一种具有修复功效的忍冬花发酵物及其制备方法与流程

1.本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种具有修复功效的忍冬花发酵物及其制备方法。


背景技术：

2.忍冬花由于其清热解毒的特性，在传统中药中已经广泛应用了数千年。在临床实践中，超过500份包括忍冬花在内的处方已被用于治疗各种疾病。药理研究表明，忍冬花具有抗炎、抗病毒、抗糖尿病、抗过敏、抗氧化等多种作用，可用于治疗多种病毒性疾病，如sars、h7n9病毒和感染。此外，它还被用作健康食品、化妆品、软饮料和观赏性植物。因此，忍冬花广泛的市场引来了众多学者的广泛关注，他们已经从忍冬花中分离出了许多化学成分，如有机酸、黄酮、环烯醚醚、三萜和挥发性油，已报道为其具有一定的潜在药理作用的活性成分。越来越多的实验表明忍冬花提取物能够抑制各种炎症反应和各种炎症因子，广泛认为忍冬花是一种安全和温和的抗炎药物，用于各种炎症疾病治疗。
3.目前，对忍冬花中有效成分的提取主要是水提、醇回流提取技术、超声波提取技术以及用解吸-热提两步法等。忍冬花水提物、甲醇和70％乙醇提取物均具有较好的抗氧化活性，而体外dpph清除活性、超氧阴离子清除活性研究表明花蕾水提物、乙醇提取物和超临界流体萃取物均具有抗氧化作用。对水提物、石油醚、乙酸乙酯及正丁醇部位的总酚含量、总黄酮含量和抗氧化活性进行比较研究，结果表明，乙酸乙酯部位的总酚、总黄酮含量最高，体外dpph自由基清除活性和还原能力最佳，正丁醇部位清除abts自由基和超氧阴根离子自由基能力最好，水提物、乙酸乙酯和正丁醇提取物的抗氧化活性强于阳性对照丁羟基甲苯。
4.与化学和物理方式相比，利用微生物发酵技术对活性成分进行提取具有以下优势：可以保持独特完整的原有天然化合物及其衍生物的活性；通过发酵可以增加生物活性与生物适应性、提高溶解度与可消化度，开发新功能生物活性成分；提高水果、蔬菜和草药的风味与天然颜色；此外，低温工艺保护了热敏感植物化学成分。因此，开发具有修复功效的忍冬花发酵物具有重要的现实意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具有修复功效的忍冬花发酵物及其制备方法。
6.本发明提供了一种具有修复功效的忍冬花发酵物的制备方法，包括以下步骤：
7.s1)将忍冬花干粉与酶液混合后进行酶解，得到忍冬花酶解物；
8.s2)将忍冬花酶解物经灭菌处理后，加入酵母菌和/或乳酸菌进行发酵，得到忍冬花发酵物。
9.优选的，所述酶液包括纤维素酶与果胶酶；所述纤维素酶与果胶酶的质量比为1：(0.5～2)。
10.优选的，所述酶液中纤维素酶的酶活为2500～3500u/ml；所述酶液中果胶酶的酶
活为2000～3000u/ml；
11.所述酶液与忍冬花干粉的质量比为(15～25)：1。
12.优选的，所述酶解的温度为40℃～60℃；所述酶解的时间为2～4h。
13.优选的，所述步骤s1)中酶解后离心，得到忍冬花酶解物；所述离心的转速为6000～12000r/nmin；所述离心的时间为10～20min。
14.优选的，所述酵母菌的活菌数大于等于1
×
107cfu/ml；所述乳酸菌的活菌数大于等于1
×
108cfu/ml；所述酵母菌的质量为忍冬花酶解物质量的3％～7％；所述乳酸菌的质量为忍冬花酶解物质量的5％～15％。
15.优选的，所述酵母菌为植物乳杆菌；所述酵母菌为酿酒酵母菌。
16.优选的，所述乳酸菌包括植物乳杆菌cctcc no：m 20191045和/或植物乳杆菌accc 03954；
17.所述酵母菌包括安琪葡萄酒酵母sy和/或酿酒酵母accc 21188。
18.优选的，所述发酵的温度为28℃～37℃；所述发酵的时间为2～4天。
19.本发明还提供了一种上述制备方法制备的具有修复功效的忍冬花发酵物。
20.本发明提供了一种具有修复功效的忍冬花发酵物的制备方法，包括以下步骤：s1)将忍冬花干粉与酶液混合后进行酶解，得到忍冬花酶解物；s2)将忍冬花酶解物混合经灭菌处理后，加入酵母菌和/或乳酸菌进行发酵，得到忍冬花发酵物。与现有技术相比，本发明利用酵母菌和/或乳酸菌对忍冬花酶解物进行发酵，利用微生物发酵技术可避免物理及化学提取手段对活性成分的影响，使得到的忍冬花发酵物中活性成分含量高，具有较高的自由基清除能力，具有修复功效，可用于皮肤抗损伤修复。
