1.本发明涉及干细胞医疗研究技术领域，具体为干细胞应用在治疗神经系统疾病的移植方法。
背景技术：
2.采用干细胞移植治疗复杂神经系统疾病，是当前的发展趋势和治疗方向。
3.干细胞具有向神经细胞定向分化的潜能，在理论上，干细胞被移植入神经系统微环境后，就有可能定向分化为神经元和神经胶质细胞，从而发挥其细胞替代与神经修复功能。
4.但是，神经系统具有高度复杂性，外源干细胞多难以整合入宿主神经系统内。它们一般会在一段时间内独立存活于其中，并通过旁分泌神经营养因子及免疫调节等方式激活内源神经干细胞分化，进而修复与治疗神经系统疑难疾病。即使有少数移植后分化的干细胞整合在宿主神经系统内，但其是否发挥了神经替代功能，尚需要进一步验证。
5.采用干细胞移植治疗神经系统疑难疾病，选择恰当的干细胞输入途径尤为关键，因为这能保证干细胞发挥最大效能。
技术实现要素：
6.(一)解决的技术问题
7.本发明提供了干细胞应用在治疗神经系统疾病的移植方法，通过动物细胞离体培养实验，采用同种颅内移植实验定向移植nscs到同品系小鼠不同侧大脑半球，应用于对小鼠脑损伤修复治疗。
8.(二)技术方案
9.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：干细胞应用在治疗神经系统疾病的移植方法，通过动物细胞离体培养实验，采用同种颅内移植实验定向移植nscs到同品系小鼠不同侧大脑半球，对小鼠脑损伤修复治疗。
10.优选的，所述动物细胞离体培养实验，包括以下步骤：
11.s1
‑
1：取4只孕c57bl/6小鼠胚胎端脑；
12.s1
‑
2：分别无菌分离纯化nscs并放入培养基中；
13.s1
‑
3：分别取剪碎端脑用0.25％胰蛋白酶和0.02％edta处理消化后过滤，弃上清液加入nscs培养基中重悬细胞；
14.s1
‑
4：分别接种到培养瓶中并放置到培养温度37℃，气体体积分数为5％二氧化碳/95％空气、饱和湿度条件下的培养箱中培养，每天观察细胞形态；
15.s1
‑
5：培养完成后，分别将悬浮细胞转移至对应离心管中1000r/min离心处理10min，弃上清液，加0.25％胰蛋白酶和0.02％edta消化后1000r/min离心处理10min，再弃上清液，分别加入对应nscs培养基中，进行传代培养；
16.s1
‑
6：用brdu对nscs标记处理，将上述细胞用0.25％胰蛋白酶和0.02％edta消化
后，放置于离心管中洗涤3次。
17.优选的，所述颅内移植实验，包括以下步骤：
18.s2
‑
1：将s1
‑
1中二只小鼠麻醉并固定，清洁皮毛，依次剪除一只小鼠鼠毛暴露头部皮肤，碘伏消毒，切开皮肤，在小鼠右侧颅骨用灭菌的磨钻钻孔，再用灭菌进样器注射细胞悬液5μl，细胞总量5
×
105，注射结束留针5min后拔针逐层消毒缝合头皮；
19.s2
‑
2：将s1
‑
1中另二只小鼠麻醉并固定，清洁皮毛，依次剪除一只小鼠鼠毛暴露头部皮肤，碘伏消毒，切开皮肤，在小鼠左侧颅骨用灭菌的磨钻钻孔，再用灭菌进样器注射细胞悬液5μl，细胞总量5
×
105，注射结束留针5min后拔针逐层消毒缝合头皮。
20.优选的，在手术麻醉清醒后进行神经功能检测评定，取一只评分高的左侧颅内移植实验小鼠和一只评分高的右侧颅内移植实验小鼠用于观察。
21.优选的，细胞移植后分别处死评分高的左侧颅内移植实验小鼠和评分高的右侧颅内移植实验小鼠，灌注固定后取出大脑，作大脑冠状面连续切片，采用he染色观察两侧脑组织的移植损伤情况。
22.优选的，在手术麻醉清醒后进行神经功能检测评定，取一只评分低的左侧颅内移植实验小鼠和一只评分低的右侧颅内移植实验小鼠用于观察。
23.优选的，细胞移植后分别处死评分低的左侧颅内移植实验小鼠和评分低的右侧颅内移植实验小鼠，灌注固定后取出大脑，作大脑冠状面连续切片，采用he染色观察两侧脑组织的移植损伤情况。
24.(三)有益效果
25.本发明提供了干细胞应用在治疗神经系统疾病的移植方法，具备以下有益效果：
26.本发明通过选取4只孕c57bl/6小鼠，通过动物细胞离体培养实验，取小鼠胚胎端脑进行离体培养试验，在颅内移植实验后期，选取的神经功能检测评定评分高的左侧颅内移植实验小鼠和一只评分高的右侧颅内移植实验小鼠用于观察时，相对于评分低的，评分高的左右侧脑组织结构均较为完整，细胞排列规则，少见瘢痕组织形成，大量移植物沿注射针道分布，因此采用干细胞移植治疗神经系统，选择胚胎端脑nscs输入途径，细胞移植到同品系小鼠不同侧大脑半球，在神经功能检测评定较好的情况下，能保证干细胞发挥最大效能。
具体实施方式
27.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.实施例一
29.本发明提供一种技术方案：干细胞应用在治疗神经系统疾病的移植方法，通过动物细胞离体培养实验，采用同种颅内移植实验定向移植nscs到同品系小鼠不同侧大脑半球，对小鼠脑损伤修复治疗。
