黄秋葵果胶在制备治疗或预防2型糖尿病药物中的应用

1.本发明属于黄秋葵果胶的医药新用途技术领域，具体涉及黄秋葵果胶在制备治疗或预防2型糖尿病药物中的应用。


背景技术：

2.糖尿病是一种以血糖升高为主要特征的代谢性分泌疾病。糖尿病的发病率和患病率在逐年上升。据idf统计，2021年全球糖尿病患者已达5.37亿人，中国糖尿病患者人数约占全球糖尿病患者总数的四分之一，在目前全球dm数量排名中，位居首位。随着科技的发展和人民经济水平的提高，肥胖、高脂高糖的饮食和缺乏运动的生活方式是糖尿病（diabetes mellitus，dm）全球流行的主要原因。现今，治疗糖尿病的药物主要分为11类，包括胰岛素及其类似物、磺酰脲类、双胍类等，它们虽然能较好的抑制病情恶化，却会引起一系列的不良反应。因此，从天然产物中寻找和开发高效低毒的治疗糖尿病的物质，具有重要意义。
3.黄秋葵是锦葵科一年生的草本植物，又名秋葵、黄蜀葵、黄葵、食香槿、美国豆、阿华田等。原产于非洲，现在许多地区均有栽培。黄秋葵营养价值丰富，含有多糖、黄酮、蛋白质和氨基酸、维生素和微量物质等，具有良好的抗氧化和抗疲劳、抗炎、抗癌、降血脂、抗糖尿病、保胃护肝等功效。黄秋葵果胶是一种酸性多糖，其骨架是含有半乳糖酸的鼠李糖半乳糖醛酸。在黄秋葵果胶众多研究中，多集中于黄秋葵果胶的提取、纯化研究，较少出现黄秋葵果胶降血糖功效的研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供了黄秋葵果胶的医药新用途，即在制备治疗或预防2型糖尿病药物中的应用。本发明选用黄秋葵果胶作为主要材料，设置3个浓度梯度的黄秋葵果胶溶液干扰链脲佐菌素（streptozocin，stz）诱导的糖尿病模型小鼠，通过检测空腹血糖、糖耐量、血脂四项、sod、mda等指标，系统评估黄秋葵果胶对糖尿病小鼠血糖的影响，以期检验黄秋葵果胶是否具有调节血糖的功能作用，为糖尿病的临床治疗及新药研发提供依据。
5.本发明为实现上述目的采用如下技术方案，黄秋葵果胶在制备治疗或预防2型糖尿病药物中的应用，其中2型糖尿病是由链脲佐菌素诱导的2型糖尿病。
6.进一步限定，所述黄秋葵果胶的使用剂量为15-30mg/ml。
7.进一步限定，所述黄秋葵果胶是由新鲜黄秋葵的嫩果荚提取而得的。
8.本发明与现有技术相比具有以下优点和有益效果：本发明研究黄秋葵果胶对链脲佐菌素诱导的2型糖尿病小鼠模型的降血糖作用，采用高脂饲料结合腹腔注射链脲佐菌素（stz）的方法建立2型糖尿病小鼠模型，连续灌胃黄秋葵果胶溶液10d后检测小鼠空腹血糖量、葡萄糖耐受量、血脂等指标，并观察肝脏组织形态。结果表明黄秋葵果胶能够有效调节2型糖尿病小鼠高血糖和血脂代谢紊乱的症状，改善2型糖尿病小鼠血清中tc、tg、hdl-c、ldl-c、sod、mda等相关因子水平（p《0.01），修复糖尿病小鼠肝脏组织细胞形态。进一步表明一定剂量的黄秋葵果胶（15-30mg/ml）对 stz 诱导的糖尿病小鼠模型具有降血糖作用，为
糖尿病的临床治疗及新药研发提供依据。
附图说明
9.图1是黄秋葵果胶对小鼠饮水量的影响，与正常组相比#代表差异显著（p《0.05），##代表差异极显著（p《0.01）；给药组与模型组相比，*代表差异显著（p《0.05），**代表差异极显著（p《0.01）；图2是黄秋葵果胶对小鼠饮食量的影响，与正常组相比#代表差异显著（p《0.05），##代表差异极显著（p《0.01）；给药组与模型组相比，*代表差异显著（p《0.05），**代表差异极显著（p《0.01）；图3是黄秋葵果胶对小鼠体重的影响，与正常组相比#代表差异显著（p《0.05），##代表差异极显著（p《0.01）；给药组与模型组相比，*代表差异显著（p《0.05），**代表差异极显著（p《0.01）；图4是黄秋葵果胶对糖尿病小鼠血糖的影响，（1）0d 表处理前血糖值，5d 和 10d 分别为给药 5和 10 天时的血糖值；（2）与正常组相比，#代表差异显著（0.01＜p《0.05），##代表差异极显著（p《0.01）；给药组与模型组相比，*代表差异显著（p《0.05），**代表差异极显著（p《0.01）；图5是黄秋葵果胶对糖尿病小鼠糖耐量的影响，（1）0d 