附图说明
21.图1为本发明实施例中样品对角质形成细胞果酸损伤影响的柱形图；
22.图2为本发明实施例中样品对角质形成细胞果酸损伤影响的显微图；
23.图3为本发明实施例中样品对角质形成细胞sls损伤影响的柱形图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.本发明提供了一种具有修复功效的忍冬花发酵物的制备方法，包括以下步骤：s1)将忍冬花干粉与酶液混合后进行酶解，得到忍冬花酶解物；s2)将忍冬花酶解物混合经灭菌处理后，加入酵母菌和/或乳酸菌进行发酵，得到忍冬花发酵物。
26.其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。
27.将忍冬花干粉与酶液混合后进行酶解；所述忍冬花干粉为本领域技术人员熟知的忍冬科花的干粉即可，并无特殊的限制，本发明中优选为山银花干粉；所述酶液优选包括纤维素酶与果胶酶；所述纤维素酶与果胶酶的质量比优选为1：(0.5～2)，更优选为1：(0.8～1.5)，再优选为1：(0.8～1.2)，最优选为1：1；所述酶液中纤维素酶的的酶活优选为2500～
3500u/ml，更优选为2800～3200u/ml，再优选为3000u/ml；所述酶液中果胶酶的酶活优选为2000～3000u/ml，更优选为2200～2800u/ml，再优选为2400～2600u/ml，最优选为2500u/ml；所述酶液与忍冬花干粉的质量比优选为(15～25)：1，更优选为(18～22)：1，再优选为20：1；所述酶解的温度优选为40℃～60℃，更优选为45℃～55℃，再优选为50℃；所述酶解的时间优选为2～4h，更优选为1.5～3.5h，再优选为3h。
28.酶解后优选离心，得到上清液即为忍冬花酶解物；所述离心的转速优选为6000～12000r/nmin，更优选为8000～10000r/nmin，再优选为10000r/nmin；所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。
29.将忍冬花酶解物混合进行灭菌处理；优选为忍冬花酶解物混合；所述灭菌处理的温度优选110℃～120℃，更优选为115℃；所述灭菌处理的时间优选为15～30min，更优选为15～25min，再优选为20min。
30.然后加入酵母菌和/或乳酸菌进行发酵；所述酵母菌的质量优选为忍冬花酶解物质量的3％～7％，更优选为5％；所述酵母菌优选为酿酒酵母菌，更优选为安琪葡萄酒酵母sy和/或酿酒酵母accc 21188；所述酵母菌的活菌数优选大于等于1
×
107cfu/ml；在本发明中所述酵母菌优选按照以下步骤活化得到：将酵母菌菌种接种于ypd培养基中，通过培养传代，得到酵母菌；所述培养的温度优选为25℃～35℃，更优选为30℃；所述培养的时间优选为36～48h；所述传代的次数优选为3次；所述乳酸菌的质量优选为忍冬花酶解物总质量的5％～15％，更优选为8％～12％，再优选为10％；所述乳酸菌优选为植物乳杆菌，更优选为保藏编号为cctcc no：m 20191045的植物乳杆菌picp-2和/或植物乳杆菌accc 03954；所述乳酸菌的活菌数优选大于等于1
×
108cfu/ml；所述乳酸菌优选按照以下步骤活化得到：将乳酸菌菌种接种于mrs培养基中，通过培养传代，得到乳酸菌；所述培养的温度优选为25℃～35℃，更优选为30℃；所述培养的时间优选为24h以上；所述传代的次数优选为3次。所述发酵的温度优选为28℃～37℃；在本发明中，当只采用乳酸菌进行发酵时，发酵的温度优选为37℃；当发酵体系中含有酵母菌时，发酵的温度优选为28℃；所述发酵的时间优选为2～4天，更优选为3天。
31.发酵后，优选离心，收集上清液即得到忍冬花发酵物；所述离心的转速优选为6000～12000r/nmin，更优选为8000～10000r/nmin，再优选为10000r/nmin；所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。
