专利名称：新五肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一个新五肽，该五肽对体内、体外试验中再生肝的DNA合成和有丝分裂速度以及对恶性肝癌细胞株的生长和DNA合成都有明显的抑制作用。
因此，这个五肽可用于治疗哺乳动物，特别是人的一些不良细胞生长的肝病如肝癌。这个肽也影响正常肝细胞，从而也可用于控制肝细胞生长的场合。
正如在WO87/00180(PCT/NO86/00041)中所叙述的，以前就知道一些五肽具有抑制细胞生长的活性。其中所说的这些五肽可抑制鳞状上皮细胞的繁殖，因此适宜治疗上皮细胞的不良生长。然而，这种活性是有选择性的，因此，已知道的一些五肽对其他器官的不良细胞生长没有同样的活性。
在VirchowsArchB(1987)54152-154中，JanErikPaulsen，Karl-L、Reichelt和AnneK、Petersen的文章中，以“生长抑制肝肽的纯化与鉴定，初步评论”为标题叙述了由鼠肝分离的五肽看来抑制了鼠再生肝的有丝分裂速度和DNA合成。发现部分肝切除后，DNA合成和有丝分裂速度用由鼠肝分离的肽处理后与对照相比明显降低。
除了有一个具N-末端焦谷氨酸的五肽的问题外，没有发现任何关于包括其氨基酸及其序列的叙述。大量试验后，我们发现一系列完全鉴定结构的新五肽。
根据本发明，现在提供这些新五肽的通式，
其中Z是CH2或CO，Y是H或OH，以及X1，X2和X3每一个是独立的OH或NH2假如X2和X3两者不都是NH2这些化合物可以用任何适合于制备肽的方法制备。在其制备方法后一阶段，肽将正常的做为有保护基的衍生物存在，在最后一步或几步将除去保护基(氨基，酰胺基，羟基和或羧基)。特别适合的方法就是被认为适合于低肽及其类似物制备的所谓固相法，该法制备快，产量好。用这个方法增长的肽鏈被连接于固体多聚支撑物上，並且合成起始是通过把C-末端氨基酸结合于多聚体。把最普通的氨基酸连接于聚合物支撑体在现今商业上是合用的。然后通过重复循环去保护基、洗涤和偶联将下一个氨基酸连接于结合在多聚体的氨基酸上。用这种方法以结合于多聚体的形式组成完整的肽，並且在完全组合完成时用适当试剂由多聚体上把最终产物切割下来。同时或以后也除掉保护基。
在液相肽合成中，肽鏈起始于C-末端氨基酸。除α-氨基外，全部侧鏈通常用在整个合成条件下稳定的适宜的保护基保护。α-氨基在反应中是游离的或是通过容易除掉的有机或无机盐进行半保护。
在搅拌下，向这个C-末端氨基酸(或肽)的溶液加入为增长鏈要连接的下一个氨基酸。除α-羧基外，所说的下一个氨基酸的全部反应活性侧鏈通常都用适当的保护基保护，这种保护基在全合成所使用的条件下是稳定的。α-羧基要么预先用任何适宜的方法活化，要么准备好用任何适宜的方法原处活化以便偶联到C-末端氨基酸(或肽)的游离氨基上。假如C-末端氨基酸(或肽)是用有机或无机酸形成盐的半保护，那么就需要加一当量的适宜的碱以提供游离的α-氨基。
就原地活化来说，可用任何适宜的活化方法，如DCC，EEDQ，混合酸酐，BOP，叠氮化物等。
预活化剂可以是对称的酸酐，活性酯等。
通过加某些化学药品以加速反应或抑制/阻碍外消旋以帮助偶联的羧基预活化和原处活化。这样的添加剂可以是像羟基苯并三唑，N-羟基-琥珀酰亚胺等化合物。
产生的肽可通过任何适宜的方法如液液提取或沉淀法由反应混合物中分离出来。粗产物通常不进一步纯化使用，纯化鉴定试验以TLC来进行。新肽的N-末端α-氨基去保护是通过一个试剂进行的，这个试剂能选择性地、定量地除掉暂时的N-保护基，而不影响其他(侧鏈)保护基。
这个具有游离氨基的保护的肽是增长肽鏈的C-末端部分，以把下一个氨基酸加到增长肽鏈的N-末端而重复这一完整步骤。
