一种三白草提取物的提取方法及含有提取物的化妆品与流程

1.本发明涉及三白草的提取技术领域，尤其是涉及一种三白草提取物的提取方法及含有提取物的化妆品。


背景技术：

2.皮肤黑化是皮肤细胞对内外因素发生反应所引起的，代表性的因素是皮肤暴露在紫外线之下。皮肤暴露在紫外线中会使酪氨酸酶被激活，它与皮肤组织中的酪氨酸发生作用生成多巴，然后通过生成多巴醌在皮肤色素细胞的黑素体中合成黑色素。这种黑色素被传递至皮肤角质形成角质细胞，依靠角质化过程到达皮肤表面，保护皮肤免受紫外线的侵袭。黑色素是人体不可或缺的防紫外线剂，它发挥着自由基清除剂的作用，有效清除使蛋白质、脂质、核酸等生物成分变形的多种自由基。但是，如果黑色素在局部过多合成或者皮肤病变、老化导致皮肤生理机能下降的话，黑色素便会沉积在皮肤表面，诱发褐斑、雀斑及多种色素沉着。
3.在化妆品中通过添加有效抑制酪氨酸酶活性的物质或者阻碍黑色素生成反应的物质，可以减少黑色素生成。熊果苷、抗坏血酸、对苯二酚、桑白皮提取物和甘草提取物等对减少黑色素的生成具有较好的效果。熊果苷具有优秀的抑制酪氨酸酶活性的作用，但是它存在着会变色和时间久了效力会降低等问题，性能不稳定，而且对皮肤的刺激性较大，在使用上存在局限性。抗坏血酸抑制酪氨酸活性的效果较低，其分子本身的稳定性就偏低，所以不适合用作黑色素生成抑制剂。对苯二酚对皮肤的刺激性很强，存在安全性问题，目前在配制化妆品原料时，它的使用性受到了限制。另外，大部分植物提取物只在高浓度状态下才能表现出较高的抑制酪氨酸酶活性效果，在低浓度状态下几乎没有抑制效果。现有的黑色素生成抑制剂，在进行人体皮肤临床实验时，美白效果微乎其微。
4.三白草是多年生草本植物。三白草的全草都可以入药，三白草的嫩叶能当蔬菜食用，它营养价值很高，而且保健功效出色，人们食用它以后能为身体补充大量的槲皮甙还能让人体吸收一些维生素和矿物质，提高人类的肠道功能。三白草入药不仅清热解毒还能消炎杀菌，而且能润肺止咳。三白草还是一种能利湿退黄的中药材。三白草还可以作为美白产品使用，但是直接从三白草中萃取出的成分美白效果较差。
5.发酵是微生物利用自身带有的酶来分解有机物，把除碳源和氮源以外的其他营养成分当做食物，制造多种物质或变形的一系列过程。根据不同情况和菌的特性能制造出产生青霉素等抗生物质或用作皮肤保湿剂的β
‑
葡聚糖、 r
‑
pga、神经酰胺等多种生理活性物质。微生物中的多种酶活性物质会通过我们熟悉的endo和exo机理发生反应，不是所有提取物接种了微生物都会发酵，而且即使经过了发酵过程，也不是所有提取物的生理活性都能得到增进。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种三白草提取物的提取方法，利用酒曲对三白草内含有的
有效成分进行发酵、提取，制备出增进皮肤美白功效的化妆品原料，提高化妆品的美白效果。本发明的另一个目的是提供一种含有三白草提取物的化妆品。
7.为实现上述目的，本发明提供了一种三白草提取物的提取方法，包括以下步骤：
8.s1、制备三白草提取物，将三白草的有效部分冷浸在水中，然后进行高压灭菌萃取，制备出三白草提取物；
9.s2、制备三白草发酵提取物，将酒曲加入到步骤s1获得的三白草提取物中进行发酵，制备三白草发酵提取物；
10.s3、分馏，将步骤s2获得的三白草发酵提取物进行分馏，分馏成n
‑
己烷、亚甲基二醇、乙酸乙酯、丁醇和水，获得丁醇分馏物或水分馏物。
11.优选的，所述步骤s1中，三白草的有效部分包括叶、茎、根中的一种或几种的混合物。
12.优选的，所述步骤s1中，三白草的有效部分为粉碎的干燥的三白草叶。
13.优选的，所述步骤s1中，高压灭菌萃取的温度为100℃
‑
140℃，气压为1
‑
2 倍大气压，萃取时间为10
‑
20分钟。
14.优选的，所述步骤s2中，发酵的温度为23℃
‑
29℃，发酵的时间为3
‑
7 天。
15.优选的，所述步骤s2中，酒曲在三白草提取物中的质量百分比为 0.5
‑
2％。
16.一种化妆品，含有采用上述三白草提取物的提取方法提取的丁醇分馏物或水分馏物。
17.优选的，丁醇分馏物或水分馏物占化妆品原料总重量的0.00001
‑
4％。