32.本发明利用酵母菌和/或乳酸菌对忍冬花酶解物进行发酵，利用微生物发酵技术可避免物理及化学提取手段对活性成分的影响，使得到的忍冬花发酵物中活性成分含量高，具有较高的自由基清除能力，具有修复功效，可用于皮肤抗损伤修复。
33.本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的具有修复功效的忍冬花发酵物。
34.为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种具有修复功效的忍冬花发酵物及其制备方法进行详细描述。
35.以下实施例中所用的试剂均为市售；实施例中所用植物乳杆菌accc03954与酿酒酵母accc 21188购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心；实施例中所用hacat人永生化角质细胞(bio-51586)购买自微生物菌种查询网(https://www.biobw.org/)。
36.对比例1
37.1.1山银花水提
38.按照纯水：山银花干粉＝20:1的比例混合，90℃提取3小时，9000r/min离心15min，取上清用于指标检测，得到山银花水提物。
39.1.2山银花水提后发酵物的制备：
40.a)发酵菌种选择
41.乳酸菌：植物乳杆菌(保藏编号为cctcc no：m 20191045的植物乳杆菌picp-2)和植物乳杆菌accc 03954；
42.酵母菌：安琪葡萄酒酵母sy和酿酒酵母accc 21188。
43.b)发酵菌种活化
44.酵母菌：将菌种接种于ypd培养基中，于30℃恒温培养36～48h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0
×
107cfu/ml以上，得到酵母菌sy。
45.乳酸菌：将菌种接种于mrs培养基中，于35℃恒温培养24h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0
×
108cfu/ml以上，得到乳酸菌picp-2。
46.c)山银花水提后发酵
47.乳酸菌和酵母菌混菌发酵：200ml 1.1中得到的山银花水提物，115℃、20min灭菌，加入10％乳酸菌picp-2+5％安琪葡萄酒酵母sy或者(植物乳杆菌accc 03954+酿酒酵母accc 21188)，28℃发酵3天。离心，收集上清，得到所述山银花水提后发酵物，9000r/min离心15min得到山银花发酵物用于指标检测。
48.实施例1
49.1.1山银花酶解
50.按照粗酶液体(果胶酶和纤维素酶1:1；果胶酶酶活：2500u/ml；纤维素酶酶活：3000u/ml)：山银花干粉＝20:1的比例混合，50℃提取3小时，9000r/min离心15min，取上清用于指标检测，得到山银花酶解物。
51.1.2山银花酶解后发酵物的制备
52.发酵菌种选择与活化
53.a)发酵菌种选择
54.乳酸菌：植物乳杆菌(保藏编号为cctcc no：m 20191045的植物乳杆菌picp-2)和植物乳杆菌accc 03954；
55.酵母菌：安琪葡萄酒酵母sy和酿酒酵母accc 21188。
56.b)发酵菌种活化
57.酵母菌：将菌种接种于ypd培养基中，于30℃恒温培养36～48h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0
×
107cfu/ml以上。
58.乳酸菌：将菌种接种于mrs培养基中，于35℃恒温培养24h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0
×
108cfu/ml以上。
59.c)山银花酶解后发酵
60.单独酵母菌发酵：200ml 1.1中得到的山银花酶解物，115℃、20min灭菌，加入5％酵母菌sy或者酿酒酵母accc 21188，28℃发酵3天。
61.单独乳酸菌发酵：200ml 1.1中得到的忍冬花酶解物，115℃、20min灭菌，加入10％乳酸菌picp-2或者植物乳杆菌accc 03954，37℃发酵3天。