这个步骤被重复，直至得到整个保护的肽衍生物。
通过用能裂开所有永久性保护基的试剂处理保护的肽衍生物制备游离的肽。这种反应/试剂的例子是TFA对酸介质稳定的保护基经钯/炭氢解苄保护基适宜的用做脱除酸保护基的是HF。
这样，由C-末端-头数为五肽一部分的氨基酸单位如下1) 天冬氨酸(Asp) X2＝X3＝OHβ-天冬酰氨(β-Asn) X2＝NH2，X3＝OHα-天冬酰氨(α-Asn) X2＝OH，X＝NH22)丙氨酸(Ala)Y＝H丝氨酸(Ser)Y＝OH3)甘氨酸(Gly)4) 谷氨酸(Glu) X1＝OH谷氨酰氨(Gln) X1＝NH25)焦谷氨酸(PGlu)Z＝CO脯氨酸(Pro) Z＝CH2一般说来，除了丙氨酸可用其D-型外，所有氨基酸均用其L-型。
式Ⅰ中的两个化合物已进行体外体内进一步试验。这些化合物是APGlu-Gln-Gly-Ser-B-Asn(Z＝CO，Y＝OH，X1＝NH2，X2＝NH2，X3＝OH)BPGlu-Glu-Gly-Ser-B-Asn(Z＝CO，Y＝OH，X1＝OH，X2＝NH2，X3＝OH)(所有氨基酸均为L-构型)、
下表说明在小鼠70%肝切除后，化合物A如何抑制再生肝重的增加。每天上午12.00腹膜注射化合物A的盐水液，对照只用盐水处理。
肝切除70%每只动物所给肝湿重占对照后的天数肽的Pmole的%P4010041101±741079±60.005410077±50.0025N＝8±SD在体外试验进一步发现，这个肽抑制由莫利斯(Morris)移植肝癌的MH1C1克隆变种的繁殖和DNA合成。
化合物B给药于70%肝切除的鼠，给药后5小时测定有丝分裂速度。如下表展示的，发现有丝分裂速度大约为对照的40%
肽浓度细胞总数占对照的%P0(对照)100152±9＜0.00251039±11＜0.000510037±9＜0.0005N＝6±SD用同样肽B处理后4小时，也发现减少到ccl4中毒后48小时的对照中有丝分裂速度的大约50%。
给每只动物肽的有丝分裂速度占对照的%Ppmole0(control)100190±131049±10＜0.02510074±12N＝3±SD在体外试验中，在给肽后72小时，这个肽B减少细胞总数大约为对照的70%。这如下表所示
肽浓度细胞总数占对照的%PLogm0(对照)100-1479±6＜0.005-1171±5＜0.0025-880±7＜0.025N＝6±SD为测定化合物B对恶性肝癌细胞株的活性，应用四组(每组8只)动物做体内试验，将预先测定数量的恶性细胞做静脉注射，然后这些动物用三个不同浓度的化合物B处理。
在该试验中，测定了已转移蔓延至肺，在治疗组观察到极大减少。
实验给30天的布法罗(Bufflo)雌性大鼠注射肽后，立即在尾静脉注射104大鼠肝癌细胞(MH1C1)。在实验期间，大鼠每周腹膜注射3次肽(总的注射12次)。实验开始后四周，将含有由于注射的肝癌细胞产生转移灶的肺称重(湿重)。
结果肽B减少肺重(肺+转移灶)大约为对照的40%。在减去正常的肺重时，肿瘤团块的减少则更大。该试验在下表中说明
每只动物给肽B的肺重加转移灶Ppmole占对照的%0(cntrol)100255±37＜0.012054±24＜0.00520042±8＜0.0005N＝B±SD当考虑正常肺组织重量由总重减掉时，发现的肿瘤重量计为对照百分数(%)列于下表肽B，每只动的Pmole瘤重，为对照的%245204320029鉴于以上叙述的性质，式Ⅰ中的新五肽特别适宜治疗肝癌，並可与非肠道给药的相似配方合并使用。适宜的剂量将取决于实际上用的肽、病人、给药途径和成分组成形式。然而，上面例子中所用剂量说明是恰当的。