表处理前血糖值，5d 和 10d 分别为给药 5和 10 天时的血糖值；（2）与正常组相比，#代表差异显著（0.01＜p《0.05），##代表差异极显著（p《0.01）；给药组与模型组相比，*代表差异显著（p《0.05），**代表差异极显著（p《0.01）；图6是黄秋葵果胶对hdl-c、ldl-c、tc和tg水平的影响，与正常组相比#代表差异显著（p《0.05），##代表差异极显著（p《0.01）；给药组与模型组相比，*代表差异显著（p《0.05），**代表差异极显著（p《0.01）；图7是黄秋葵果胶对sod、mda水平的影响，与正常组相比#代表差异显著（p《0.05），##代表差异极显著（p《0.01）；给药组与模型组相比，*代表差异显著（p《0.05），**代表差异极显著（p《0.01）；图8是黄秋葵果胶对糖尿病小鼠肝细胞形态的影响（x 100）。
具体实施方式
10.以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
11.1 材料和方法1.1材料和仪器去离子水（杭州娃哈哈集团有限公司），无水乙醇分析纯（天津市大茂化学试剂厂），黄秋葵嫩果荚5kg（购自河南新乡农贸大市场），盐酸二甲双胍片（北京万辉双鹤药业有限责任公司），链脲佐菌素（stz）（美国sigma公司），甘油三酯（tg）、总胆固醇（tc）、高密度脂
蛋白胆固醇（hdl-c）、低密度脂蛋白胆固醇（ldl-c）、超氧化物歧化酶（sod）和丙二醛（mda）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），无水葡萄糖（广州新如荣生物科技样品店），90只小鼠（新乡医学院三全学院动物中心）；小鼠普通维持饲料（北京科澳协力有限公司）；高脂高糖小鼠饲料（北京博爱港商贸中心），101-8型电热鼓风恒温干燥箱（江苏金坛市佳美仪器有限公司），xpr微量分析天平（梅特勒-托利多集团），低速离心机（lc-lx-l50c，上海力辰科技有限公司），筛网60目（绍兴市上虞华丰五金仪器有限公司），粉碎机（永康市红太阳机电有限公司），冰箱（青岛海尔股份有限公司），kq5022de型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），me-t精密天平（梅特勒-托利多集团），kdc-2046 低速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），血糖试纸及测试仪( 三诺生物传感股份有限公司)，酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司），4wt%多聚甲醛组织固定液（biosharp公司）。
12.1.2实验方法1.2.1黄秋葵果胶的提取选用新鲜黄秋葵的嫩果荚，清洗干净后、去蒂、晾干、剪成或横切成0.5cm的小段后，在烘干机中于70℃烘干，用粉碎机粉碎过后过60目筛，在-20℃条件下储存备用。
13.黄秋葵果胶提取工艺为料液比1g:30ml，提取温度60℃，功率90w，提取时间30min。将超声后的提取液离心取上清液后，与体积分数95%乙醇混合，沉淀过夜。将混合液离心取沉淀。依次用体积分数70%、体积分数95%、无水乙醇洗涤，去除色素，后经烘箱烘干至恒重，得到黄秋葵果胶。
14.1.2.2糖尿病小鼠模型制备用链脲佐菌素剂量为100mg/kg（小鼠腹腔注射stz溶液体质量为10ml/kg；配制stz溶液浓度为10mg/ml，用0.1mol/l，ph4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制）。
15.90只健康小鼠适应性喂养三天后，随机抽取10只作为正常对照组，其余作为实验组，正常组给予普通饲料喂养，实验组给予高脂高糖饲料喂养。连续喂养2周后，禁食7h，实验组腹腔注射浓度为10mg/ml的stz溶液，正常对照组腹腔注射等体质量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，一周后测定空腹血糖值（fbg），将 fbg》11.1mmol/l者视为造模成功。
