，大小未有明显变化
68.(2)高温测试
69.沸水浴中放置20min,乳液外观无变化，粒子大小及均匀度无变化
70.(3)冻干测试
71.真空冷冻干燥后，震动混匀于水中，粒子大小未见变化。
72.(4)长期稳定性观察
73.静置6个月后go分散到上层pickering乳液中，使下层较澄清颜色很浅 甚至基本完全清亮，但上层乳液的体积及形貌未见明显变化但颜色变得更深。 结果见图8。
74.结论：静置6个月后粒子大小无明显变化，略微有增大，但由于pickering 乳液液滴密度比水小，需要一定时间静置才能完全浮于上层，因此6个月更 长时间下层才完全澄清无色。
75.实施例9安全性评价
76.将balb/c小鼠(平均体重30g)禁食8h，每只小鼠腹腔一次性注射0.6ml 实施例1～3的go
‑
lp pickering(最大给药)，观察其活动状态，发现小鼠状态 正常，无死亡，7天后解剖小鼠观察脏器，观察go的分布。其中，实施例1 的结果见图9。
77.结果显示，本发明pickering乳液高剂量腹腔注射后，其心脏、肝脏、肺部 无明显外观变化，大肠处仍有未吸收的黑色go，在小鼠皮下形成囊块包裹未 能及时吸收戒代谢的
pickering乳液，避免其游走于腹腔脏器引起损害，另一 方面可能形成缓释作用。本发明pickering乳液大大减少了go的用量，避免 了过量go对机体代谢形成负担，安全性高，同时降低了制备成本。
78.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。