一种治疗垂体腺瘤的药物、制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种治疗垂体腺瘤的药物、制备方法及其应用。


背景技术：

2.垂体瘤是常见的颅内良性肿瘤之一，发病率在颅内肿瘤中仅次于脑胶质细胞瘤和脑膜瘤，约占颅内肿瘤的10％，且随着诊断水平的不断提高，发病率有逐年增加趋势。随着肿瘤不断生长，可压迫蝶鞍区周围结构，如视神经、海绵窦、脑底动脉、下丘脑等，甚至累及额叶、脑干，而导致严重的功能障碍。同时，肿瘤生长还可导致垂体激素分泌紊乱。按照外周血激素水平，垂体腺瘤分为无功能型垂体腺瘤(nfpa)和功能型垂体腺瘤，包括：泌乳素腺瘤(prl)、促肾上腺皮质激素腺瘤(acth)、生长激素腺瘤(gh)、促甲状腺激素腺瘤(tsh)、促性腺激素腺瘤(pga)及混合激素分泌腺瘤等。
3.泌乳素腺瘤是最常见的垂体肿瘤，约占垂体腺瘤的80％～85％，是由垂体泌乳素细胞瘤分泌过量泌乳素(prolactin，prl)引起的下丘脑-垂体疾病中常见的一种疾病，典型临床表现：女性为闭经、溢乳、不育、高泌乳素血症；男性为阳痿，性功能减退，乳房发育；肿瘤压迫及侵犯周围结构所引起的症状和体征。有临床症状的泌乳素微腺瘤一般不会长成大腺瘤，部分腺瘤有侵袭性生长，出现腺瘤增大。根据2014版的《中国垂体泌乳素腺瘤诊治共识》，垂体泌乳素腺瘤治疗方案首选多巴胺受体激动剂进行药物治疗。使用多巴胺受体激动剂不仅可以降低血清prl水平，同时可以帮助恢复性腺功能并缩小肿瘤体积。目前治疗垂体催乳素腺瘤的药物主要有以下几种：溴隐亭、卡麦角林、培高利特及喹高利特，前3种为麦角碱衍生物类多巴胺受体激动剂，喹高利特为非麦角碱衍生物类，且均为多巴胺d2受体(drd2)激动剂。甲磺酸培高利特因为增加心脏瓣膜损害的风险而自愿退市，并于2008年1月1日在中国市场撤出。目前，泌乳素腺瘤的发病机制尚不完全清楚，临床治疗靶点很少且治疗药物缺乏，因此临床上亟待寻找泌乳素腺瘤的治疗新靶点和药物。
4.目前在临床治疗过程中，约有8％～25％的垂体泌乳素腺瘤患者经溴隐亭治疗后出现耐药现象。由于卡麦角林和喹高利特未进入国内市场，目前在国内仅有溴隐亭1种。溴隐亭为多巴胺d2受体(drd2)激动剂，治疗泌乳素腺瘤效果显著，但价格昂贵，且存在一定副作用，例如：溴隐亭对80％～90％的患者可有效降低prl、恢复性腺功能、缩小或控制肿瘤生长，其副作用主要是胃肠道反应，剂量较大时可有眩晕、体位性低血压、头痛、瞌睡与便秘等。对溴隐亭耐药或对其不良反应不耐受的患者，没有可替代治疗的药品。因此，为保证我国垂体泌乳素腺瘤患者的健康，并保障其治疗的安全性，迫切需要研究开发泌乳素腺瘤的治疗新靶点和药物。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供了一种治疗垂体腺瘤的药物、制备方法及其应用，其可显著抑制垂体泌乳素腺瘤的生长和prl的生成，用于泌乳素腺瘤的治疗，提供了一种泌乳素
腺瘤的治疗新靶点和脂质体药物制剂。
6.本发明是采用以下技术方案来实现的：
7.一种药物在制备治疗垂体腺瘤药物中的应用，所述药物为tlr4抑制剂。
8.优选的，所述tlr4抑制剂为tak-242。优选的，所述垂体腺瘤选自泌乳素腺瘤、促肾上腺皮质激素腺瘤、生长激素腺瘤、促甲状腺激素腺瘤、促性腺激素腺瘤和混合激素分泌腺瘤中的一种。更优选的，所述垂体腺瘤为泌乳素腺瘤。