18.优选的，化妆品的剂型为溶液、悬浊液、乳浊液、软膏、凝胶、面霜、乳液、粉饼、香皂、含表面活性剂的清洁剂、精油、乳浊液粉底、蜡粉底、面膜、按摩霜或喷雾。
19.本发明所述的一种三白草提取物的提取方法及含有提取物的化妆品的优点和积极效果是：
20.(1)采用三白草的提取物作为美白化妆品的原料，生物安全性高、不刺激，无毒副作用。
21.(2)采用酒曲对三白草的提取物进行发酵，对三白草提取物中的成分进行分解转化，生物转化成溶于丁醇或水的小分子成分，小分子有效成分更易于吸收。将有效成分集中在丁醇或水分馏物中，提高有效成分的浓度，提高三白草提取物的美白效果。
22.下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施方式
23.以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
24.一种三白草提取物的提取方法，包括以下步骤：
25.s1、制备三白草提取物，将三白草的有效部分冷浸在水中，然后进行高压灭菌萃取，制备出三白草提取物。三白草的有效部分包括叶、茎、根中的一种或几种的混合物；优选的，三白草的有效部分为粉碎的干燥的三白草叶。高压灭菌萃取的温度为100℃
‑
140℃，气压为1
‑
2倍大气压，萃取时间为10
‑
20 分钟。制备三白草提取物优选的技术方案是：将干燥的三白草叶粉碎后冷浸在水中，在121℃、1.5倍大气压下进行15分钟的高压灭菌萃取，制备出三白草提取物，将三白草中含有的对酪氨酸酶和黑色素生成具有较好抑制作用的有效成
分提取出来。
26.s2、制备三白草发酵提取物，将酒曲加入到步骤s1获得的三白草提取物中进行发酵，制备三白草发酵提取物。酒曲为采用济州shindari传统发酵工艺制造的酒曲，即运用济州民间流传的传统发酵工艺，在米饭、大麦饭或稍微发馊的米饭中加入酒曲，发酵制成的低浓度酒精饮料。发酵的温度为23℃
‑
29 ℃，发酵的时间为3
‑
7天。酒曲在三白草提取物中的质量百分比为0.5
‑
2％。三白草发酵提取物的优选技术方案是：在1kg三白草提取物中添加1％的酒曲，使用5l的发酵槽在26℃的条件下发酵5天，对培养液进行离心分离处理，去除培养菌；并在121℃、1.5倍大气压下灭菌15分钟，制备出三白草发酵提取物。
27.采用高性能液态色谱仪对三白草提取物和三白草发酵提取物进行测量，结果显示，三白草提取物中含有40组主要成分，随着发酵的进展，生物转化为4
‑
5组，减少了三白草发酵提取物中的组分种类。
28.s3、分馏，将步骤s2获得的三白草发酵提取物进行分馏，使用减压浓缩器对三白草发酵提取物进行减压浓缩后，加水使其悬浊，添加n
‑
己烷进行分馏，仅分离n
‑
己烷层，从而制造n
‑
己烷分馏物；在分离完上述n
‑
己烷层后剩余的溶液(水层)中添加等量的二氯甲烷进行分馏，仅分离二氯甲烷层，从而制造二氯甲烷分馏物；在分离完上述二氯甲烷层后剩余的溶液(水层)中添加等量的乙酸乙酯进行分馏，仅分离乙酸乙酯层，从而制造乙酸乙酯分馏物；在分离完上述乙酸乙酯层后剩余的溶液(水层)中添加等量的丁醇进行分馏，仅分离丁醇层，从而制造丁醇分馏物；最后将剩余的溶液当做水分馏物。使用减压浓缩器对通过上述分馏制造的不同溶剂的三白草发酵分馏物进行减压浓缩后，在
‑
20℃的条件下冻结干燥，获得各种分馏物。丁醇分馏物和水分馏物中含有步骤s2中的生物转化成分，生物转化成分对酪氨酸酶和黑色素生成具有良好的抑制功效。
29.采用上述三白草提取物的提取方法提取的丁醇分馏物或水分馏物应用于皮肤美白化妆品中。丁醇分馏物或水分馏物占化妆品原料总重量的 0.00001
‑
4％。丁醇分馏物或水分馏物的含量不足总重量的0.00001％时，化妆品原料组成物将难以带来实质性的美白和皱纹改善效果；超过总重量的4.0％时会影响剂型的安全和稳定性，增加含量并不能提升效果，不够经济实惠。
30.皮肤美白化妆品的剂型为溶液、悬浊液、乳浊液、软膏、凝胶、面霜、乳液、粉饼、香皂、含表面活性剂的清洁剂、精油、乳浊液粉底、蜡粉底、面膜、按摩霜或喷雾。
31.对采用上述方法制备的三白草提取物、发酵提取物、分馏物的性能进行研究。