16.1.2.3糖尿病小鼠日常饲养与灌胃给药将造模成功的小鼠，随机分为六组，分别为空白对照组、模型组和二甲双胍阳性对照组以及高、中、低剂量组。空白对照组采用等体积生理盐水灌胃，灌胃量为10ml/kg；阳性对照组使用15mg/ml浓度的二甲双胍灌胃；黄秋葵果胶分别以30mg/ml高剂量、15mg/ml中剂量、7.5mg/ml低剂量进行灌胃。各组灌胃体积均为10ml/kg体质量，1次/d，连续10d。
17.1.2.4日常观察指标在试验中，每日观察小鼠的活动情况、毛色光泽度以及精神状态等，每日测量小鼠进食量、饮水量及体重，观察其体重的变化。
18.1.2.5空腹血糖的测定及口服葡萄糖耐受实验将小鼠禁食不禁水7h后，以尾静脉取血测定小鼠给药前、给药5d、10d后的空腹血糖值。
19.试验即将结束时，将所有小鼠禁食不禁水12h后，小鼠灌胃葡萄糖1.5g/kg，之后测定各组小鼠喂饲葡萄糖后0、0.5h、1h、2h的血糖值。血糖曲线下面积(auc)=(fbg0+fbg
0.5
)*0.5/2+(fbg
0.5
+fbg1)*0.5/2+(fbg1+fbg2)* 0.5/2。
20.1.2.6血清指标测定给药10d后，结束灌胃。空腹12h，在消毒的情况下，眼球取血，常温静置30min后，放到低速冷冻离心机，4℃离心，取上层血清。参照试剂盒说明书测定tc、tg、hdl-c、ldl-c、sod和mda的水平。
21.1.2.7病理组织学观察每组小鼠眼球取血后，处死，快速取胰腺、心脏、肝脏等脏器，所取组织全部用用 4wt%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，取肝脏组织进行he染色，观察肝脏的形态变化。1.3统计分析方法实验数据采用graphpad prism 8.0软件进行分析，结果以“平均值+标准差”(x
±
s)表示，两组间比较采用单因素方差分析，p≤0.05为差异性显著，p≤0.01为差异性极显著。
22.2结果2.1黄秋葵果胶对stz糖尿病小鼠糖尿病症状的影响外观：相比正常小鼠，造模后的糖尿病小鼠毛发减少，缺乏光泽，颜色偏黄，运动量减少，精神不振和反应迟缓。给予二甲双胍和黄秋葵果胶一段时间后，阳性对照组和中、高剂量组变化明显，皮毛恢复光泽，颜色显现为原来的白色，与模型组相比，精神较为活跃，但仍与正常组有明显差异。
23.饮水量：由图1可知，正常对照组每日饮水量维持恒定水平，而模型组小鼠可观察到明显的多饮现象，约为正常对照组的2倍，给药一段时间后，阳性对照组和各剂量组的小鼠的饮水量上升幅度降低。10d，相比模型组，阳性对照组、高剂量组和中剂量组饮水量降低效果明显（p＜0.05）。
24.进食量：图2表明，正常组小鼠进食量基本恒定，造模后，糖尿病小鼠进食量高于正常组。第5天，阳性组、高和中剂量组与模型组比较，差异具有统计学意义（p＜0.05），其中中剂量组减少尤为明显（p＜0.01）。第10天，除阳性组、中剂量组外，低剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（p＜0.05），但此时高剂量组与模型组比较差异不具有统计学意义（p＞0.05）。
25.体重：由图3可知，灌胃10天后，正常组小鼠体重有所增加。此时，与正常组相比，只有模型组小鼠体重明显降低（p＜0.01）。与模型组相比，阳性组、高剂量组、中剂量组、低剂量组体重均有回升，差异有统计学意义（p＜0.05），其中以高剂量组体重回升最为明显（p＜0.01）。
26.2.2 黄秋葵果胶对血糖的变化血糖升高是 2 型糖尿病的主要特征之一，长期高血糖会产生大量的活性氧，促进胰岛细胞凋亡。由图4可知，模型组及各药物处理组血糖均＞11.1 mmol/l，说明造模成功。实验期间，给药前后正常组与模型组血糖值波动范围较小，血糖值较为稳定，而药物干预组小鼠血糖变化较为明显。10d时，高剂量组小鼠血糖下降幅度最大，降幅达20.43%，经过黄秋葵果胶干预10d的高剂量、中剂量、二甲双胍组糖尿病小鼠血糖值与模型组相比差异极显著（p 《 0.01），低剂量组与模型组相比差异显著（p＜0.05）。综上，对糖尿病小鼠降糖效果为：高剂量组＞二甲双胍组》中剂量组＞低剂量组＞模型组。