30.作为本发明的一种技术优化方案，动物细胞离体培养实验，包括以下步骤：
31.s1
‑
1：取2只孕c57bl/6小鼠胚胎端脑；
32.s1
‑
2：在体视镜下分别无菌分离纯化nscs并放入培养基中；
33.s1
‑
3：在超净台内分别取剪碎端脑用0.25％胰蛋白酶和0.02％edta处理消化5min后通过过滤筛过滤，过滤伴随离心处理，再弃上清液加入nscs培养基中重悬细胞，调整细胞密度为105‑
106个/ml；
34.s1
‑
4：分别接种到培养瓶中并放置到培养温度37℃，气体体积分数为5％二氧化碳/95％空气、饱和湿度条件下的培养箱中培养，每天观察细胞形态；
35.s1
‑
5：培养完成后，分别将悬浮细胞转移至对应离心管中1000r/min离心处理10min，弃上清液，加0.25％胰蛋白酶和0.02％edta消化后1000r/min离心处理10min，再弃上清液，分别加入对应nscs培养基中，进行传代培养；
36.s1
‑
6：用brdu对nscs标记处理，将上述细胞用0.25％胰蛋白酶和0.02％edta消化后，放置于离心管中洗涤3次。
37.作为本发明的一种技术优化方案，颅内移植实验，包括以下步骤：
38.将s1
‑
1中二只小鼠麻醉并固定，清洁皮毛，依次剪除一只小鼠鼠毛暴露头部皮肤，碘伏消毒，切开皮肤，在小鼠右侧颅骨用灭菌的磨钻钻孔，再用灭菌进样器注射细胞悬液5μl，细胞总量5
×
105，注射结束留针5min后拔针逐层消毒缝合头皮。
39.作为本发明的一种技术优化方案，在手术麻醉清醒后进行神经功能检测评定，取一只评分高的右侧颅内移植实验小鼠和一只评分低的右侧颅内移植实验小鼠分别观察。
40.作为本发明的一种技术优化方案，细胞移植后分别处死取一只评分高的右侧颅内移植实验小鼠和一只评分低的右侧颅内移植实验小鼠用于观察，灌注固定后取出大脑，作大脑冠状面连续切片，采用he染色观察两侧脑组织的移植损伤情况。
41.实施例二
42.本发明提供一种技术方案：干细胞应用在治疗神经系统疾病的移植方法，通过动物细胞离体培养实验，采用同种颅内移植实验定向移植nscs到同品系小鼠不同侧大脑半球，对小鼠脑损伤修复治疗。
43.作为本发明的一种技术优化方案，动物细胞离体培养实验，包括以下步骤：
44.s1
‑
1：取2只孕c57bl/6小鼠胚胎端脑；
45.s1
‑
2：在体视镜下分别无菌分离纯化nscs并放入培养基中；
46.s1
‑
3：在超净台内分别取剪碎端脑用0.25％胰蛋白酶和0.02％edta处理消化5min后通过过滤筛过滤，过滤伴随离心处理，再弃上清液加入nscs培养基中重悬细胞，调整细胞密度为105‑
106个/ml；
47.s1
‑
4：分别接种到培养瓶中并放置到培养温度37℃，气体体积分数为5％二氧化碳/95％空气、饱和湿度条件下的培养箱中培养，每天观察细胞形态；
48.s1
‑
5：培养完成后，分别将悬浮细胞转移至对应离心管中1000r/min离心处理10min，弃上清液，加0.25％胰蛋白酶和0.02％edta消化后1000r/min离心处理10min，再弃上清液，分别加入对应nscs培养基中，进行传代培养；
49.s1
‑
6：用brdu对nscs标记处理，将上述细胞用0.25％胰蛋白酶和0.02％edta消化后，放置于离心管中洗涤3次。
50.作为本发明的一种技术优化方案，颅内移植实验，包括以下步骤：
51.将s1
‑
1中二只小鼠麻醉并固定，清洁皮毛，依次剪除一只小鼠鼠毛暴露头部皮肤，
碘伏消毒，切开皮肤，在小鼠左侧颅骨用灭菌的磨钻钻孔，再用灭菌进样器注射细胞悬液5μl，细胞总量5
×
105，注射结束留针5min后拔针逐层消毒缝合头皮。
52.作为本发明的一种技术优化方案，在手术麻醉清醒后进行神经功能检测评定，取一只评分高的左侧颅内移植实验小鼠和一只评分低的左侧颅内移植实验小鼠分别观察。
53.作为本发明的一种技术优化方案，细胞移植后处死一只评分高的左侧颅内移植实验小鼠和一只评分低的左侧颅内移植实验小鼠，灌注固定后取出大脑，作大脑冠状面连续切片，采用he染色观察两侧脑组织的移植损伤情况。
54.从nscs移植对小鼠脑损伤影响来看，通过比较评分高的左侧颅内移植实验小鼠与评分高的右侧颅内移植实验小鼠的移植损伤情况可以看出，左右侧脑组织结构均较为完整，细胞排列规则，少见瘢痕组织形成，大量移植物沿注射针道分布，通过比较评分低的左侧颅内移植实验小鼠与评分低的右侧颅内移植实验小鼠的移植损伤情况可以看出，左右侧脑组织结构均均破坏较为严重。
55.综上可得，本发明采用干细胞移植治疗神经系统，选择胚胎端脑nscs输入途径，细胞移植到同品系小鼠不同侧大脑半球，在神经功能检测评定较好的情况下，能保证干细胞发挥最大效能。
56.需要说明的是，在本文中，诸如术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
57.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。