9.一种治疗垂体腺瘤的药物，所述药物制剂为脂质体，所述脂质体优选含有以下重量比的组分：1份tak-242，5-15份卵磷脂，1份胆固醇。优选的，所述脂质体优选含有以下重量比的组分：1份tak-242，10份卵磷脂，1份胆固醇。
10.本发明还公开了所述的药物的制备方法，包括以下步骤：称取处方量tak242、卵磷脂、胆固醇；加入有机溶剂后超声溶解，水浴旋转蒸发蒸干溶剂得到分散的脂质体薄膜，加入pbs缓冲液溶解，于恒温震荡摇床震荡溶解得到脂质体，探头超声得到分散的脂质体溶液，将溶液减压干燥或喷雾干燥得到脂质体。
11.优选的，称取tak-242 1mg、卵磷脂10mg、胆固醇1mg；加入有机溶剂5ml后超声溶解，水浴旋转蒸发蒸干溶剂得到分散的脂质体薄膜，加入10ml的pbs缓冲液溶解，于恒温震荡摇床震荡20min溶解的到脂质体，探头超声5-10min得到分散的脂质体溶液，将溶液减压干燥或喷雾干燥得到脂质体。进一步的，所述超声功率为150-250w；所述有机溶剂中甲醇和氯仿的体积比为1:1。
12.tlr4是toll样蛋白家族的重要成员，位于细胞膜，是一种模式识别受体，在介导自然免疫和炎症中发挥重要作用。本发明提供了tlr4抑制剂在治疗垂体泌乳素腺瘤中的应用。本发明首次发现，tlr4促进了垂体泌乳素腺瘤的生长和泌乳素(prl)的生成，而通过抑制或敲除tlr4基因，能够显著抑制垂体泌乳素腺瘤的生长和prl的生成。tak-242是一种有效的tlr4抑制剂，选择性抑制tlr4调节的细胞因子和no产生。英文名称：tak-242，分子式c
15h17
clfno4s；cas号243984-11-4；分子量361.82。本发明将tak-242制成治疗垂体泌乳素腺瘤的脂质体制剂。
13.与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
14.现有技术尚未见tlr4与垂体泌乳素腺瘤关系的报道，本发明首次发现tlr4的活化促进了垂体泌乳素腺瘤的生长和泌乳素(prl)的生成，而通过抑制或敲除tlr4基因，能够显著抑制垂体泌乳素腺瘤的生长和prl的生成。该发明发现tlr4抑制剂可显著抑制垂体泌乳素腺瘤的生长和prl的生成，用于泌乳素腺瘤的治疗；将tak-242制成脂质体，测定脂质体的粒径、电位和投射电镜等表征指标：粒径：123.3
±
1.16，电位8.10
±
0.11，透射电镜下形态均一、分散，符合要求。
附图说明
15.下面结合附图对本发明作进一步的说明；
16.图1是为实施例1.2中模型组的雌二醇诱导的泌乳素腺瘤小鼠垂体外观与对照组的对照图。
17.图2为实施例1.3中对照组和模型组的雌二醇诱导的泌乳素腺瘤小鼠垂体组织蛋白表达的western blot检测图。
18.图3为实施例二中mmq细胞裂解物的蛋白表达的western blot检测图。
19.图4为实施例三中mmq细胞裂解物的蛋白表达的western blot检测图。
20.图5为实施例四中野生型、模型组、tlr4-/-对照组和tlr4-/-模型组小鼠垂体的结果对比图；图中，由上到下依次为外观图、垂体/体重比值图、小鼠血清泌乳素水平图。
21.图6为实施例四中野生型、雌二醇诱导、tlr4-/-对照和雌二醇诱导的tlr4-/-小鼠垂体蛋白的western blot检测图。
