专利名称：新的3，3′-联硫基二(丙酸)及其酯的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的具有免疫调节活性的胱氨酸衍生物、它们的制备方法、含有它们的药物组合物及它们的药用方法。
本发明的目的是提供具有免疫调节活性的胱氨酸衍生物。这类物质可用于治疗各种疾病。
N-乙酰基-L-半胱氨酸是一种广泛用于治疗慢性障碍性气管疾病/慢性支气管炎的化合物(进一步参见Multicentre Study Group，长期口服乙酰半胱氨酸治疗慢性支气管炎双盲对照试验，Eur.J.Pespir.Dis.1980，61(Suppl.111)，93-108;Boman，G.，B
cker，U.，Larsson，S.，Melander，B.，和W
hlander，L.，口服乙酰半胱氨酸降低慢性支气管炎的加重速率瑞典肺病协会组织的试验结果报道，Eur.J.Pespir.Dis.1983，64，405-415;以及British Thoracic Society Research Committee，慢性支气管炎和严重气管障碍疾病患者口服N-乙酰基半胱氨酸和疾病的加重速率，Thorax 1985，40，832-835)。该化合物的作用机理尚未公开;该化合物的作用已归因于粘液溶解性质(参见Multicentre Study Group，长期口服乙酰半胱氨酸治疗慢性支气管炎双盲对照试验，Eur.J.Pespir.Dis.1980，61(Suppl.111)，93-108;Boman，G.，B
cker，U.，Larsson，S.，Melander，B.，和W
hlander，L.，口服乙酰半胱氨酸降低慢性支气管炎的加重速率;瑞典肺病协会组织的试验结果报道，Eur.J.Pespir.Dis.1983，64，405-415;以及British Thoracic Society Research Committee，慢性支气管炎和严重气管障碍疾病患者口服N-乙酰基半胱氨酸和疾病的加重速率，Thorax 1985，40，832-835);抗氧化性质(参见Aruoma，O.I.，Halliwell，B.，Hoey，B.M.，和Butler，J.Free Radical Biol.Med.1989，6，593-597)和免疫调节性质(参见Bergstrand，H.，Bj
rnson，A.，Eklund，A.，Hernbrand，R.，Eklund，A.，Larsson，K.，Linden，M.，和Nilsson，A.，Stimuli-induced superoxide radical generation in vitro by human alveolar mac-rophages from smokersModulation by N-Acetylcysteine treatment in vivo.J.Free Radicals Biol.& Med.2，1986，119-127)。
N，N′-二乙酰基-L-胱氨酸也是已知的。该化合物在专利文献和科学文献中早已进行过简短的描述(US 4827016;EP 300100;US 4724239;US 4708965;DE 2326444;Wilson，I.D.，和Nicholson，J.K.，含硫药物及有关的有机化合物中硫醇和二硫化物的分析。化学、生化和毒性(ed L.A.Damani)Vol.2A.Analytical，Biochemical and toxicological aspects of sulphur xenobiochemistry.Ellis Horwood Series in Biochemical Pharmacology(Halstred Pressa division of John Wiley & Sons)chichester 1989，p.45;以及Sj
din，K.，Nilsson，E.，Hallberg，A.，和Tunek，A.，N-乙酰基-L-半胱氨酸的代谢脱乙酰化的一些结构要求和口服生物利用度的结果，Biochem.Pharmacol.1989，38，3981-3985)。在US4827016中，要求保护该化合物，该化合物对于由白三烯诱导和传播的皮炎的局部治疗是有效的。然而，就其与免疫系统和肺部炎症如慢性支气管炎有关的药理和/或治疗性质而言尚未见有报道或为人们一般所知。
先有技术中，已经报道了简单的二硫化物如羟乙基二硫化物的免疫刺激性质(HEDS，参见St.Georgiev，V.New synthetic immuno-modulating agents.Trends in Pharmacological Science 1988，446-51)。
根据本发明，已发现式(Ⅰ)化合物或其生理上可接受的盐和/或立体化学异构体是免疫调节、特别是免疫刺激剂，
式中R为氢或-COR1，其中R1为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、异丙基、1-甲基丙基、叔丁基、3-甲基丁基或2-甲基丁基，R2为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、异丙基、1-甲基丙基、叔丁基、3-甲基丁基或2-甲基丁基，R3为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基，条件是，R1和R2不同时为甲基，并且当R3为氢时，R1和R2不同时为正丙基或正庚基。
因此，本发明化合物可用于治疗其中免疫系统产生或可能产生了缺陷和/或宿主失去或可能失去了防御能力的疾病。
这类疾病的实例有慢性支气管炎和其它气管炎症如哮喘和鼻炎，也可以是某些形式的自体免疫疾病如糖尿病和类风湿性关节炎和/或各种恶性疾病。可用所述化合物治疗HIV感染或全发性AIDS。也可用所述化合物治疗动脉粥样硬化疾病。
用于治疗上述疾病的本发明化合物的有效量(日剂量)为0.5-500mg，优选为5-50mg。