32.实施例1为采用步骤s1制备的的三白草提取物，实施例2为采用步骤s2 制备的三白草发酵提取物，实施例3
‑
7分别为采用步骤s3制备的n
‑
己烷、亚甲基二醇、乙酸乙酯、丁醇和水的分馏物。
33.对比例为把500g阴干细切的三白草放入容器(18～23℃)中，使用1.2l甲醇、300ml丙酮、300ml丙醇、1.2l乙醇萃取12小时后，使用标准的400网眼筛过滤，常温下放置7天发酵后，再使用标准的400网眼筛过滤。使用减压蒸发器对该提取物进行减压浓缩，获得了39.5g具有粘性的三白草发酵提取物。
34.1、对采用上述方法制备的三白草提取物、发酵提取物、分馏物对酪氨酸酶活性的抑制效果进行研究，酪氨酸酶为从sigma公司购入的。
35.使用0.05m磷酸钠缓冲溶液(ph6.8)将基质l
‑
酪氨酸溶解后，制成 0.1mg/ml的溶
液，实施例1～7是在0.05m磷酸钠缓冲溶液(ph6.8)中溶解l
‑ꢀ
酪氨酸后调节的不同浓度下进行的试验。在试管中装入0.5ml上述的l
‑
酪氨酸溶液，再加入0.5ml三白草提取物样本液，在37℃的恒温器中放置10分钟。然后添加了0.5ml的200unit/ml的酪氨酸酶，使其在37℃的条件下反应10分钟。把装有该反应液的试管放在冰上，快速冷却并停止反应后，使用分光光度计测量了波长为475nm时的吸光度。测量各种美白物质在50％抑制酪氨酸酶活性时的ic50值。对比例使用了0.5ml上述的缓冲溶液。结果如下表所示。
[0036][0037][0038]
由上表可知，实施例1的三白草提取物的酪氨酸酶抑制率为59.16％(以 200ug/ml为准)，实施例2的三白草发酵提取物的酪氨酸酶抑制率为78.05％(以 200ug/ml为准)，三白草发酵提取物对酪氨酸酶抑制效果比三白草提取物更好。另外，三白草发酵提取物的水分馏物，即实施例7中的酪氨酸酶抑制率为 92.10％(以200ug/ml为准)；三白草发酵提取物的丁醇分馏物，即实施例6中的酪氨酸酶抑制率为88.14％(以200ug/ml为准)，比熊果苷高约2倍。因此，三白草发酵提取物的分馏物中水分馏物和丁醇分馏物对酪氨酸酶活性抑制效果更好。
[0039]
2、对采用上述方法制备的三白草提取物、发酵提取物、分馏物利用b16f1 黑色素
形成细胞抑制黑色素生成的效果进行研究。
[0040]
本试验中使用的b16f1黑色素形成细胞是来源于老鼠的细胞菌，由 atcc(american type culture collection)转让。将b16f1黑色素形成细胞注入 6孔板中，每个孔的浓度为2
×
105，粘贴细胞后，以不会诱发毒性的浓度分注，处理上述实施例1
‑
7和对比例中获得的产物，培养72小时后，使用胰蛋白酶
‑
edta使细胞分离，测量细胞数后进行离心分离，回收细胞。使用pbs清洗 1次细胞后，添加1ml的缓冲液(50mm硫酸钠，ph6.8、1％tritonx
‑
100、2mmpmsf)，涡流5分钟粉碎细胞。再通过离心分离(3000rpm，10分钟)获得细胞滤液，在获得的细胞滤液中添加1n naoh(10％dmso)，溶解提取出的黑色素后，再利用微板阅读器在405nm条件下测量黑色素的吸光度后，给黑色素定量，测量样本的黑色素生成抑制率(％)。b16f1黑色素形成细胞的黑色素生成抑制率(％)按照数学公式(黑色素生成抑制率(％)＝[a
‑
b/a]
×
100，a：无处理组的黑色素含量，b：样本的黑色素含量)计算，结果如下表所示。
[0041][0042]
[0043]
由上表可知，实施例1的三白草提取物的黑色素生成抑制率为72.99％(以 200ug/ml为准)，实施例2的三白草发酵提取物的黑色素生成抑制率为 85.34％(以200ug/ml为准)，可见三白草发酵提取物的黑色素生成抑制效果更好。另外，实施例7中三白草发酵提取物的水分馏物的黑色素生成抑制率为 90.32％(以200ug/ml为准)，实施例6中三白草发酵提取物的丁醇分馏物的黑色素生成抑制率为83.54％(以200ug/ml为准)，可见对黑色素生成的抑制效果非常好。实施例3～5的黑色素生成抑制率均低于11％(以200ug/ml准)，黑色素生成抑制率较低。
[0044]