62.乳酸菌和酵母菌混菌发酵：200ml 1.1中得到的山银花酶解物，115℃、20min灭菌，
加入10％乳酸菌picp-2+5％酵母菌sy或者(accc 03954+accc21188)，28℃发酵3天。离心，收集上清，得到所述山银花酶解后发酵物，9000r/min离心15min得到山银花发酵物用于指标检测。
63.1.3指标检测
64.(1)dpph自由基清除能力的测定：
65.实验组加入1ml样液(山银花发酵物)+1ml 0.2mmol/l的dpph乙醇溶液。对照组加入1ml无水乙醇+1ml样液。空白组加入1ml无水乙醇+1ml0.2mmol/l的dpph乙醇溶液，混匀室温(25℃)下静置30min。517n m下，吸取300μl，测定实验组吸光度，记为ai。测定对照组吸光度，记为aj。记空白组为a0。每个样品测3次平行。
66.dpph清除率(％)＝[1-(a
i-aj)/a0]
×
100％
[0067]
(2)超氧阴离子自由基清除能力测定：
[0068]
在10ml试管中加入5.7ml tris-hcl缓冲液(50mmol/l，ph＝8.2)，加入0.2ml样液(山银花发酵物)进行混合之后放置在25℃保温箱中，10min后取出，再加0.1ml(10mmol/l)邻苯三酚水溶液(已预热)，快速混匀后用多功能酶标仪测定320nm波长1min内吸光值的增加值(aj)，线性范围内算出每1min吸光度的增加值，另取如上试剂，用等体积水替代样液，测定在320nm波长下，1min内吸光度的增加值(ai)。
[0069]
超氧阴根离子自由基清除率(％)＝(a
i-aj)/ai×
100％
[0070]
(3)羟基自由基(
·
oh)清除能力测定：
[0071]
羟基自由基(
·
oh)清除测试方法参照fenton反应方法，在试管中依次加入硫酸亚铁溶液(6mmol/l)、过氧化氢溶液(6mmol/l)、样液(忍冬花发酵物)各2ml后静放置10min，之后再加入2ml水杨酸溶液(6mmol/l)，静放30min后在510nm处测定吸光度a0，用蒸馏水代替样品溶液同样处理，测定吸光值a
x
。
[0072]
羟基自由基(
·
oh)清除率(％)＝(1-a0/a
x
)
×
100％
[0073]
(4)abts清除力的测定：
[0074]
0.2ml 7.4mmol/l abts与0.2ml 2.6mmol/l k2s2o8混合，在室温条件黑暗处反应12h，反应完成后用95％乙醇(ph＝7.4磷酸盐缓冲液，95％乙醇或甲醇)稀释40～50倍，使得混合液在734nm光度下吸收值处于0.68～0.72，得到工作液。
[0075]
将不同处理发酵样液(山银花发酵物)稀释后，分别吸取0.2ml，加入0.8ml稀释后的工作液，混合均匀后静置反应6min，迅速测定734nm波长处的吸光值a0。用95％乙醇代替样品溶液同样处理，测定吸光值a
x
。每个样品测3次平行。
[0076]
abts自由基清除率(％)＝1-a0/a
x
×
100％
[0077]
(5)总还原力检测
[0078]
移取1ml样液(山银花发酵物)于10ml ep管中，随即快速加入2.5ml(0.2ml/l)的pbs溶液和2.5ml 1％的铁氰化钾溶液，混匀后于50℃水浴锅中保温20min，取出后，加入2.5ml 10％的三氯乙酸溶液，加入三氯乙酸后若产生沉淀，则室温下3500r/min离心10min，吸取2.5ml的上清液，加入2.5ml蒸馏水；若加入三氯乙酸后无沉淀产生，吸取2.5ml溶液后加入2.5ml蒸馏水。加入0.5ml 0.1％的三氯化铁溶液，混匀后反应10min。对照组用等量蒸馏水代替样液，其他操作不变。最后在700nm光度下测定吸光值，实验组与对照组的吸光度大小与还原力成正比。
[0079]
(6)总多酚含量的测定
[0080]
在室温条件下，精确移取1mg/ml没食子酸标准液0、20、40、60、80、100、200、400和600μl置于试管中并用纯水补足至1ml。加入1.5ml folin
–