22.图7为实施例五中野生型、模型组、tlr4-/-对照组和tlr4-/-模型组小鼠垂体的结果对比图；图中，由上到下依次为外观图、垂体/体重比值图、小鼠血清泌乳素水平图。
23.图8(a)为实施例五中各组小鼠垂体蛋白的western blot检测条带图。
24.图8(b)为图8(a)western blot检测条带图中条带所对应的灰度值做定量分析的柱状图。
25.图9为实施例六中处方筛选试验的包封率结果图，图中依次为不同药脂比条件下、不同磷胆比条件下、不同超声功率下的包封率结果图。
26.图10为实施例六制备脂质体的表征指标结果图，图中依次为粒径、电位和50000倍透射电镜图。
具体实施方式
27.为更清楚地理解本发明的目的、特征和优点，以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐释。如无特别说明，下列实施例涉及到的材料和试剂均能从商业途径获得。实施例一：雌二醇诱导的泌乳素腺瘤c57小鼠垂体tlr4显著活化
28.1.1.小鼠泌乳素腺瘤模型的建立
29.随机将20只c57小鼠分为正常组和模型组，每组各10只。模型组小鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液，剂量为20mg/kg，每5天注射一次，连续注射50天；对照组小鼠腹腔注射同剂量的生理盐水。
30.1.2.小鼠垂体的外观观察
31.图1为3只正常组和3只模型组的小鼠垂体外观图。外观观察显示，与对照组小鼠比较，模型组的雌二醇注射诱导的泌乳素腺瘤大鼠垂体体积显著增大。
32.1.3雌二醇诱导的泌乳素腺瘤小鼠垂体组织中tlr4/p38mapk/nf-κb通路活化
33.1.3.1小鼠垂体蛋白的western blot检测
34.对照组小鼠和模型组小鼠均摘取垂体组织，经提取蛋白后，经电泳、转膜和曝光后，检测prl和tlr4/p38mapk/nf-κb通路蛋白的表达情况。具体步骤如下：
35.(1)细胞蛋白的提取：各孔mmq细胞离心后用pbs洗一次，再次离心后转移至ep管，加入80μl配置的裂解液(ripa裂解液：cocktail：蛋白酶抑制剂：pmsf＝100:2:2:1),将细胞吹匀后于摇床上冰浴裂解30分钟，然后12000r，4℃离心15分钟，取上清加入四分之一体积的蛋白上样缓冲液，混匀后沸水浴10分钟收样，-20℃保存。
36.(2)sds-page电泳：将配套的电泳玻璃板搭上架子，配制10％的分离胶，沿板缝加入4.6ml分离胶，加水封胶压齐分离胶，等待45分钟后，倒去上层水，上层灌满5％的浓缩胶，垂直插入梳子，等待1小时胶凝固后倒入电泳液并拔去梳子，将蛋白样品加入点样孔中开始电泳，电压恒压70v至样品压齐后调电压120v，溴酚蓝跑到底部终止电泳。
37.(3)转膜：将转膜夹子、海绵和转膜滤纸浸入转膜液中，先反复单向按压排气泡，然后把跑开的胶转移到转膜滤纸上，胶上覆盖一层经甲醇活化的pvdf膜，合上夹子放入转膜仪，300ma恒流40分钟转膜结束。
38.(4)免疫反应：转膜结束后蛋白已转移至pvdf膜上，将膜转移到孵育盒，加入5％脱脂牛奶，置于脱色摇床慢摇封闭1小时。弃去孵育盒中的牛奶，加入配制好的一抗，4℃孵育过夜。用tbst快摇洗膜3次，每次10分钟，然后加入tbst稀释好的二抗，慢摇孵育30分钟，再用tbst快摇洗3次，每次10分钟.