27.2.3黄秋葵果胶对小鼠糖耐量的变化
糖耐量作为糖尿病的一种重要指标，能够在一定时间内反映出机体对体内血糖浓度的调节能力，反映其葡萄糖耐受能力。由图5可知，给予小鼠葡萄糖后，小鼠血糖在0.5h时达到峰值。模型组各时间段血糖与正常组相比差异极显著（p＜0.01）；与模型组比较，二甲双胍组、高剂量组、中剂量组、低剂量组可在1h内抑制糖尿病小鼠的血糖上升状况且差异显著（p＜0.01）。
28.2.4黄秋葵果胶对小鼠tc、tg、hdl-c、ldl-c的影响糖尿病会带来脂代谢紊乱，常伴有tc、tg、ldl升高以及hdl降低等血脂变化。由图6知，相比于正常组，模型组小鼠的tc、tg、ldl含量升高，hdl含量下降，差异极显著（p＜0.01），证明糖尿病小鼠体内出现脂代谢紊乱。对比模型组，秋葵果胶处理各组tc、tg含量降低，差异极显著（p＜0.01）。各用药处理组与模型组相比hdl含量显著升高，差异具有统计学意义（p＜0.01）。ldl含量随秋葵果胶浓度增加而呈现下降趋势，其中二甲双胍组、中剂量组、高剂量组与模型组相比差异极显著（p＜0.01）。说明秋葵果胶对糖尿病小鼠的脂代谢紊乱具有较好的调节作用。
29.2.5 黄秋葵果胶对小鼠 sod、mda 的影响活性氧簇（ros）可通过加重胰腺β细胞的应激信号通路，导致β细胞凋亡。sod是重要的抗氧化酶，能够清除和分解自由基，mda是一种脂质过氧化物，可以反映机体内的脂质过氧化程度。如图7所示，与正常组相比，模型组中sod含量显著下降（p《0.05），mda含量极显著升高（p《0.01），经黄秋葵果胶治疗后可有效恢复小鼠的sod水平，有效降低mda水平，且与模型组比较，高剂量黄秋葵果胶组能够极显著提高sod（p《0.01），极显著降低mda水平（p《0.01）。
30.2.6 病理学组织切片观察结果不同处理的小鼠肝组织he染色切片如图8所示。正常组小鼠肝组织正常，中央静脉清晰可见，无空泡现象，细胞核完整，细胞大小均匀，结构轮廓清晰。模型组小鼠肝细胞完整性差，切片中出现了较多空泡，大部分细胞呈溶解状态，结构轮廓模糊，有细胞核增大、肝细胞肿胀等现象。阳性对照组与模型组相比，细胞核相对缩小，空泡现象得到改善，但较正常组来说，细胞核仍然较大，细胞轮廓仍然难以分辨。黄秋葵果胶低、中剂量组较模型组稍有好转，空泡减少，细胞核相对缩小，但与正常组相比，细胞较大，轮廓不清晰。黄秋葵果胶高剂量组组织切片细胞完整性好，细胞轮廓较为清晰，细胞及细胞核数量增多，且较少出现肿胀迹象，肝损伤现象得到明显改善。
31.3 结论2型糖尿病（t2d）是一种常见的慢性疾病，其特征为胰岛素抵抗和β细胞功能障碍，且发病率逐年升高。在各种活性成分降血糖研究中，以stz诱导的糖尿病小鼠模型最为常用。stz会使得胰岛β细胞功能受损、胰岛素合成减少，从而引发糖尿病。与此同时，由于血糖升高而导致的机体脂质代谢紊乱也会加重胰岛β细胞损伤，导致病情持续恶化。
32.本发明研究结果表明，适当剂量的黄秋葵果胶（15-30mg/ml）能够有效降低stz诱导的糖尿病小鼠的空腹血糖、提高氧化应激水平、调节糖脂代谢、增强其葡萄糖耐受程度，且其效果与剂量浓度成正比。黄秋葵果胶能够降低糖尿病小鼠的tc、tg、ldl，提高hdl水平，明显改善2型糖尿病小鼠的脂质代谢紊乱。同时降低糖尿病小鼠的mda水平，提高sod水平，明显增强2型糖尿病小鼠的氧化应激水平。
33.肝脏作为调节血糖浓度的主要器官，参与糖的代谢过程。本研究结果显示，黄秋葵果胶可以修复小鼠肝脏细胞溶解现象，使得肝脏细胞边缘轮廓清晰，细胞核数量增多。这一结果表明，黄秋葵果胶能兼顾有效护肝，使其发挥血糖调节功能，目前该作用机理仍有待进一步研究检验。
34.综上所述，本研究结果显示长期适当剂量的黄秋葵果胶（15-30mg/ml）干预可以有效调节糖尿病小鼠的血糖水平。黄秋葵果胶可以通过修复肝脏损伤，调节糖尿病小鼠糖脂代谢、改善葡萄糖耐受、提升氧化应激水平。在化学制品主导的降血糖药物市场，黄秋葵果胶因其所具备的护肝降糖效应，有望为糖尿病患者提供安全有效的护肝降糖辅助治疗选择。
35.以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。