ciocalteu的试剂溶液反应3～8min后，添加1ml 20％(g/v)的na2co3溶液，混匀，用双蒸水定容至10ml。在室温下反应60min后，测定在760nm处的吸光度，以总多酚含量(x)为横坐标，吸光值760nm(y)为纵坐标，制作总多酚溶液标曲，总多酚的含量以没食子酸(mg/ml)表示。吸取100μl样液(山银花发酵物)，按照福林酚法测定吸光值，再根据标准曲线计算总多酚含量。
[0081]
(7)总黄酮含量的测定
[0082]
芦丁标准曲线的绘制及过程
[0083]
配制标准品溶液:取5mg芦丁标准品至于25ml容量瓶中，加70％乙醇至刻度摇匀得到0.2mg/ml芦丁标准品溶液，分别量取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00ml芦丁标准品溶液分别置于25ml容量瓶。
[0084]
加5.00ml水与1.00ml 5％亚硝酸钠溶液摇匀静置6min；
[0085]
加入10.00％硝酸铝溶液1.00ml摇匀静置6min；
[0086]
加入4.00％氢氧化钠溶液10.00ml，再分别加水至刻度静置15min；
[0087]
另外，以不加标准品的溶液为空白对照。
[0088]
用紫外分光光度计全波长200～800nm扫描，得最大吸收波长为510nm，在510nm波长处测定吸光度，以浓度c为横坐标，吸光度a为纵坐标，制作标准曲线。
[0089]
样液总黄酮含量测定
[0090]
取待测样液(忍冬花发酵物)1ml按芦丁标准曲线绘制方法静置15分钟后在510nm波长下测定吸光度a，根据回归方程计算待测溶液中的总黄酮的含量(mg/ml)。
[0091]
1.4细胞实验方案
[0092]
通过果酸和sls损伤诱导建立人皮肤角质形成细胞损伤模型，通过mtt比色法检测待测物抗损伤的保护作用，以期为待测物在抗损伤修复领域的产品开发提供实验依据。
[0093]
(1)细胞铺板：将细胞悬液密度调整至0.8
×
105个/ml后接种于96孔板，100μl/孔，同时设细胞阴性孔、损伤阳性孔和调零孔，置于37℃，5％co2细胞培养箱培养24h。
[0094]
(2)果酸或sls诱导氧化损伤：弃去旧培养基，用培养基将果酸或sls母液稀释至0.3％后加入细胞，100μl/孔，细胞阴性对照孔和调零孔加入完全培养基，置于37℃，5％co2细胞培养箱内培养2～3h后弃去。
[0095]
(3)待测物稀释与加样：以完全培养基为稀释液，以完全培养基为稀释液，将待测物稀释至实验浓度加至细胞，100μl/孔，细胞对照孔、损伤阳性孔和调零孔加等量完全培养基，置于37℃，5％co2细胞培养箱内培养24h。
[0096]
(4)mtt检测：按1.(4)中方法进行检测。
[0097]
(5)计算：同1.(5)中计算方法。
[0098]
(6)统计分析：同1.(6)。
[0099]
1.5实验结果
[0100]
表1发酵物指标含量
[0101][0102][0103]
(7)果酸损伤修复功效测试结果，如图1与图2所示。图1中，若样品的细胞活率高于nc组细胞活率，则说明其具有修复作用；反之无效果。图2中bc为空白对照组，nc为模型损伤
组。由图1与图2可知，正常状态下，bc空白对照组细胞正常贴壁，细胞成铺石子路状，经果酸处理后nc组细胞形态异常，边缘不规则，且部分细胞脱落甚至死亡，nc组细胞活率相比于bc组下降至43％左右；结合定量和细胞形态学观察的结果，测试浓度为1％、0.1％、0.01％的sy+picp-2
①
、sy+picp-2
②
、sy+picp-2
③
山银花发酵液对果酸损伤角质形成细胞均具有显著的修复功效。
[0104]
(8)sls损伤修复功效测试结果，如图3所示。图3中，若样品的细胞活率高于nc组细胞活率，则说明其具有修复作用，反之无效果。bc为空白对照组，nc为模型损伤组。由图3可知，经sls处理后nc组细胞形态发生明显改变，细胞收缩形态异常，且部分细胞间隙变大，脱落甚至死亡，nc组细胞活率相比于bc组下降至75％左右。测试浓度为0.01％的sy+picp-2
①
、0.01％的sy+picp-2
②
、0.1％的sy
‑②
、酶解0.1％、未酶解1％、0.1％、0.01％山银花发酵液对角质形成细胞sls损伤具有一定的修复作用。其他测试浓度的山银花发酵液无明显sls损伤角质形成细胞修复功效。