式Ⅰ中肽的制备进一步阐明如下根据Merrifield的固相法制备了这些肽。已知量的树脂载体放于反应器内，与150mL以下的溶剂按给定的顺序混合。如果没有另外说明，所有洗涤只进行一分钟。所有使用的氨基酸都是L-构型。Asn是β-Asn。
1.二氯甲烷-三次2.在二氯甲烷中40%的三氟醋酸3.在二氯甲烷中40%的三氟醋酸-30分钟-一次。
4.二氯甲烷-一次，5.乙醇一次6.二氯甲烷-二次7.在二氯甲烷中10%三乙胺-一次，8.在二氯甲烷中10%三乙胺-10分钟-一次，9.二氯甲烷-三次10.与氨基酸偶联每一个氨基酸依次偶联，起始于羧基末端氨基酸。等当量的BOC氨基酸和DCC过量的加到所使用的树脂上。在每一个偶联后，为弄清反应完成情况，通过凯色(Kaiser)试验测定树脂。用40%TFA进行去保护，这也通过凯色(Kaiser)试验来控制。当最后一个氨基酸成功的偶联时，就认为合成已完成。在合成PGIu-GIn-GIy-Ser-Asn中使用的起始原料1.对一甲基二苯甲基胺树脂，
2.BOC-Asn-α-O-苄基3.BOC-Ser(BzI)4.BOC-GIy5.BOC-GIn(Xan)6.P-GIu在合成PGIu-GIu-GIy-Ser-Asn，用BOC-GIu(OcHeX)代替BOC-GIn(Xan)，在合成PGIu-GIn-GIy-Ser-ASP中的原料1.BOC-ASP(OBzl)-树脂2.BOC-Ser(Bzl)3.BOC-GIy4.BOC-GIn(Xan)5.PGIu为制备PGIu-GIu-GIy-Ser-ASP，用BOC-GIu(OCHeX)代替BOC-GIn(Xan)，HF-裂解将连接于树脂的肽放入聚三氟氯乙烯容器内並冷至0℃。加入茴香醚做为净化剂並把液态氟化氢引入反应系统与这种树脂混合45分钟。按厂商规定的标准步骤完成后，氟化氢真空挥发掉。树脂用乙醚提取除去净化剂及亲脂性副产物。粗产物肽被提取到醋酸和水中。
纯化上述肽类的纯化如下进行1.敞口玻璃柱用C-18树脂填装用乙腈洗脱。
2.用含0.1%TFA的缓冲液A500-1000mL预处理柱子。
3.溶解肽並加到柱子顶端4.在40分钟内，线性梯度由0%B-缓冲液开始至100%B-缓冲液，缓冲液B是在缓冲液A中含60%乙腈。
5.用TLC检测肽、续进行高压液相层析(HPLC)，收集最纯部分並冷冻干燥。
解释DCC＝二环己基碳二亚胺Bzl＝苄基Xan＝呫吨基TFA＝三氟醋酸OCHeX＝环己氧基BOC＝叔-丁氧羰基EEDQ＝N-乙氧羰基-2-乙氧基-1-二氢喹啉BOP＝苯并三唑基-1-基-氧代-三-(二甲胺基)鏻六氟磷酸酯分析1)PGIu-GIn-GIy-Ser-Asn分子量514.44薄层析;
硅胶Fm(nBuOH∶Pyr∶HOAC∶H2O15∶15∶3∶12)联-隣甲苯胺结果主要斑点与较低斑点明显不同，较上的斑点可忽略。Rf＝0.28
硅胶1∶1∶1∶1(nBuOH∶EtoAc∶HOAC∶H2O)联-隣-甲苯胺结果主要斑点与一个可忽略的上斑点和一个可忽略的下斑点。
Rf＝0.22电泳瓦特曼纸(Whatman)3MM，PH3.5(PyrCH3COCH3);1500V.1h.联-隣-甲苯胺。
结果向阳极移动的主要斑点与可忽略的较低的斑点。