优选的上述式(Ⅰ)化合物是那些化合物，式中R为氢或-COR1，其中R1为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、异丙基、1-甲基丙基、叔丁基、3-甲基丁基或2-甲基丁基，R2为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、异丙基、1-甲基丙基、叔丁基、3-甲基丁基或2-甲基丁基，R3为氢、甲基或乙基，条件是，R1和R2不同时为甲基，并且当R3为氢时，R1和R2不同时为正丙基或正庚基。
优选的其中R3为氢的式(Ⅰ)化合物是其中R1和R2分别同时为异丙基和叔丁基的那些化合物。
优选的其中R3不为氢的上述式(Ⅰ)化合物为其中R1和R2含有3-7个碳原子的那些化合物。
特别地，优选的其中R3不为氢的上述式(Ⅰ)化合物是那些化合物。其中R1和R2为异丙基，R3为甲基;R1和R2为正戊基，R3为甲基;R1和R2为正庚基，R3为甲基或乙基。
特别优选的本发明化合物的立体异构形式是L-异构体，即从L-胱氨酸衍生得到的化合物。其中R3为氢的式(Ⅰ)化合物的生理上可接受的盐有，例如，钠盐、铵盐、钙盐或镁盐以及其无毒的酸加成盐。也包括由下列化合物衍生得到的盐精氨酸、赖氨酸、组氨酸、乙醇胺、二乙醇胺、乙二胺和胆碱，或其它合适的有机胺。
其中R3为为氢而R为氢的式(Ⅰ)化合物的生理上可接受的盐有盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸氢盐、草酸盐、酒石酸盐等。所述盐也可以是溶剂化物如水合物形式。
所述的活性物质可以包括在各种剂型如片剂、包衣片剂、胶囊、溶液和气雾剂中。
为了制备片剂、包衣片剂和胶囊，可将活性物质与下述例举的可药用物质结合乳糖、淀粉、磷酸二钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素衍生物、胶态二氧化硅、滑石粉和硬脂酸或其盐。
制备口服液时，合适的赋形剂有水、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、果糖和木糖醇。
除了上述赋形剂外，剂型中还可以包含防腐剂、稳定剂、粘度调节剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、强度调节剂、缓冲剂或抗氧化剂。它们也可以包含其它有治疗价值的物质。
本发明化合物可以通过下列任意一种方法获得A.将下式的N-酰基半胱氨酸衍生物或当R3为氢时其任意的盐氧化，
式中R1和R3如上定义，形成下式化合物，
作为氧化剂，可以使用的是过氧化氢、碱性条件下的空气、烷基过氧化氢、过酸、卤素、氧化亚氮或氧化氮、氧化金属如铊(Ⅲ)、三烃基锍盐、或硒或碲氧化物。该氧化反应也可以通过电化学方法进行。卤素为例如氯、溴或碘。作为方法A和下述方法中的盐，可使用的是钠、钾、钙、铵等。
B.在合适的碱存在下，使下式化合物或其盐，
式中R3如上定义，与下式化合物反应，R1-COX式中R1如上定义，COX为在形成酰胺的条件下能与氨基反应的活性基团，形成了下式化合物，
酰化剂R1COX可以是例如酰卤、酸酐、酰胺、活化的酸或酯。
方法B和下述使用盐的任何方法中的盐可以是盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸氢盐、草酸盐、酒石酸盐等。方法B中的盐也可以是方法A中所提到的任何碱盐。
C.在碱存在下，使下式的2-(N-酰基氨基)-3-卤代丙酸衍生物与硫或二硫化物二价阴离子反应，
式中R1如上定义，R31为上述定义的R3或对酸或碱不稳定的有机基团，Y为卤素原子，形成下式化合物，
然后，如果想得到其中R3为氢的化合物，那么脱除保护基R31。
保护基R31可以是对酸或碱不稳定的有机基团例如烷基、苄基、芳基、乙烯基或烯丙基。
D.对下二式所示的N-酰基半胱氨酸衍生物或当R3为氢时的其任意的碱盐的混合物进行氧化，
式中R1、R2和R3如上定义，形成下式化合物，
可以使用方法A中的氧化剂。
E.对下二式所示的半胱氨酸或半胱氨酸酯或它们的盐和N-酰基半胱氨酸衍生物或它们的碱盐的混合物进行氧化，
式中R1和R3如上定义，形成下式化合物或其盐，
可以使用方法A中的氧化剂。
F.在合适的碱存在下，使过量的下式所示的胱氨酸或胱氨酸二酯或其盐与其中R2和COX如上定义的式R2-COX化合物反应，
式中R3如上定义，形成下式化合物，
G.在合适的碱存在下，使下式化合物或其盐与其中R2和COX如上定义的式R2-COX化合物反应，
式中R1和R3如上定义，形成下式化合物，
H.使下式的N-酰基半胱氨酸衍生物或其盐与活化剂如偶氮二羧酸二乙酯反应，
得到例如下式所示的加合物，
接着与第二种不同的或相同的N-酰基半胱氨酸或N-酰基半胱氨酸酯反应，得到下式化合物，
I.使下式化合物，
其中R4为
R1和R31如上定义，与下式化合物反应，
式中R2和R31如上定义，形成下式化合物，
然后，如果需要其中R3为氢的化合物，则脱除保护基R31。
J.用其中R3E为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基的式R3E-OH化合物对下式化合物进行酯化，
式中R和R2如上定义，X1为OH或卤素原子，形成下式化合物，
K.用其中R3E如上定义而Z为卤化物、烷基硫酸酯、甲苯磺酸酯或另一种离核试剂的式R3E-Z化合物对下式化合物进行烷基化，
式中R和R2如上定义，形成下式化合物，
L.在合适的碱存在下，使下式的羧基被护的胱氨酸衍生物或其盐酸盐与其中R1如上定义而COX为在形成酰胺的条件下能与氨基反应的活性基团的式R1-COX化合物反应，
式中R3P为对酸或碱不稳定的有机基团，然后，脱除保护基R3P，形成下式化合物，
酰化剂R1COX如在方法B中所定义。保护基R3P可以是对酸或碱不稳定的有机基团例如烷基、苄基、芳基、乙烯基或烯丙基。
M.在碱性条件下，使下式的羧基被护的胱氨酸衍生物或其盐酸盐与其中R2和COX如上定义的式R2-COX化合物反应，
式中R3P如上定义，然后，脱除保护基R3P，形成下式化合物，