39.(5)化学发光：将ecl发光液a液和b液1：1混合，混合液均匀铺满pvdf膜后放入曝光仪，调整参数即可曝光。
40.(6)凝胶图像分析：曝光所得的western blotting条带用image j软件分析目的条带的光密度值。
41.1.3.2小鼠垂体western blot检测结果
42.western blot结果详见图2，由图2可知，与对照组小鼠比较，雌二醇诱导的泌乳素腺瘤小鼠垂体组织中泌乳素(prl)蛋白显著增加(p《0.01)；而且，erβ(p《0.05)，tlr4(p《0.05)，myd88(p《0.001)，p-nf-κbp65(p《0.05)和p38mapk(p《0.01)蛋白均显著增加。图2中，es：雌二醇注射的模型组，con：对照组；与对照组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01，n＝3。
43.实施例二、垂体瘤mmq细胞中tlr4/p38mapk/nf-κb活化后prl表达显著增加
44.2.1 mmq细胞种板和雌二醇及雌激素受体抑制剂诱导
45.传代后的mmq细胞融合度为70-80％时，取处于对数生长期的mmq细胞，以2
×
105个/孔的密度均匀种于六孔板，每孔加1ml的细胞液，再补齐1ml的含药培养基，放入二氧化碳培养箱中培养48小时后，各组mmq细胞提取裂解物蛋白，供western blot检测。具体步骤同1.3.1。
46.表1实施例2.1中mmq细胞种板6孔板中刺激物加样顺序表
[0047][0048]
2.2 mmq细胞裂解物的western blot检测结果
[0049]
western blot检测如图3所示，与对照组细胞比较，加e2(1、10、100nm/ml)的mmq细胞裂解物中prl蛋白均显著增加(p《0.05)，加ful(10、100nm/ml)的mmq细胞裂解物中prl蛋白均显著降低(p《0.05)；而且，100nm/mle2诱导后erβ(p《0.01)、tlr4(p《0.01)、p-nf-κbp65(p《0.05)和p38mapk(p《0.05)蛋白也均显著增加，100nm/ml ful(10、100nm/ml)诱导后erβ(p《0.05)、tlr4(p《0.001)、p-nf-κbp65(p《0.05)和p38mapk(p《0.01)蛋白也均显著降低。图3中，con:对照组，与对照组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.01，n＝3。
[0050]
实施例三、转染敲低tlr4后抑制p38mapk/nf-κb通路减少了mmq细胞prl的表达
[0051]
3.1 mmq细胞种板后加对应诱导物
[0052]
传代后的mmq细胞融合度为70-80％时，取处于对数生长期的mmq细胞，以2
×
105个/孔的密度均匀种于六孔板，每孔加1ml的细胞液，再补齐1ml的含药培养基，放入二氧化碳培养箱中培养48小时后，各组mmq细胞提取裂解物蛋白，供western blot检测。试剂加样
顺序如表2所示。
[0053]
表2实施例3.1中mmq细胞种板6孔板中刺激物加样顺序表
[0054][0055]
3.2 mmq细胞裂解物的western blot检测结果
[0056]
western blot检测显示，与e2组比较，转染敲低tlr4后再用e2诱导erβ(p《0.05)、tlr4(p《0.01)、myd88(p《0.05)、p-nf-κbp65(p《0.05)、p38mapk(p《0.01)和prl(p《0.05)蛋白均显著降低。而且与e2组比较，同时给与e2和lps诱导后erβ(p《0.05)、tlr4(p《0.05)、myd88(p《0.05)、p-nf-κbp65(p《0.05)、p38mapk(p《0.05)和prl(p《0.05)蛋白均显著升高。与lps组比较，同时给与e2和lps诱导也得出了同样的结论，erβ(p《0.05)、tlr4(p《0.05)、myd88(p《0.01)、p-nf-κbp65(p《0.01)、p38mapk(p《0.05)和prl(p《0.01)蛋白均显著升高。说明tlr4的激活在泌乳素瘤的发生中起着重要作用，抑制tlr4的表达能够降低prl的表达。图4中，与lps+e2组比较，*p《0.05，**p《0.01；与e2组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01，ns，p》0.05n＝3。
