益母草提取物及其在降血压血脂中的应用的制作方法

1.本技术涉及益母草技术领域，尤其涉及益母草提取物及其在降血压血脂中的应用。


背景技术：

2.益母草(leonurus japonicas houtt.)为唇形科(labiatae)益母草属(leomrrus)植物iii，收载于2005版药典，并且位列卫健委公布的可用于保健食品的中药名单之一。《本草纲目》记载:“此草及子皆茺盛密蔚，故名茺蔚，其功宜于妇人及明目之精，故有益母之称”。益母草具有活血调经、利水消肿、清热解毒的功效。临床上常用于血滞经闭、痛经、径行不畅、水肿、小便不利等病症。益母草的化学成分比较复杂，目前从其中分离鉴定出约120余种化合物，包括生物碱类、黄酮类、二萜类、香豆素类、三萜类、苯乙醇苷类和挥发油类等化合物。
3.现代药理研究表明，益母草及其成分对子宫、心血管系统、肾脏等均有不同程度的药理作用。但是这些研究主要集中于生物碱与二萜类化合物，此外，含量较少的香豆素类、挥发油类成分也具有明显的药理活性。例如，盐酸益母草碱是益母草中特有的生物碱，可作为定性鉴别和含量测定的质量标志物，具有利尿、抗血小板聚集、抑制肌酸激酶活性和抑制血管平滑肌对缩血管物质的收缩反应等药理作用。liu等(liu x,xin h,hou a,et al.protective effects of leonurine in neonatal rat hypoxic cardiomyocytes and rat infarcted heart[j].clin exp pharmacol physiol,2009,36(7):696-703)在乳鼠原代心肌细胞和大鼠心肌h9c2细胞系模拟缺氧模型上观察益母草碱对心肌细胞损伤的影响，结果显示，与缺氧对照组相比，益母草碱预处理组可明显减轻促凋亡基因bax、fas mrna的表达(p《0.001)和增加抗凋亡基因bcl-2、bcl-xl mrna的表达(p《0.05)，相应地，益母草碱预处理组能明显增加bcl-2的蛋白表达水平，降低bax的蛋白表达水平。又例如，对肾脏的作用张峻等(张峻，周琼，张云，等.益母草防治急性肾功能衰竭的试验[j].基层中药杂志，2000,14(2):12.)用庆大霉素(gmim)引起大鼠急性肾功能衰竭，模型大鼠ig益母草水提物，结果显示益母草水提物能明显降低模型大鼠的bun、scr，且肾脏病理形态学观察表明益母草水提物组大鼠肾小管损伤程度小于模型组，说明益母草水提物对gm引起的大鼠急性肾功能衰竭有保护作用。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本技术的目的在于进一步开放益母草中其他活性成分，研究其更多具有明确药理作用的成分。
[0005]
第一方面，本技术实施例公开了一种益母草提取物，包含榭皮素-3-o-洋槐糖苷、山奈酚-3-o-β-d-吡葡萄糖苷、山奈酚-3-o-β-d-吡喃半乳糖苷、山奈酚-3-o-β-洋槐糖苷、山奈酚-3-新橘皮糖苷、山奈酚-3-o-芸香糖苷、山奈酚-3-o-(6"-o-顺式对香豆酞基)-β-d-吡喃葡萄糖苷、洋芹素-7-o-吡喃葡萄糖苷、2-(3,4-二羟基苯乙基)-o-α-l-吡喃阿拉伯糖
基-(1
→
2)-α-l-吡喃鼠李糖基-((1
→
3)-6-o-β-d-吡喃葡萄糖苷、酪醇-8-o-β-d-吡喃葡萄糖苷、苯乙基-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-((1
→
6)-β-d-毗喃葡萄糖苷和酪醇中的至少一种。
[0006]
在本技术实施例中，所述益母草提取物包含等重量份的榭皮素-3-o-洋槐糖苷、山奈酚-3-o-β-d-吡葡萄糖苷、山奈酚-3-o-芸香糖苷、山奈酚-3-o-(6"-o-顺式对香豆酞基)-β-d-吡喃葡萄糖苷、洋芹素-7-o-吡喃葡萄糖苷、2-(3,4-二羟基苯乙基)-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-(1
→
2)-α-l-吡喃鼠李糖基-((1
→
3)-6-o-β-d-吡喃葡萄糖苷、酪醇-8-o-β-d-吡喃葡萄糖苷、苯乙基-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-((1