N.使下式的羧基被护的胱氨酸衍生物或其盐酸盐与其中R1和COX如上定义的式R1-COX化合物反应，
式中R2和R3P如上定义，
然后，脱除保护基R3P，形成下式化合物，
O.在醇或水溶液中使下二式的胱氨酸衍生物和半胱氨酸衍生物或其碱盐的混合物进行平衡，
式中R1和R2如上定义，形成下式化合物，
在所有方法A-O中的一个任选步骤是，将所得化合物转化成生理上可接受的盐。
实施例1(R，R)-N，N′-二戊酰基-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯对L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐(1.0g，3mmol)在THF(20ml)中的悬浮液(白色淤浆)进行搅拌，并将其冷却至0℃，向反应混合物中加入4当量(2.0ml)N-乙基二异丙基胺和2.2当量(0.8ml，6.6mmol)的戊酰氯。将混合物在冰浴上搅拌4小时，然后过滤除去氯化N-乙基二异丙基铵白色沉淀。蒸发除去溶剂，粗产物重新溶于二氯甲烷中，用水洗涤后，用硫酸钠干燥有机相。过滤后蒸发溶剂，得到标题产物粗品，用乙酸乙酯重结晶。物理数据如下1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.42(2H，d，NH)，4.88(2H，dt，NCH)，3.77(6H，s，OCH3)，3.21(4H，m，SCH2)，2.27(4H，t，COCH2)，1.63(4H，m，CH3CH2CH2)，1.36(4H，m，CH3CH2)，0.92(6H，t，CH3).α25D＝-146°(C＝0，490，MeOH).Mp＝110-112℃.分析计算值 C18H32O6N2S2C，49.52;H，7.39;N，6.42;S，14.69.实验值C，49.40;H，7.40;N，6.40;S，14.70.
实施例2(R，R)-N，N′-二丙酰基-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯用丙酰氯作为酰化剂，按照实施例1中所述步骤，制备该化合物。物理数据如下1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.44(2H，d，NH)，4.89(2H，dt，NCH)，3.78(6H，s，OCH3)，3.22(4H，m，SCH2)，2.31(4H，q，CH3CH2CH2)，1.18(6H，t，CH3).
实施例3(R，R)-N，N′-二戊酰基-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二乙酯从L-胱氨酸二乙酯二盐酸盐开始，用戊酰氯作为酰化剂，按照实施例1中所述步骤，制备该化合物。物理数据如下1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.43(2H，d，NH)，4.85(2H，dt，NCH)，4.23(4H，m，OCH2)，3.22(4H，m，SCH2)，2.27(4H，t，COCH2)，1.63(6H，m，CH3CH2CH2)，1.37(4H，m，CH3CH2)，1.30(6H，t，OCH2CH3，0.92(6H，t，CH3).α28D＝-130°(C＝0.514，MeOH).Mp＝109℃.分析计算值 C20H36O6N2S2C，51.70;H，7.81;N，6.03;S，13.80.实验值C，51.85;H，7.75;N，6.10;S，13.60.
实施例4(R，R)-N，N′-二丙酰基-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二乙酯从L-胱氨酸二乙酯二盐酸盐开始，用丙酰氯作为酰化剂，按照实施例1中所述的步骤，制备该化合物。
物理数据1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.44(2H，d，NH)，4.86(2H，dt，NCH)，4.23(4H，m，OCH2)，3.22(4H，m，SCH2)，2.31(4H，q，COCH2)，1.30(6H，t，CO2CH2CH3，1.18(6H，t，CH3).
实施例5(R，R)-N，N′-二己酰基-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二乙酯从L-胱氨酸二乙酯二盐酸盐开始，用己酰氯作为酰化剂，按照实施例1中所述的步骤，制备该化合物。
物理数据1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.44(2H，d，NH)，4.86(2H，dt，NCH)，4.23(4H，m，OCH2)，3.21(4H，m，SCH2)，2.26(4H，t，COCH2)，1.65(4H，m，COCH2CH2)，1.31(4H，m，CH3CH2CH2，1.31(4H，m，CH3CH2)，1.31(6H，t，OCH2CH3)，0.90(6H，t，CH3).
实施例6(R，R)-N，N′-二(2-甲基丙酰基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二乙酯从L-胱氨酸二乙酯二盐酸盐开始，用2-甲基丙酰氯作为酰化剂，按照实施例1中所述的步骤，制备该化合物。
物理数据1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.42(2H，d，NH)，4.84(2H，dt，NCH)，4.23(4H，m，OCH2)，3.22(4H，m，SCH2)，2.46(2H，m，(CH3)2CH)，1.30(6H，t，OCH2CH3)，1.18(12H，d，(CH3)2).α25D＝-127°(C＝0，512，MeOH).Mp＝140-141℃.分析计算值 C18H32O6N2S2C，49.52;H，7.39;N，6.42;S，14.69.实验值C，49.15;H，7.40;N，6.30;S，14.75.