Rf＝0.25以苦味酸为参考氨基酸分析肽的百分含量91.1%理论值实验值Asp11.09Ser10.92Glu22.01Gly10.982)PGIu-GIu-GIy-Ser-Asn的分析分子量516.42薄层析硅胶Fm(nBOH∶Pyr∶HOAC∶H2O，15∶15∶3∶12)联-隣-甲苯胺硅胶1∶1∶1∶1(nBuOH∶EtOAC∶HOAC∶H2O)联-隣-甲苯胺结果Fm主要斑点与可忽略的较低的斑点Rf＝0.441∶1∶1∶1主要斑点与可忽略的较低斑点Rf＝0.39电泳瓦特曼纸(Whatman)3MM，PH1.9(HCOOH∶CH3COCH3);1000V.1h联-隣甲苯胺结果单斑点移行至阳极Rf＝0.40以苦味酸为参比氨基酸分析肽的百分含量90.1%理论值实验值Asp10.94Ser10.95Glu22.08Gly10.983)PGIu-GIn-GIy-Ser-Asp分析分子量516.19薄层析硅胶Fm(nBuOH∶Pyr∶HOAC∶H2O，15∶15∶3∶12)联-隣-甲苯胺结果主要斑点与弱的上斑点和可忽略的较下斑点Rf＝0.27硅胶1∶1∶1∶1(nBuOH∶EtOAC∶HOAC∶H2O)联-隣-甲苯胺结果主要斑点与可忽略的较上斑点和可忽略的较下斑点
Rf＝0.32氨基酸分析肽的百分含量87.4%理论值实验值Asp10.98Ser10.91Glu22.06Gly10.974)PGIu-GIu-GIy-Ser-Asp分析分子量517.18薄层分析硅胶Fm(nBuOH∶Pyr∶HOAC∶H2O，15∶15∶3∶12)联-隣-甲苯胺结果主要斑点与可忽略的较上斑点和可忽略的较下斑点Rf＝0.22硅胶1∶1∶1∶1(nBuOH∶EtOAC∶HOAC∶H2O)联-隣-甲苯胺结果主要斑点与可忽略的较下斑点、Rf＝0.34氨基酸分析肽的百分含量90.7%理论值实验值Asp11.00Ser10.89Glu22.04Gly10.96
PGIu-GIu-GIy-Ser-ASP上述五肽在溶液中用活性酯法制备，伴有最少量纯的保护的中间体。
反应剂AsP(OBzl)2BOC-Ser(Bzl)-OSuBOC-GIy-OSuBOC-GIu(r-OBzl)-OSuCbz-PGlu全是市售的化合物Boc-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)2∶(A)Boc-Ser(Bzl)-Osu(12eg)溶于极小量DMF中，滴加到搅拌的Asp(OBzl)2(1eg)在极小量DMF的溶液中。反应通过TLC/茚三酮检测。阴性茚三酮试验说明总的氨基化合的消耗情况。
溶剂被真空蒸发残渣渗于CH2Cl2並用以下溶液提取0.05N H2SO4(2×)1MNaHCO3(2×)盐水(1×)H2O (1×)经过MgSO4干燥后，过滤並真空挥发除去溶剂，残渣溶于极少量CH2Cl2，用乙醚/石油醚研磨並放于+4℃过夜。收集沉淀，用冷乙醚/石油醚洗涤，真空干燥。
粗产率95%。
Ser(Bzl)-Bsp(OBzl)2＊TFA(B)将粗产物A溶于冰冷却的CH2Cl2中，用等体积的TFA稀释。用TLC检测反应。30分钟后，真空挥发除去溶剂，残渣再悬浮于CH2Cl2中，然后真空挥发至干。粗产物的使用不用进一步纯化。
BOC-Gly-Ser(Bzl)-ASP(OBzl)2(C)在搅拌下，将溶于极少量DMF中的BOC-Gly-OSu(1.2eg)滴加到B(1eg)和NEM(1eg)在极少量DMF的溶液中。反应用用TLC/茚三酮检测。2小时后，再加0.2eg的BOC-Gly-OSu，搅拌继续至过夜。
TLC检测反应混合物茚三酮阴性时，粗产物像A一样相同的步骤进行处理。用乙醚/石油醚研磨以后，粗产物不用进一步纯制而使用。
粗产率85%Gly-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)2＊TFA(D)粗产物C用冰冷却的CH2Cl2/TFA1∶1溶液处理30分钟，TLC表明C完全消耗。真空挥发除去溶剂;将残渣再溶于甲醇，真空挥发掉溶剂至干，粗产物D不用进一步纯化而使用。