→
6)-β-d-毗喃葡萄糖苷和酪醇；其中，每一组分含量不低于9wt％。
[0007]
在本技术实施例中，所述益母草提取物包含等重量份的榭皮素-3-o-洋槐糖苷、山奈酚-3-o-β-d-吡葡萄糖苷、山奈酚-3-o-β-d-吡喃半乳糖苷、山奈酚-3-o-β-洋槐糖苷、山奈酚-3-新橘皮糖苷、山奈酚-3-o-芸香糖苷、山奈酚-3-o-(6"-o-顺式对香豆酞基)-β-d-吡喃葡萄糖苷、洋芹素-7-o-吡喃葡萄糖苷、2-(3,4-二羟基苯乙基)-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-(1
→
2)-α-l-吡喃鼠李糖基-((1
→
3)-6-o-β-d-吡喃葡萄糖苷、苯乙基-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-((1
→
6)-β-d-毗喃葡萄糖苷和酪醇；其中，每一组分含量不低于10wt％。
[0008]
在本技术实施例中，所述益母草提取物包含等重量份的榭皮素-3-o-洋槐糖苷、山奈酚-3-o-β-d-吡葡萄糖苷、山奈酚-3-o-β-洋槐糖苷、山奈酚-3-o-芸香糖苷、洋芹素-7-o-吡喃葡萄糖苷、2-(3,4-二羟基苯乙基)-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-(1
→
2)-α-l-吡喃鼠李糖基-((1
→
3)-6-o-β-d-吡喃葡萄糖苷、苯乙基-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-((1
→
6)-β-d-毗喃葡萄糖苷和酪醇；其中，每一组分含量不低于12wt％。
[0009]
第二方面，本技术实施例公开了一种降血脂保健品包含第一方面的益母草提取物以及保健品学上可接受的辅料。
[0010]
第三方面，本技术实施例公开了一种降血压保健品包含第一方面的益母草提取物以及保健品学上可接受的辅料。
[0011]
第四方面，本技术实施例公开了第一方面所述益母草提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0012]
获得经粉粹的益母粉；
[0013]
获得浸膏，由室温下以95％乙醇水溶液浸提后浓缩得到；
[0014]
获得脱脂物，所述脱脂物是由所述浸膏经石油醚、四氢呋喃和乙酸乙酯依次脱脂处理后得到；
[0015]
获得益母草提取物，所述益母草提取物是将所述脱脂物经大孔树脂层析，经由纯水、15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇梯度洗脱得到。
[0016]
在本技术实施例中，所述制备方法还包括对15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇的洗脱馏分进行反向液相色谱制备的步骤；所述制备的条件为inertsil ods-3色谱柱制备柱，体积流量为5ml/min，流动相：a相为甲醇，b相为ph2.7的磷酸氢二钠醋酸缓冲溶液，洗脱程序为0～20为15％a，20～40min为20％a，40～80min为25％a，80～130min为35％～45％a，最后用100％的a相清理色谱柱。
[0017]
在本技术实施例中，所述脱脂处理过程中，还进行了超声处理，所述超声处理条件为25℃，超声功率密度为24w/l。
[0018]
第五方面，本技术实施例公开了第一方面的益母草提取物、或第二方面的制备方
法制得的益母草提取物在制备降血压血脂的保健品中的应用。
[0019]
与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果：
[0020]
本技术实施例通过对益母草进行提取，得到主要含有h1～h12化合物的相关冻干粉，经过其中h1～h12组分的hmg-coa还原酶和ace抑制活性检测，发现这些组分具有明显的抑制活性，提示其具有降血压和血脂的潜在作用。
[0021]
进一步通过体外和体内实验发现，以h1～h12组分形成的组合物不仅具有体外降血脂的作用，还具有抗凝血作用，提示其不仅具有作为降血压血脂的应用前景，还具有在抗血栓等相关药物的应用前景。