[0057]
实施例四、雌二醇诱导的tlr4敲除小鼠垂体prl表达显著减少
[0058]
4.1野生型、雌二醇诱导小鼠和雌二醇诱导的tlr4-/-小鼠的制备
[0059]
tlr4-/-敲除小鼠购买于江苏集萃药康生物科技有限公司。随机将c57小鼠分为野生型、模型组、tlr4-/-对照组和tlr4-/-模型组，每组各10只，模型组小鼠和tlr4-/-模型组小鼠均腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液，剂量为20mg/kg，每5天注射一次，连续注射50天；正常组小鼠腹腔注射同剂量的生理盐水。
[0060]
4.2.小鼠垂体的外观观察和血清泌乳素水平
[0061]
外观观察显示，与正常对照组小鼠比较，雌二醇注射诱导的泌乳素腺瘤小鼠垂体体积显著增大，但是tlr4-/-对照组和雌二醇诱导的tlr4-/-组相对于正常组垂体体积变化无显著差别。图5显示，与对照组相比，模型组垂体/体重比显著增加(p《0.001)，模型组小鼠血清泌乳素水平显著增加(p《0.01)；与模型组相比，而雌二醇诱导tlr4-/-垂体/体重比显著降低(p《0.001)，血清泌乳素水平显著降低(p《0.01)。图5中，与wt组比较，**p《0.01，***p《0.001；与es组比较，
##
p《0.01，
###
p《0.001；ns，p》0.05n＝3。
[0062]
4.3小鼠垂体组织的western blot检测
[0063]
western blot检测显示，与野生型小鼠比较，雌二醇诱导的泌乳素腺瘤小鼠垂体组织中prl蛋白显著增加(p《0.01)；而且，erβ(p《0.05)、tlr4(p《0.05)、myd88(p《0.01)、p-nf-κbp65(p《0.05)、p38mapk(p《0.05)、bmi1(p《0.01)和bcl2/bax(p《0.05)蛋白均显著增加。与雌二醇诱导的野生型泌乳素腺瘤小鼠比较，雌二醇诱导的tlr4-/-小鼠垂体中prl(p《0.01)、erβ(p《0.05)、tlr4(p《0.05)、myd88(p《0.05)、p-nf-κbp65(p《0.01)、p38mapk(p《0.01)、bmi1(p《0.01)和bcl2/bax(p《0.05)蛋白表达均显著降低。但是，与tlr4-/-小鼠相比，雌二醇诱导的tlr4-/-小鼠垂体中各项指标无显著性差异。图6中，es：雌二醇诱导与wt组比
较，
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p《0.05，
**
p《0.01；与es比较，
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p《0.05，
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p《0.01；ns，p》0.05n＝3。
[0064]
实施例五、tlr4抑制剂tak242显著减少雌二醇诱导的泌乳素瘤小鼠垂体prl表达
[0065]
5.1正常组、雌二醇诱导小鼠和给药组小鼠的制备
[0066]
c57小鼠购买于湖北省实验动物中心。随机将c57小鼠分为正常组、模型组、溴隐亭对照组和tak242给药组(0.15mg/kg和0.3mg/kg)，每组各10只，除正常组外各组小鼠均腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液，剂量为20mg/kg，每5天注射一次，连续注射50天；正常组小鼠腹腔注射同剂量的生理盐水。造模完成后，溴隐亭组灌胃溴隐亭(1.6mg/kg)，每日一次；tak242给药组腹腔注射tak242(0.15mg/kg和0.3mg/kg)，4天一次，共8次。
[0067]
5.2小鼠垂体的外观观察和血清泌乳素水平
[0068]
外观观察显示，与正常组小鼠比较，雌二醇注射诱导的泌乳素腺瘤小鼠垂体体积显著增大，各给药组小鼠能抑制小鼠垂体的增殖。与对照组相比，模型组垂体/体重比显著增加(p《0.001)，血清泌乳素水平显著增加(p《0.01)；与模型组相比，溴隐亭组垂体/体重比显著降低(p《0.01)，血清泌乳素水平显著降低(p《0.01)。tak242组(0.15mg/kg)垂体/体重比显著降低(p《0.01)，血清泌乳素水平显著降低(p《0.01)；tak242(0.3mg/kg)垂体/体重比显著降低(p《0.01)，血清泌乳素水平显著降低(p《0.01)。图7各组小鼠垂体的对比图，与正常组比较，**p《0.01，***p《0.001；与模型组比较，