实施例7(R，R)-N，N′-二(1-氧代-十二烷基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯从(R，R)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯二盐酸盐开始，用十二烷酰氯作为酰化剂，按照实施例1中所述步骤，制备该化合物。
总收率40%
物理数据Mp＝98-99℃.[α]25D＝-93°(c＝0.531，MeOH).1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.42(2H，d，NH)4.88(2H，dt，NCH)3.77(6H，s，OCH3)3.21(4H，m，SCH2)2.26(4H，t，OCH2)，1.64(4H，m，OCH2CH2)，1.26(32H，m，(CH2)8)，0.88(6H，t，CH2CH3).分析计算值 C32H60N2O6S2C，60.72;H，9.56;N，4.43;S，10.13.
实验值C，60.4;H，9.3;N，4.5;S 10.1实施例8(S，S)-N，N′-二(2-甲基丙酰基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯将N，N′-二异丁酰基-D-胱氨酸(1.86g，4.9mmol)溶于含有1滴盐酸的10ml甲醇中。加入原甲酸三甲酯(0.6ml，5.5mmol)，将反应混合物于室温下搅拌4天。蒸发溶剂后，用柱层析(洗脱剂∶庚烷/乙酸乙酯1∶5)纯化产物。
物理数据Mp 145.5-147.5℃.1H-NMR(300MHz CDCl3)δ6.39(2H，d，NH)4.86(2H，dt，NCH)3.78(6H，s，OCH3)3.21(4H，m，SCH2)2.47(2H，h，CH(CH3)2)1.18(12H，d，CH(CH3)2.[α]25D＝+135，2(C＝0.42，MeOH)实施例9(R，R)-N，N′-二己酰基-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯用己酰氯作为酰化剂，按照实施例1中所述的步骤，制备该化合物。
物理数据
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.41(2H，d，NH)，4.88(2H，dt，NCH)，3.76(6H，s，OCH3)，3.21(4H，m，SCH2)，2.26(4H，t，COCH2)，1.65(4H，q，CH3CH2CH2CH2)，1.33(4H，m，CH3CH2，1.33(4H，m，CH3CH2)，0.89(6H，t，CH3).α25D＝-135°(C＝0，486，MeOH).Mp＝90-92℃。分析计算值 C20H36N2O6S2C，51.70;H，7.81;N，6.03;S，13.80.实验值C，51.90;H，7.95;N，6.10;S，13.75.
实施例10(R，R)-N，N′-二(1-氧代-辛基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯用辛酰氯作为酰化剂，按照实施例1中所述的步骤，制备该化合物。
物理数据1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.41(2H，d，NH)，4.88(2H，dt，NCH)，3.77(6H，s，OCH3)，3.21(4H，m，SCH2)，2.26(4H，t，COCH2)，1.65(4H，t，COCH2CH2)，1.29(16H，m，CH3(CH2)1-4)，0.88(6H，t，CH2CH3).α25D＝-119°(C＝0，490，MeOH).Mp＝90-91°分析计算值 C24H44N2O6S2C，55.36;H，8.52;N，5.38;S，12.31.实验值C，54.80;H，8.45;N，5.35;S，11.80.
实施例11(R，R)-N，N′-二(1-氧代-辛基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二乙酯从L-胱氨酸二乙酯二盐酸盐开始，用辛酰氯作为酰化剂，按照实施例1中所述的步骤制备该化合物。
物理数据1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.43(2H，d，NH)，4.85(2H，dt，NCH)，4.23(4H，m，CH3CH2O)，3.21(4H，m，SCH2)，2.26(4H，t，COCH2)，1.65(4H，t，COCH2CH2)，1.30(6H，m，OCH2CH3)，1.30(16H，m，CH3(CH2)1-4)，0.88(6H，t，CH2CH3).
实施例12(R，R)-N，N′-二(2，2-二甲基丙酰基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二乙酯从L-胱氨酸二乙酯二盐酸盐开始，用2，2-二甲基丙酰氯作为酰化剂，按照实施例1中所述的步骤制备该化合物。
物理数据1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.52(2H，d，NH)，4.80(2H，dt，NCH)，4.22(4H，m，CH3CH2O)，3.22(4H，m，SCH2)，1.30(6H，t，OCH2CH3)，1.23(18H，s，C(CH3)3).
实施例13(R，R)-N，N′-二(2，2-二甲基丙酰基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯用2，2-二甲基丙酰氯作为酰化剂，按照实施例1中所述的步骤制备该化合物。
物理数据1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.51(2H，d，NH)，4.83(2H，dt，NCH)，3.78(6H，s，OCH3)，3.21(4H，m，SCH2)，1.23(18H，s，C(CH3)3).
实施例14(R，R)-N，N′-二(2-甲基丙酰基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯用2-甲基丙酰氯代替戊酰氯，按照实施例1中所述的步骤制备该化合物。
物理数据
Mp142-5℃.δ6.40(2H，d，NH)，4.86(2H，dt，NCH)，3.78(6H，s，OCH3)，3.21(4H，m，SCH2)，2.47(2H，h，CH(CH3)2)，1.18(12H，d，CH(CH3)2).