附图说明
[0022]
图1为本技术实施例1提供的大孔树脂层析15％乙醇洗脱馏分的液相色谱图。
[0023]
图2为本技术实施例1提供的大孔树脂层析30％乙醇洗脱馏分的液相色谱图。
[0024]
图3为本技术实施例1提供的大孔树脂层析50％乙醇洗脱馏分的液相色谱图。
[0025]
图4为本技术实施例1提供的大孔树脂层析70％乙醇洗脱馏分的液相色谱图。
[0026]
图5为本技术实施例1提供的大孔树脂层析95％乙醇洗脱馏分的液相色谱图。
[0027]
图6为本技术对比例1提供的大孔树脂层析15％乙醇洗脱馏分的液相色谱图。
[0028]
图7为本技术对比例1提供的大孔树脂层析30％乙醇洗脱馏分的液相色谱图。
[0029]
图8为本技术对比例1提供的大孔树脂层析50％乙醇洗脱馏分的液相色谱图。
[0030]
图9为本技术对比例1提供的大孔树脂层析70％乙醇洗脱馏分的液相色谱图。
[0031]
图10为本技术对比例1提供的大孔树脂层析95％乙醇洗脱馏分的液相色谱图。
[0032]
图11为本技术实施例2～9提供的纤维蛋白溶解圈平板图。
[0033]
图12为本技术对比例2～7提供的纤维蛋白溶解圈平板图。
具体实施方式
[0034]
为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
[0035]
益母草
[0036]
一、材料与方法
[0037]
1、植物来源
[0038]
益母草粉，棕色粉末，兰州沃特莱斯生物科技有限公司。
[0039]
2、提取
[0040]
一个具体的实施例1的提取过程为：
[0041]
(1)益母粉200g，粉碎后于室温下以95％乙醇水溶液浸提48h并浓缩，共浓缩3次，得到74g浸膏；
[0042]
(2)将74g浸膏混入至200ml石油醚中，超声处理10min，超声处理条件为25℃，超声功率密度为24w/l，搅拌充分混匀后，静置10min后，去除石油醚，得经石油醚处理后的固体物；再加入200ml四氢呋喃搅拌充分混匀后，超声处理10min，超声处理条件为25℃，超声功率密度为20w/l，静置10min后，去除四氢呋喃，得到四氢呋喃处理后的固体物；再次加入
200ml乙酸乙酯搅拌充分混合后，超声处理10min，超声处理条件为25℃，超声功率密度为15w/l范围，去除乙酸乙酯，得到脱脂物63g。
[0043]
(3)将63g脱脂物用0～95％的不同梯度的乙醇水溶液溶解，结果发现65％的乙醇水溶液对脱脂物具有最大的溶解度，由此，利用65％的乙醇水溶液将脱脂物溶解后，过滤，利用大孔树脂层析，依次用纯水、15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇(各20l)洗脱，分别收集各洗脱馏分。并对15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇进行浓缩和冷冻干燥，分别得到各馏分冻干粉。
[0044]
一个具体的对比例1的制备过程如下：
[0045]
(1)益母粉200g，粉碎后于室温下以95％乙醇水溶液浸提48h并浓缩，共浓缩3次，得到67g浸膏；
[0046]
(2)将67g浸膏混入至200ml乙酸乙酯中，超声处理10min，超声处理条件为25℃，超声功率密度为24w/l，搅拌充分混匀后，静置10min后，去除乙酸乙酯，得经乙酸乙酯处理后的固体物，处理3次，即可得到脱脂物57g。
[0047]
(3)将57g脱脂物用0～95％的不同梯度的乙醇水溶液溶解，结果发现62％的乙醇水溶液对脱脂物具有最大的溶解度，由此，利用62％的乙醇水溶液将脱脂物溶解后，过滤，利用大孔树脂层析，依次用纯水、15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇(各20l)洗脱，分别收集各洗脱馏分。并对15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇进行浓缩和冷冻干燥，分别得到各馏分冻干粉。
[0048]
3、纯化制备
[0049]
分别对每一洗脱馏分进行的反相液相色谱制备，制备条件如下：
[0050]