##
p《0.01，n＝3。
[0069]
5.3小鼠垂体组织的western blot检测
[0070]
图8的western blot检测显示，与正常组小鼠比较，雌二醇诱导的泌乳素腺瘤小鼠垂体组织中prl蛋白显著增加(p《0.01)；而且，tlr4(p《0.01)，myd88(p《0.05)，p-nf-κb p65(p《0.05)，p38 mapk(p《0.01)，prl(p《0.01)，il6(p《0.05)，il1β(p《0.05)，tnfα(p《0.05)and bcl2/bax(p《0.05)蛋白均显著增加。与雌二醇诱导的野生型泌乳素腺瘤小鼠比较，溴隐亭给药组prl蛋白显著降低(p《0.01)，tlr4(p《0.05)，p-nf-κb p65(p《0.01)，p38 mapk(p《0.01)，tnfα(p《0.05)and bcl2/bax(p《0.05)蛋白显著降低；tak242组(0.15mg/kg)tlr4(p《0.05)，p-nf-κb p65(p《0.01)，p38mapk(p《0.01)，prl(p《0.05)，tnfα(p《0.05)and bcl2/bax(p《0.05)蛋白显著降低；tak242组(0.3mg/kg)tlr4(p《0.01)，myd88(p《0.01)，p-nf-κb p65(p《0.01)，p38 mapk(p《0.01)，prl(p《0.01)，il6(p《0.05)，il1β(p《0.05)，tnfα(p《0.01)and bcl2/bax(p《0.05)。图8中，与正常组比较，*p《0.05，**p《0.01；与模型组比较，
#
p《0.05，
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p《0.01，n＝3。
[0071]
实施例六、tlr4抑制剂tak242脂质体的制备
[0072]
由于tak242的溶解性和生物利用度不高，通过剂型的制备提高其溶解度。采用薄膜分散法制备tak242脂质体，主要处方原料：tak242，磷脂，胆固醇。以药脂比、磷胆比、超声功率进行单因素筛选，衡量指标为包封率。采用高速离心法分离脂质体，下层脂质体加入甲醇破乳，稀释后用液质测定包封脂质体含量。
[0073]
6.1处方工艺单因素考察：
[0074]
1、药脂比的考察
[0075]
药物与成膜材料磷脂的比例，脂质体的主要成膜材料是磷脂。固定其他处方条件，选择药物与大豆磷脂的比例为1：5、1：10、1：20制备脂质体，以包封率为筛选条件，确定最佳比例。结果见图9。
[0076]
2、磷胆比的考察
[0077]
磷脂与胆固醇的比例，选择磷脂和胆固醇的比例为15：1、10：1、5：1制备脂质体，以包封率为筛选条件，确定最佳比例。结果见图9。
[0078]
3、超声功率的考察
[0079]
脂质体制备结束后，为进一步降低粒径，需要进行超声将初步制得的大单层囊泡打散，固定药脂比、磷胆比制备脂质体，并进行探头超声处理，分别设定处理功率为150w、200w、250w，超声时间为5分钟，以包封率为筛选条件，确定最佳的超声功率。结果见图9。
[0080]
最终确定tak242脂质体的最佳制备方法为tak242：卵磷脂：胆固醇＝1:10:1，超声功率为150w，包封率为82.90％。
[0081]
6.2筛选处方制备脂质体的指标检测
[0082]
根据处方1：10：1分别精密称取tak2421mg、卵磷脂10mg、胆固醇1mg。加入甲醇和氯仿各2.5ml后超声溶解，水浴旋转蒸发蒸干溶剂得到分散的脂质体薄膜，加入10mlpbs溶解，于恒温震荡摇床20min溶解的到脂质体，探头超声10min得到分散的脂质体溶液，稀释后测定脂质体的粒径、电位和投射电镜等表征指标。粒径：123.3
±
1.16，电位8.10
±
0.11，透射电镜下形态均一、分散，符合要求。
[0083]
以上所述仅是对本发明的实施方式的举例展示，并非对本发明作任何形式上的限制。本发明保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施例所限，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何简单修改或等同变化与修饰均属于本发明的保护范围。