BOC-Glu(γ-OBzl)-Gly-Ser(Bzl)Asp(OBzl)2(E)在搅拌下，把溶于极少量DMF中的BOC-Glu(γ-OBzl)-OSu(1.3eg)加到D(1eg)和NEM(1eg)在极少量DMF的溶液中。反应用TLC/茚三酮检测。
真空挥发除掉溶剂，粗产物用像对A叙述的步骤进行操作。
粗产率90%粗产物不必进一步纯化而使用。
Glu(γ-OBzl)Gly-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)2＊TFA(F)粗产物E用冰冷的CH2Cl2/TFA1∶1溶液处理30分钟，TLC表明E完全消耗。真空挥发掉溶剂;残渣再溶于甲醇，真空挥发至干。粗产物F不必进一步纯化而使用。
Cbz-PGlu-Glu(γ-OBzl)-Gly-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)2(G)把溶于极少量DMF中的Cbz-PGlu-Osu(1.3eg)滴加到F(1eg)和NEM(1eg)在极少量DMF的溶液中，用TLC/茚三酮检测反应，搅拌继续过夜。
溶剂被真空挥发，粗产物像对A叙述的那样进行处理。粗产物通过闪层析，以CHCl3/MeOH为溶剂来纯化。
由A所得总收率33%PGlu-Glu-Gly-Ser-Asp(H)将纯产物G溶于MeOH，然后加10%Pd/C和甲酸铵(5eg)。用TLC检测反应，45分钟后，原料被总消耗掉，TLC在UV254是阴性。过滤除去催化剂，真空挥发除去溶剂。冷冻干燥除去甲酸铵。像化合物4一样纯化和鉴定粗产物。
另外的说明DMF＝二甲基甲酰胺Cbz＝苄氧羰基
Su＝琥珀酰亚胺基NEM＝N-乙基吗啉
权利要求
1.新五肽，其特征为有如下通式
其中Z是CH2或CO，Y是H或OH，以及X1，X2和X3每一个都是独立的OH或NH2，如果X2和X3两者不都是氨基。
2.根据权利要求1中的五肽，其特征为Z是CO，Y是OH，X1是OH，X2是NH2及X3是OH。
3.根据权利要求1中的五肽，其特征为Z是CO，Y是OH，X1是OH，X2是OH及X3是OH。
4.抑制肝细胞不受控制生长的组合物;其特征为，下式化合物为活性成份。
其中Z是CH2或CO，Y是H或OH，以及X1，X2和X3每一个是独立的OH或NH2，如果X2和X3两者不都是NH2
5.根据权利要求4的组合物其特征为，含式Ⅰ的化合物，其中Z是CO，Y是OH，X1是OH，X2是NH2以及X3是OH。
6.根据权利要求4的组合物，其特征为，含式Ⅰ的化合物，其中Z是CO，Y是OH，X1是OH，X2是OH以及X3是OH。
7.抑制不受控制的肝细胞生长的方法，其特征有服用下式的五肽，
其中Z是CH2或CO，Y是H或OH，以及X1，X2和X3每一个都是独立的OH或NH2，假如X2和X3两者不都是NH2
8.根据权利要求7的方法，其特征为五肽为式Ⅰ，其中Z是CO，Y是OH，X1是OH，X2是OH或NH2以及X3是OH。
9.制备下式中五肽的方法，
其中Z是CH2或CO，Y是H或OH，以及X1，X2和X3每一个独立的是OH或NH2，其条件是X2和X3两者不都是NH2，其特征为，其保护的衍生物被去保护。
10.根据权利要求9的方法，其特征为在保护形式上可任意选择的五肽通过固相肽合成法来制备，其中C-末端氨基酸首先被连接于固体支撑物，随后的氨基酸按要求的顺序偶联，以及保护基被除掉。
全文摘要
具有通式的新五肽
文档编号A61K38/08GK1041158SQ8910706
公开日1990年4月11日 申请日期1989年9月11日 优先权日1988年9月13日
发明者卡尔-鲁得维格·雷切尔特, 杰·埃利克·鲍尔森 申请人:哈夫思伦·尼卡姆德·比奥里公司