inertsil ods-3色谱柱制备柱(型号5020-06832，30mm*250mm*10μm；岛津gl)，柱温：35℃，检测波长为325nm(该检测波长为紫外扫描仪扫描后得到的最佳波长值)，体积流量为5ml/min，流动相：a相为甲醇，b相为ph2.7的磷酸氢二钠醋酸缓冲溶液)，洗脱程序为0～20为15％a，20～40min为20％a，40～80min为25％a，80～130min为35％～45％a，最后用100％的a相清理色谱柱。
[0051]
收集色谱峰上的主要峰面积进行检测和鉴定。
[0052]
4、相关成分的鉴定
[0053]
本技术将经过上述制备色谱峰制得的各主要峰的馏分参照表1的相关方法及相关化合物进行鉴定，以此得各主要峰的馏分中的相关成分的含量。
[0054]
表1
[0055][0056]
5、hmg-coa还原酶(3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶a还原酶)抑制活性测定
[0057]
hmg-coa还原酶催化依赖于nadph的从3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a到甲羟戊酸(mva)的合成反应，由于甲羟戊酸的生成是一个不可逆过程，为胆固醇合成中的限速酶，抑制胆固醇的活性可以通过抑制hmgr的活性间接表达，按照下述反应体检测其本技术例制得的化合物h1～12对其抑制活性。
[0058]
反应中各种组分及其加入量如表2所示，依表头从左到右的顺序依次加入。反应在37℃水浴中进行，反应完成后加入200μl 0.5mol/lnaoh溶液终止反应，通过hplc方法检测反应液中nadph的浓度，根据公式抑制率＝(s抑制剂－s对照)/(s空白－s对照)
×
100％计算，式中，s空白、s对照和s抑制剂分别为空白组、酶对照组和抑制剂组中nadph的峰面积(mau/min)。表2中，hgmr(货号：h7039-250ug)、hmg-coa(货号：h6132-5mg)和nadph(货号：10107824001)均购自sigma。待测样本统一将h1～h11的冻干粉分别用ph 8.3100mm的pbs溶解配制得到20mg/ml的溶液。
[0059]
hplc色谱条件为：c18色谱柱(5μm，4.6mm
×
250mm)；流动相为v(k2hpo
4-kh2po4):v(甲醇)＝85:15，ph值7.2；等度洗脱，流速1ml/min；检测波长337nm，进样量20μl，柱温25℃。
[0060]
表2
[0061][0062]
6、反相高效色谱法测定ace抑制活性
[0063]
用ph 8.3100mm的pbs配制成20mg/ml的h1～h11作为待测样本，实验分为样品组和对照组。样品组：85μl的待测样本与15μl的ace溶液(货号：a2580-.1un，sigma)混合均匀，加入100μl hhl溶液(n-马尿酰-l-组氨酰-l-亮氨酸水合物，1.6mm，货号h1635-25mg，sigma)，37℃温育60min后，利用hplc法检测其中马尿酸的含量。对照组：将待测样本用ph 8.3100mm的pbs含有60％乙醇的溶液替代，其他步骤同样品组。每个样品平行测定3次。
[0064]
色谱条件为：流动相超纯水:乙睛＝75:25，流速0.5ml/min，柱温30℃，进样量20μm，检测其在228nm波长下的吸收峰。其计算式为：r＝(a-b)/a*100％；式中r表示对ace的抑制率(％)，a表示对照组中马尿酸的峰面积，b表示样品组肽组中马尿酸的峰面积。
[0065]
7、数据处理
[0066]
所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用spss13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。
[0067]
二、结果
[0068]