实施例15(R，R)-N-乙酰基-N′-己酰基-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯在100ml圆底烧瓶中，将(R，R)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯二盐酸盐(690mg，2mmol)与1.39ml(10mmol)三乙胺一起在20ml THF中进行搅拌。在冰浴上将混浊溶液冷却至0℃，然后滴加乙酰氯(142μl，2mmol)和己酰氯(276μl，2mmol)在3ml THF中的溶液。将混浊液于0℃下搅拌1小时。滤掉1g(100%)Et3NHCl白色沉淀，蒸发滤液，得到油状残留物，将其在10ml H2O和10ml CHCl3之间分配。分相后，水相用3×10ml CHCl3提取。蒸发合并的CHCl3相后，按照Still等人(J.Org.Chem.，1978，43，2923)方法进行硅胶60(E.Merck 5735，230-400目ASTM)闪层析，用EtOAc/庚烷/MeOH6∶3∶1进行洗脱来分离粗产物(含有所需产物和对称衍生物)。通过薄层层析(塑料片载硅胶60WF 254s，E.Merck 16483，用EtOAc/庚烷/MeOH6∶3∶1作为洗脱剂，I2作为显色剂)检测分离情况。收集具有可接受纯度的洗脱部分，蒸发后得到油状残留物。将该残留物溶于丙酮中，再次蒸发该溶液，得到无色固体状的标题产物。
收率184mg，25%。
物理数据
TLCRf＝0.30(EtOAc/庚烷/MeOH＝6/3/1).
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.53(1H，d，NH)，6.43(1H，d，NH)，4.88(2H，m，NCH)，3.78(6H，s，CO2CH3)，3.22(4H，m，SCH2)，2.26(2H，t，COCH2)，2.07(3H，s，COCH3)，1.65(2H，m，CH2)，1.32(4H，m，CH2)，0.90(3H，t，CH3).FAB-MS(m/z)431[MNa]+，409[MH]+，311[MH-C7H11O]+.
实施例16(R，R)-N，N′-二(2-甲基丙酰基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)将N-异丁酰基-L-半胱氨酸(9.5g，50mmol)溶于50ml水中，加入过氧化氢(30%，3.1ml，30mmol)，然后将反应混合物于室温下搅拌6小时。减压蒸发溶剂后，得到白色带结晶的油状物(9.8g)。用乙酸乙酯重结晶，得到白色固状的标题化合物，进行真空干燥。
收率4.8g(50%).物理数据Mp.143-5℃;1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ(2H，b，CO2H)，8.16(2H，d，NH)，4.47(2H，m，CHN)，3.15(2H，dd，CH2S，J＝14Hz，5Hz)，2.92(2H，dd，CH2S，J＝14Hz，9Hz)，2.43(2H，h，CH(CH3)2，J＝7Hz)，1.01(12H，d，CH3，J＝7Hz).[δ]25d＝-169.8(MeOH，C＝0.510)实施例17(R，R)-N-乙酰基-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)将L-半胱氨酸(2.42g，20mmol)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(3.26g，20mmol)溶于25ml水中。用石蕊试纸检测，该溶液的pH值为2.6。加入过氧化氢水溶液(30%，2.3ml，21mmol)，将反应混合物于室温下放置过夜。滤出白色沉淀(1.26g)。通过与可信样品的光谱数据比较。表明该物质为L-胱氨酸。通过制备性HPLC分离淡黄色滤液(含有所需化合物和两个对称化合物(R，R)-N，N′-二乙酰基胱氨酸和(少量)胱氨酸)。该制备性HPLC使用Dynamax C18柱(8μm，60
，21.4×250mm)，它带有dynamax C18 guard柱(8μm，21.4×50mm)和Gilson复式溶剂排出系统(305泵，起溶剂排出泵作用的泵头100SC，起样品注射器作用的泵头5SC，806测压元件，811B动力混合器，115UV检测器，201馏分收集器，201-202馏分控制器)。所用溶剂为A＝10mM HOAc/H2O，B＝MeOH，A∶B＝95∶5。溶剂流速为10ml/分，在230nm处记录分离情况。对每一馏分用TLC(Merck 16483，塑料片载硅胶60WF 254s，展开剂n-BuOH/HOAc/H2O 1∶1∶1，I2作为显色剂)检测后，合并具有可接受纯度的各馏分，蒸发后得到油状残留物。将该残留物溶于丙酮(pa)中，蒸发溶液，得到白色结晶状的标题产物，收率10%。
物理数据TLCRf＝0.69(nBuOH/HOAc/H2O＝1/1/1).1H-NMR(300MHz，D2O)δ4.73(1H，dd，NCH)，4.18(1H，dd，NCH)，3.37(2H，m，SCH2)，3.10(2H，m，SCH2)，2.06(3H，s，CH3).TSP-MS(m/z)283[MH]+，164[MH-C3H5NO2]+.