3、对采用上述方法制备的三白草提取物、发酵提取物、分馏物分别制成美白化妆品，并对其美白功效进行研究。
[0045]
实施例1
‑
7分别为：分别取5g的三白草提取物、5g的三白草发酵提取物、5g 的n
‑
己烷分馏物、5g的亚甲基二醇分馏物、5g的乙酸乙酯分馏物、5g的丁醇分馏物和5g的水分馏物，混合10g甘油、5g甜菜碱、2g peg 1500、0.1g 尿囊素、0.3g dl
‑
泛酰醇、0.02g edta
‑
2na、0.04g二苯甲酮
‑
9、0.1g羟乙基纤维素、8g透明质酸钠、0.2g羧乙烯基聚合物、0.18g三乙醇胺、0.3g辛基十二醇、0.4g辛基十二烷醇聚醚
‑
16、6g乙醇、0.2g香料、0.3g germall 115和 56.86g纯净水，制成的美白用化妆品。
[0046]
比较例1为：混合5g熊果苷、10g甘油、5g甜菜碱、2g peg 1500、0.1g 尿囊素、0.3g dl
‑
泛酰醇、0.02g edta
‑
2na、0.04g二苯甲酮
‑
9、0.1g羟乙基纤维素、8g透明质酸钠、0.2g羧乙烯基聚合物、0.18g三乙醇胺、0.3g辛基十二醇、0.4g辛基十二烷醇聚醚
‑
16、6g乙醇、0.2g香料、0.3g germall 115和 56.86g纯净水，制造成的美白用化妆品。
[0047]
比较例2为：混合3g三白草提取物、10g甘油、5g甜菜碱、2g peg 1500、0.1g尿囊素、0.3g dl
‑
泛酰醇、0.02g edta
‑
2na、0.04g二苯甲酮
‑
9、0.1g 羟乙基纤维素、8g透明质酸钠、0.2g羧乙烯基聚合物、0.18g三乙醇胺、0.3g 辛基十二醇、0.4g辛基十二烷醇聚醚
‑
16、6g乙醇、0.2g香料、0.3g germall 115和56.86g纯净水，制造出美白用化妆品。
[0048]
随机抽取45名患有色素沉着症的健康成人女性，分成九组(a～i)来进行临床实验，a组、b组、c组、d组、e组、f组和g组分别涂抹了实施例1
‑
7 中的化妆品，h组和i组分别涂了比较例1和2中的化妆品，每天涂抹两次，一共涂抹了8周。
[0049]
利用分光光度计测量了肤色变化(δl)，由多名熟练者进行客观的肉眼观察，对受试者实施主观的肉眼观察，结果如下表所示。将美白功效程度按照以下美白功效评估标准进行分类评估，显示出平均值。
[0050]
<美白功效评估标准>
[0051]
‑
3:严重恶化
‑
2:恶化
‑
1:稍微恶化0:无变化
[0052]
1:稍微改善2:改善3:极大改善
[0053]
受验者肤色亮度变化(δl)熟练者的客观评估受验者的主观评估a3.3151.41.1b3.551.451.4c0.230.310.28d0.520.130.14e0.240.260.21f3.861.531.23
g3.971.641.34h2.440.60.6i3.261.161.17
[0054]
实验结果显示，涂抹含有三白草提取物的皮肤美白化妆品的a组的平均δl值为3.315(p<0.05)，涂抹含有三白草发酵提取物的皮肤美白化妆品的b组的平均δl值为3.55(p<0.05)，涂抹含有熊果苷的皮肤美白化妆品原的h组的平均δl值为2.44(p<0.05)，涂抹含有三白草发酵物水分馏物的皮肤美白化妆品的g组的δl值为3.97(p<0.05),涂抹含有三白草发酵物丁醇分馏物的皮肤美白化妆品的f组的δl值为3.86(p<0.05)，肤色亮度变化非常明显。
[0055]
另外，在熟练者的美白评估中，a组为1.4，b组为1.45，h组为0.60，但f组和g组分别为1.53和1.64，美白评估结果非常出色。
[0056]
在受试者的美白评估中，a组为1.1，b组为1.4，h组为0.6，但f组和g 组分别为1.23和1.34，平均值非常高。由此可知，本发明含有三白草发酵提取物丁醇分馏物或水分馏物的皮肤美白化妆品的美白功效非常优秀。
[0057]
因此，本发明采用上述三白草提取物的提取方法，利用酒曲对三白草内含有的有效成分进行发酵、提取，制备出增进皮肤美白功效的化妆品原料，提高化妆品的美白效果。
[0058]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。