通过对上述实施例1(图1～5)和对比例1(图6～10)对大孔树脂的15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95乙醇的洗脱馏分分别进行反向液相色谱制备。并将各色谱峰的主要峰对应的化合物h1-h11在得到15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇的洗脱馏分的冻干粉中的相关化合物的含量，结果如表2所示。由表2可知，实施例1得到的15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇的洗脱馏分中总共包含h1～h12的12种化合物，而对比例1得到的15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇的洗脱馏分中仅包含h1～h12中的部分化合物，并且其含量不及实施例1提供馏分含量高。
[0069]
表2化合物h1～12含量(mg/g)
[0070][0071][0072]
为此，本技术进一步对15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇的洗脱馏分进行反向指标色谱分离，能够得到各h1～12组分的含量大于95％的冻干粉。
[0073]
表3
[0074]
组分hmg-coa还原酶抑制率ace抑制率h132.37
±
0.64b36.21
±
0.75bh233.04
±
0.83b35.19
±
0.63bh330.16
±
0.55c41.03
±
0.91ah428.38
±
0.46c44.27
±
0.79ah530.19
±
0.53bc34.15
±
0.34bh636.23
±
0.71b36.22
±
0.58bh734.37
±
0.84b35.14
±
0.63bh837.16
±
1.13b38.28
±
0.86bh946.08
±
0.78a38.17
±
0.61bh1043.16
±
1.28a32.38
±
0.27ch1138.64
±
1.24b36.28
±
0.31bh1241.35
±
1.63ab34.65
±
0.56b
[0075]
表3列出了h1～h12化合物分别的hmg-coa还原酶抑制率和ace抑制率。由表3可知，
h9、h10和h12的hmg-coa还原酶抑制率较高，而h1、h2、h6、h7、h8和h11的hmg-coa还原酶抑制率居中，h3和h4的hmg-coa还原酶抑制率较低；而h3和h4的ace抑制率最高，h1、h2、h5、h6、h7、h8、h9、h11和h12的ace抑制率居中，h10的ace抑制率较低。总体而言，h1～h12均具有不同程度分别对hmg-coa还原酶和ace的抑制作用，具有作为调节血脂和血压的潜在应用价值。
[0076]
体外实验
[0077]
一、材料与方法
[0078]
1、血液来源动物
[0079]
雄性sd大鼠，体重(220
±
120)g，由广东省实验动物检测所提供，正常饮食和喂养。
[0080]
2、供试品溶液
[0081]
为进一步验证本技术实施例从益母草中提取的化合物h1～h12在调节血脂和血压等方面的应用，本实验将从h1～h12中挑取部分成分组合，形成新待试样本，以进行体外实验。
[0082]
表4中，由于经过上述实验发现，h1～h12均可溶解在含10％乙醇的pbs中，并且溶解度均大于10mg/ml，继而将各实施例和对比例制得的益母草冻干粉采用该溶液进行溶解。
[0083]
表4中，将实施例1和对比例1在大孔树脂层析过程中洗脱的馏分的冻干粉直接作为本实验的供试品，使用上述溶液配制。另外，还使用h1～h12中不同的馏分进行搭配配制特殊供试品，以供测试。
[0084]
表4
[0085][0086][0087]
3、体外凝血四项值的测定
[0088]
取雄性sd大鼠麻醉，经股静脉取血，加入10％v/v量的含3.8％构椽酸三钠溶液，经
3500rpm离心5min，得其血清，分为空白组、对照组和实验组进行实验。取200μl血清，加入上述表4中的各供试品溶液20μl，经充分混匀，37℃温浴5min。对照组中将供试品溶液更换为10％乙醇的pbs。对照组将供试品溶液更换为20mg/ml氯化胆碱溶液(北京百灵威科技有限公司)。以全自动血凝仪测定各组凝血四项指标，每组重复10次。
[0089]
4、体外血小板聚集的测定
[0090]
采用上述相同方法取得雄性sd大鼠血清，作为贫血小板血浆(prp)；将prp采用2200g离心10min，取上清作为贫血小板血浆(ppp)；采用同只鼠的ppp稀释prp至2.5～3.5
×