实施例18(R，R)-N-乙酰基-N′-(2-甲基丙酰基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)将N-乙酰基-L-半胱氨酸(0.652g，4mmol)和N-异丁酰基-L-半胱氨酸(0.764g，4mmol)在10ml甲醇中的混合物进行搅拌，同时滴加过氧化氢(30%，0.60ml，5mmol)。在室温下继续搅拌3小时，然后在旋转蒸发器上除去溶剂。加入25ml丙酮，再次蒸发后，得到1.5g油状粗产物，放置后发生固化。如实施例17所述的那样，通过制备柱HPLC将所需标题化合物从所述混合物中分离出来，收率31%。
物理数据HPLC用60%A洗脱(isocratic，溶剂参见实施例17)TLCRf＝0.76(nBuOH/H2/HOAc＝1/1/1).1H-NMR(300MHz，D2O)δ4.73(2H，m，NCH)，3.33(2H，m，SCH2)，3.03(2H，m，SCH2)，2.59(1H，n，H)，2.06(3H，s，COH3)，1.13(3H，d，CH3)，1.11(3H，s，CH3).FAB-MS(m/z)376[MNa]+，353[MH]+.
实施例19(R，R)-N-(2-甲基丙酰基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)从L-半胱氨酸和N-异丁酰基-L-半胱氨酸开始，按照实施例17给出的步骤，制备该化合物。收率8%。
物理数据HPLC用55%A洗脱(isocratic，溶剂参见实施例17)TLCRf＝0.67nBuOH/H2O/HOAc＝1/1/1).1H-NMR(300MHz，D2O)δ4.73(1H，dd，NCH)，4.14(1H，dd，NCH)，3.38(2H，n，SCH2)，3.08(2H，m，SCH2)，2.06(1H，n，CH)，1.15(3H，d，CH3)，1.13(3H，d，CH3).TSP-MS(m/z)311[MH]+.
实施例20(R，R)-N-乙酰基-N′-(2，2-二甲基丙酰基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)从N-乙酰基-L-半胱氨酸和N-新戊酰基-L-半胱氨酸开始，按照实施例18给出的步骤，制得该化合物。收率21%。
物理数据HPLC洗脱梯度50% A/15min，50 30% A/5min，Rf＝0.78nBuOH/H2O/HOAc＝1/1/1).
1H-NMR(300MHz，D2O)δ4.72(2H，m，NCH)，3.35(2H，m，CH2)，3.04(2H，m，SCH2)，2.06(3H，s，CH3)，1.21(9H，s，CCH3).
FAB-MS(m/z)411[MNa2]+，389[MNa]+，367[MH]+，349[MH-H2O]+.
实施例21(R，R)-N，N′-二(2，2-二甲基丙酰基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)从实施例20的粗产物中分离该化合物，收率15%。
物理数据HPLC洗脱梯度50% A/15min，50 30% A/15min，30% A/isocratic(溶剂参见实施例17)。TLCRf＝0.88nBuOH/H2O/HOAc＝1/1/1).
1H-NMR(300MHz，D2O)δ4.72(2H，dd，NCH)，3.37(2H，dd，SCH2)，3.06(2H，dd，SCH2)，1.21(18H，s，CCH3).
FAB-MS(m/z)431[MNa]+，409[MH]+，391[MH-H2O]+.
实施例22(R，R)-N-乙酰基-N′-戊酰基-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)从N-乙酰基半胱氨酸和N-戊酰基半胱氨酸开始，如实施例18所述，制备该化合物。收率23%。
物理数据HPLC洗脱梯度50% A/20min，50 25% A/5 min，25% A/isocratic(溶剂参见实施例17)。TLCRf＝0.84n-BuOH/H2O/HOAc＝1/1/1).
1H-NMR(300MHz，D2O)δ4.70(2H，m，NCH)，3.30(2H，n，SCH2)，2.99(2H，m，SCH2)，2.30(2H，t，COCH2)，2.04(3H，s，COCH3)，1.57(2H，m，CH2)，1.30(2H，m，CH2)，0.86(3H，t，CH3).
FAB-MS(m/z)389[MNa]+，367[MH]+，349[MH-H2O]+.
实施例23(R，R)-N，N′-二己酰基-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)将1当量3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯二盐酸盐在四氢呋喃中的悬浮液(白色淤浆)进行搅拌，并冷却至0℃。向反应混合物中加入4当量N-乙基二异丙基胺和2.2当量己酰氯。将反应混合物在冰浴上搅拌4小时，滤出氯化N-乙基二异丙基铵白色沉淀。减压下蒸除溶剂，粗产物重新溶于二氯甲烷中。用水洗涤后，有机相用硫酸钠干燥。过滤后，蒸发溶剂，得到(R，R)-N，N′-二己酰基-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯粗品，将其用甲醇/水重结晶，然后与乙醚一起研制。
将上述形成的二甲酯和0.5M氢氧化钠在10%甲醇中的白色淤浆(0.1M)在室温下剧烈搅拌。大约48小时后，将清澈溶液的pH值调至2，滤出所形成的白色沉淀状的粗产物，用丙酮/己烷重结晶，得到白色结晶状的标题化合物。总收率28%。
物理数据Mp132-135℃。[α]25D-164°(c＝0.501，MeOH).1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ8.22(2H，d，NH)，4.49(2H，m，CHN)，3.14(2H，dd，CH2S)，2.91(2H，dd，CH2S)，2.12(4H，t，CH2CO)，1.50(4H，p，CH2CH2CO)，1.26(8H，m，(CH2)2)，0.87(6H，t，CH3).分析计算值 C18H32N2O6S2C，49.5;H，7.4;N，6.4;S，14.7.实验值C，49.4;H，7.2;N，6.2;S，14.3.