108个/ml，每只鼠的prp可平均分成300μl 3份，分别进行空白组、对照组和实验组实验。
[0091]
应用scx000四通道血小板聚集仪，按born比浊法测定血小板聚集性。用ppp将聚集仪调零，取300μl prp，分别加入20μl的供试品，其中空白组加入含10％乙醇的pbs，对照组加入20mg/ml氯化胆碱溶液；37℃温浴5min，然后加入5μmol adp，每次测试时间为5min，记录最大聚集率，计算血小板聚集抑制率＝(对照组血小板最大聚集率－实验组血小板最大聚集率)/对照管血小板最大聚集率
×
100％。
[0092]
5、体外纤维平板实验
[0093]
用pbs缓冲液配制10g/l的纤维蛋白原溶液、1u/ml的凝血酶和100u/ml的尿激酶。取0.2g琼脂粉加20ml pbs缓冲液加热溶解，待温度降至55～60℃时，取18ml放入玻璃杯中，加入30℃的纤维蛋白原溶液1ml，摇匀后再加入30℃的凝血酶溶液1ml，摇匀，立即放入水平放置的90mm玻璃培养皿中，待冷凝后采用7mm中空打孔器打孔。
[0094]
在孔中加入供试品50μl，其中空白组加入10％乙醇、ph＝8.3的pbs，对照组加入尿激酶。然后将平板放入37℃的培养箱，16h后测定溶解圈大小。
[0095]
6、胆酸盐的结合试验
[0096]
配制模拟胃液环境：每只烧杯中分别加入2ml、10mg/ml胃蛋白酶溶液(货号1071850100，sigma)和1ml、0.01mol/l的hc1溶液，分别加入表4中的供试品溶液2ml，于37℃的恒温振荡培养箱中消化1h。
[0097]
配制得模拟肠道环境：加入5ml、10mg/ml胰蛋白酶溶液(货号t2600000，sigma)，分别加入表4中的供试品溶液2ml，用浓度为0.1mol/l的naoh溶液调节ph至6，37℃下恒温振荡培养箱中匀速振荡消化1h。
[0098]
体外消化完成后，向上述反应体系中加入100μl 10mg/ml的牛磺胆酸钠(货号s0900000，sigma)和100μl 10mg/ml甘氨胆酸钠(货号50534-1g，sigma)溶液，在37℃的恒温振荡培养箱中震荡1h，4000rpm离心20min，取上清液，在波长为387nm处测定其吸光度，重复3次。
[0099]
另外，分别配制牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠不同浓度的标准溶液，同样于387nm测定波长，制作标准曲线，拟合得到标准方程。通过标准方程计算模拟胃液和模拟肠道环境中的消化后的牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠，所加入牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠总量减去剩余量所得差值与总量的比值即为结合率，以百分比表示。通过两种胆酸钠盐与绿原酸的结合率，来测定供试品体外降血脂能力。
[0100]
牛磺胆酸钠结合率(％)＝(吸附前牛磺胆酸钠量－吸附后牛磺胆酸钠量)/样品质量
×
100％
[0101]
甘氨胆酸钠结合率(％)＝(吸附前甘氨胆酸钠量－吸附后甘氨胆酸钠量)/样品质
量
×
100％
[0102]
7、数据处理
[0103]
所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用spss13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。
[0104]
二、结果
[0105]
表5凝血四项结果
[0106]
分组pt/saptt/stt/sfib/g/l实施例211.73
±
0.12b30.55
±
1.37b26.20
±
1.06a2.162
±
0.067b实施例311.63
±
0.28b30.61
±
1.93b26.19
±
1.15a2.176
±
0.059b实施例411.91
±
0.21ab30.32
±
1.25b26.16
±
1.31a2.235
±
0.082ab实施例511.75
±
0.13b30.53
±
1.26b26.20
±
1.21a2.224
±
0.073ab实施例611.84
±
0.14b30.41
±
1.12b26.17
±
1.04a2.185
±
0.023b实施例712.13
±
0.31a30.84
±
1.23a26.20
±
1.07a2.134
±
0.057b实施例812.54
±
0.27a30.96
±
0.76a26.21
±
1.23a2.305
±
0.071a实施例912.96
±
0.32a31.03
±
1.14a26.19
±
1.63b2.413
±
0.092a对比例211.19
±
0.22c23.43
±
1.52c26.18
±
1.43b1.969
±
0.034d对比例311.20
±
0.17c23.42
±
1.36c26.29
±
1.16a1.972
±
0.041d对比例411.18
±
0.19c23.41
±
1.17c26.22
±
1.07a1.976
±
0.032d对比例511.22
±
0.14c23.44
±
1.63c26.17
±
1.54a1.965
±
0.055d对比例611.19
±
0.07c23.39
±
1.15c26.21
±
1.64a1.970
±
0.039d对比例711.63
±
0.15b23.94
±
1.31bc26.19
±
1.43a1.992
±
0.063c对照组11.21
±
0.16c23.37
±
1.42c26.23
±
1.59a1.974
±
0.063d空白组11.25
±
0.35c23.42
±
1.76c26.07
±
2.19b1.952
±
0.041e
[0107]
表5列出了上述体外凝血实验。对照组相对空白组，除tt和fib增大外，其他三项指标无显著性差异。而实验组中，实施例2～9提供的供试品对大鼠血清反应后，pt、aptt和fib数据均显著高于空白组，而对比例2～6提供的供试品对大鼠血清的抗凝四项指标均与空白组相差不大，无明显的抗凝效果。并且实施例2～9提供的供试品的抗凝四项指标均在正常值范围内。
[0108]
表6
[0109]
[0110][0111]
实施例2～9(图11)和对比例2～7(图12)产生对纤维蛋白的溶解圈可知，实施例2对纤维蛋白的溶解效果更明显。表6列出了各组实验对adp诱导的血小板聚集率和抑制率以及对纤维蛋白的溶解圈大小，其中，“－”表示未检出。
[0112]
由表6可知，空白组无明显的血小板抑制活性和对纤维蛋白的溶解活性。相对对照组，实施例2～9提供的供试品的聚集率均显著降低，抑制率显著升高，而溶解圈显著增大，由此说明本技术实施例提供的以益母草活性化合物h1～h12为基础配制的供试品对adp诱导的sd大鼠血小板的聚集具有抑制活性，并对体外纤维蛋白具有溶解活性。
[0113]
表7
[0114][0115]
[0116]
表7列出了实施例2～9和对比例2～7在体外的模拟胃液和模拟肠液对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合率结果。表7可知，实施例2～9提供的供试品对对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合率均显著高于对比例2～7，并且对甘氨胆酸钠的结合率更高，并且对模拟胃液和模拟肠液对供试品的结合率影响较小。由此说明，以本技术实施例从益母草中纯化得到的h1～h12为基础制得的供试品于体外能够结合牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠，而牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠作为体外降血脂实验的常规参考指标，由此提升本技术实施例由益母草中纯化得到的h1～h12化合物及其组合物具有体外降血脂功能。
[0117]
体内实验
[0118]
一、材料与方法
[0119]
1、实验动物
[0120]
雌雄各半的正常sd大鼠(广东省实验动物检测所)，给予普通饲料适应性喂养1周。
[0121]
spf级高血压模型shr大鼠，维通利华(vital river)，10周年龄。
[0122]
2、供试品
[0123]
采用食用明胶(广州市嘉彤化工)对实施例2～9和对比例2～7提供的各馏分的冻干粉进行配制，以制得供试品。其中，实施例2～9和对比例2～7提供的各馏分的冻干粉在供试品中的含量均为16wt％。