实施例24(R，R)-N，N′-二(1-氧代-辛基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)用辛酰氯作为酰化剂，按照实施例23中所述步骤，制备该化合物。
最初形成的(R，R)-N，N′-二(1-氧代-辛基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯用乙酸乙酯重结晶，然后将标题产物用丙酮/庚烷重结晶并与乙醚一起研制，得到白色晶体。总收率20%。
物理数据Mp105-107℃.[α]25D-147°(c＝0.541，MeOH).1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ8.18(2H，d，NH)，4.48(2H，m，CHN)，3.17(2H，dd，CH2S)，2.89(2H，dd，CH2S)，2.12(4H，t，CH2CO)，1.49(4H，m，CH2CH2CO)，1.26(16H，m，(CH2)4)，0.87(6H，t，CH3).分析计算值 C22H40N2O6S2C，53.6;H，8.2;N，5.7;S，13.0.实验值C，53.4;H，8.5;N，5.7;S，12.6.
实施例25(R，R)-N，N′-二(1-氧代-十二烷基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)用十二烷酰氯作为酰化剂，按照实施例23所述的步骤制备该化合物。水解在20%的甲醇中进行。
最初形成的(R，R)-N，N′-二(1-氧代-十二烷基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)二甲酯用乙酸乙酯重结晶。标题化合物用甲苯/二氯甲烷重结晶，得到白色结晶。
总收率23%物理数据Mp110-112℃。[α]25D-113°(c＝0.507，MeOH).1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ8.19(2H，d，NH)，4.48(2H，m，CHN)，3.15(2H，dd，CH2S)，2.89(2H，dd，CH2S)，2.11(4H，t，CH2CO)，1.49(4H，m，CH2CH2CO)，1.25(32H，m，(CH2)8)，0.87(6H，t，CH3).分析计算值 C30H56N2O6S2C，59.6;H，9.3;N，4.6;S，10.6.
实验值C，59.2;H，9.4;N，4.6;S，10.3.
实施例26(S，S)-N，N′-二(2-甲基丙酰基)-3，3′-联硫基二(2-氨基丙酸)在氮气气氛下，将碳酸钾(17.6g，127mmol)溶于40ml水和40ml二氯甲烷中。将该溶液冷却(-10℃)，快速加入2-甲基丙酰氯(5.6ml，40mmol)和D-半胱氨酸盐酸盐一水合物(8.7g，49.5mol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时，然后加入盐酸，使混合物的pH值调至用石蕊试纸测得小于1。弃去水层，向有机层中加入石油醚(40-60°)，N-异丁酰基-D-半胱氨酸作为白色结晶而沉出。
将N-异丁酰基-D-半胱氨酸(1g，5.2mmol)溶于10ml甲醇中。加入过氧化氢(30%，0.3ml，2.6mmol)，然后将反应混合物于室温下搅拌6小时。减压下蒸发溶剂后，得到白色带结晶的油状物。用乙酸乙酯重结晶后，得到标题化合物，白色固体，将其于真空下干燥。
收率0.55g(55%)物理数据Mp135-137℃。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.16(2H，d，NH)4.47(2H，m，CHN)3.15(2H，dd，CH2S，J＝14Hz，5Hz)2.93(2H，dd，CH2S，J＝14Hz，9Hz)2.43(2H，h，CH(CH3)2J＝7Hz)1.01(12H，d，CH3，J＝7Hz).25D＝+167.6(c＝0.516，MeOH).
实施例27制剂A每片含10mg活性物质的片剂活性物质 10mg乳糖 100mg马铃薯淀粉 50mg聚乙烯基吡咯烷酮 5mg微晶纤维素 15mg硬脂酸镁 1mg制剂B每片含5mg活性物质的直接压片
活性物质 5mg无水乳糖 150mg微晶纤维素 50mg胶态二氧化硅 1mg硬脂酸镁 2mg需要时，可用例如羟丙甲基纤维素、羟丙基纤维素或甲基丙烯酸二甲基氨基乙基酯-甲基丙烯酸酯共聚物对所得片进行膜包衣。
制剂C含1mg/ml活性物质的注射液活性物质 1.0mg氯化钠 8.8mg注射用水 加至1ml制剂D含1mg/ml活性物质的口服液活性物质 1.0mg山梨醇 150mg甘油 100mg乙二胺四乙酸二钠 0.5mg防腐剂 适量调味剂 适量纯水 加至1ml制剂E给出每剂1mg的粉状气雾剂可将微颗粒化的活性物质装入粉末吸入器装置如Turbuhaler
中，得到1mg/剂。
本发明化合物对小鼠延迟型过敏模型的作用本发明化合物刺激免疫反应的性质通过其对小鼠延迟型过敏(DTH)反应模型的作用效果进行说明。
使用体重为18-20g的雄性和雌性Balb/c小鼠，它们是从Bom-hotsgaard(丹麦)和Charlie Rivers(英国)得到。用从BDH(英国)买到的4-乙氧基亚甲基-2-苯基噁唑酮(OXA)作为该试验的抗原。