[0124]
3、高血脂实验
[0125]
实验分为正常组、模型组、对照组和实验组。正常组喂普通饲料外，其余各组均给予高脂饲料(货号：xthf45，协同生物)喂养，连续喂养4周后，空腹静脉取血，采用对应的试剂盒(上海恒远生物)测定tg、tc、ldl-c及hdl-c，按测定的血脂指标情况判定高脂模型成功建立。
[0126]
实验组按照500mg/kg
·
d的剂量每天给大鼠灌胃，可用7％的生理盐水稀释后灌胃；
[0127]
对照组给予高血脂模型大鼠相同剂量的藻酸双酯钠片(天津太平洋制药有限公司)。
[0128]
正常组和模型组给予等量的蒸馏水，连续给药30d。给药期间除正常对照组喂普通饲料外，其余各组均给予高脂饲料喂养。
[0129]
4、血脂检测
[0130]
停止给药1d后，禁食12h(饮水不限)，称定大鼠体重腹主动脉取血测定血脂相关指标(tg、tc、ldl-c及hdl-c)。
[0131]
5、高血压实验
[0132]
直接将上述的高血压模型shr大鼠按照按照50mg/kg
·
d的剂量每天灌胃，可用7％的生理盐水稀释后灌胃；对照组给药高血压模型shr大鼠的卡托普利5mg/kg
·
d。正常组和模型组给予等量的蒸馏水，连续给药30d，给药期间各组正常喂养。
[0133]
6、血压检测
[0134]
按受试剂量对各组大鼠给药，以灌胃后第14天，利用小动物无创血压(鼠尾无创压)测量仪(货号nibp200a，北京普升科技有限公司)尾套置于大鼠尾部近心端，用以阻断或松解动脉血流，根据尾部动脉博动曲线和压力换能器剂量压力曲线准确读取收缩压和舒张压。
[0135]
7、数据处理
[0136]
所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用spss13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。
[0137]
二、结果
[0138]
表8单位mm
[0139][0140]
表8列出了各组大鼠血清中在实验完成停药1天后的tc、tg、ldl-c及hdl-c含量。结果可知，模型组大鼠血清中tc、tg、ldl-c含量均显著高于正常组，而hdl-c含量显著低于正常组，说明高血脂模型大鼠造模成功；对照组大鼠血清中tc、tg、ldl-c含量均显著低于模型组，而hdl-c含量显著高于正常组，说明对照组的藻酸双酯钠片对高血脂模型大鼠具有一定的降血脂作用。
[0141]
而实验组中，实施例2～9提供的供试品干预高血脂模型大鼠后，其血清中tc、tg、ldl-c含量均显著低于模型组，而hdl-c含量显著高于模型组，说明本技术实施例2～9提供的以益母草化合物h1～h12的组合物的供试品，具有降低大鼠高血脂作用。并且，相对于对比例2～7提供的供试品，实施例2～9提供的供试品的降血脂作用更加明显。
[0142]
表9单位mmhg
[0143][0144]
表9列出了各组shr大鼠在经给药干预后第14天的舒张压和收缩压。结果可知，模型组大鼠舒张压和收缩压均显著高于正常组，而对照组大鼠舒张压和收缩压均显著低于模型组，说明对照组药物对shr模型大鼠具有一定的干预作用。
[0145]
而实验组中，实施例2～9提供的供试品干预shr高血压模型大鼠后，其舒张压和收缩压均显著低于模型组，说明本技术实施例2～9提供的以益母草化合物h1～h12的组合物的供试品，具有降低大鼠血压的作用。并且，相对于对比例2～7提供的供试品，实施例2～9提供的供试品的降血压作用更加明显。
[0146]
综上所述，本技术实施例通过对益母草进行提取，得到主要含有h1～h12化合物的相关冻干粉，经过其中h1～h12组分的hmg-coa还原酶和ace抑制活性检测，发现这些组分具有明显的抑制活性，提示其具有降血压和血脂的潜在作用。
[0147]
进一步通过体外和体内实验发现，以h1～h12组分形成的组合物不仅具有体外降血脂的作用，还具有抗凝血作用，提示其不仅具有作为降血压血脂的应用前景，还具有在抗血栓等相关药物的应用前景。
[0148]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。