在第0天通过在刮掉毛的胸和腹部表皮施用150μl含3%OXA的无水乙醇-丙酮(3∶1)溶液使小鼠致敏。通过在致敏后立即口服，用试验化合物、DiNAC(作为阳性对照)或载体(磷酸盐缓冲液，pH7.0)进行处理，持续至第6天。致敏后七天(第6天)，通过在所有小鼠的两只耳朵的双侧局部施用20μl 1%OXA(溶于橄榄油中)诱发反应(challenge)。在诱发反应前以及诱发反应后24或48小时时用Oditest游标长尺测量耳朵厚度。诱发反应和测量过程都是在用戊巴比妥浅度麻醉下进行。DTH反应的强度用下式Tt24/48-Tt0μm单位表示，其中t0和t24/48分别代表每次试验(T)中诱发反应前以及诱发后24或48小时时耳朵厚度。结果表示为平均+/-S.E.M。通过学生双尾t-试验得到各组平均间的显著水平。表1给出了以相对于未诱发的对照耳朵的耳厚度的增加百分率表示的24和48小时测量的代表性结果。因此，数字100表示耳厚度增加一倍。
权利要求
1.式(Ⅰ)化合物或其生理上可接受的盐和/或其立体化学异构体，
式中R为氢或-COR1，其中R1为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、异丙基、1-甲基丙基、叔丁基、3-甲基丁基或2-甲基丁基，R2为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、异丙基、1-甲基丙基、叔丁基、3-甲基丁基或2-甲基丁基，R3为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基，条件是，R1和R2不同时为甲基，并且当R3为氢时，R1和R2不同时为正丙基或正庚基。
2.根据权利要求1的化合物，式中R为氢或-COR1，其中R1为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、异丙基、1-甲基丙基、叔丁基、3-甲基丁基或2-甲基丁基，R2为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、异丙基、1-甲基丙基、叔丁基、3-甲基丁基或2-甲基丁基，R3为氢、甲基或乙基，条件是，R1和R2不同时为甲基，并且当R3为氢时，R1和R2不同时为正丙基或正庚基。
3.根据权利要求1的化合物，其中R1和R2为异丙基，R3为甲基。
4.根据权利要求1的化合物，其中R1和R2为正戊基，R3为甲基。
5.根据权利要求1的化合物，其中R1和R2为正庚基，R3为甲基或乙基。
6.根据权利要求1的化合物，其中R1和R2同时为异丙基，R3为氢。
7.根据权利要求1的化合物，其中R1和R2同时为叔丁基，R3为氢。
8.权利要求1中定义的式(Ⅰ)化合物的制备方法，其特征在于a)将下式的N-酰基半胱氨酸衍生物或当R3为氢时其任意的碱盐氧化，
式中R1和R3如上定义，形成下式化合物，
或者b)在合适的碱存在下，使下式化合物或其盐，
式中R3如上定义，与下式化合物反应，R1-COX式中R1如上定义，COX为在形成酰胺的条件下能与氨基反应的活性基团，形成了下式化合物，
或者c)在碱存在下，使下式的2-(N-酰基氨基)-3-卤代丙酸衍生物与硫或二硫化物二价阴离子反应，
式中R1如上定义，R31为上述定义的R3或对酸或碱不稳定的有机基团，Y为卤素原子，形成下式化合物，
或者d)对下二式所示的N-酰基半胱氨酸酯衍生物或当R3为氢时的其任意的碱盐的混合物进行氧化，
式中R1、R2和R3如上定义，形成下式化合物，
或者e)对下二式所示的半胱氨酸或半胱氨酸酯或其盐和N-酰基半胱氨酸衍生物或其碱盐或盐酸盐的混合物进行氧化，
式中R1和R3如上定义，形成下式化合物或其盐，
或者f)在合适的碱存在下，使过量的下式所示的胱氨酸或胱氨酸二酯或其盐与其中R2和COX如上定义的式R2-COX化合物反应，
式中R3如上定义，形成下式化合物，
或者g)在合适的碱存在下，使下式化合物或其盐与其中R2和COX如上定义的式R2-COX化合物反应，
式中R1和R3如上定义，形成下式化合物，
h)使下式的N-酰基半胱氨酸衍生物或其盐与活化剂反应，
式中R1和R3如上定义，形成下式所示的加合物，
接着与第二种不同的或相同的N-酰基半胱氨酸或半胱氨酸酯衍生物反应，得到下式化合物，
i)使下式化合物，
其中R4为
R1和R31如上定义，与下式化合物反应，
式中R2和R31如上定义，形成下式化合物，
然后，如果需要其中R3为氢的化合物，则脱除保护基R31，或者j)用其中R3E为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基的式R3E-OH化合物对下式化合物进行酯化，
式中R和R2如上定义，X1为OH或卤素原子，形成下式化合物，
或者k)用其中R3E如上定义而Z为卤素、烷基硫酸酯、甲苯磺酸酯或另一种离核试剂的式R3E-Z化合物对下式化合物进行烷基化，
式中R和R2如上定义，形成下式化合物，
l)在合适的碱存在下，使下式的羧基被护的胱氨酸衍生物或其盐酸盐与其中R1如上定义而COX为在形成酰胺的条件下能与氨基反应的活性基团的式R1-COX化合物反应，
式中R3P为对酸或碱不稳定的有机基团，然后，脱除保护基R3P，形成下式化合物，
或者m)在碱性条件下，使下式的羧基被护的胱氨酸衍生物或其盐酸盐与其中R2和COX如上定义的式R2-COX化合物反应，
式中R3P如上定义，然后，脱除保护基R3P，形成下式化合物，
n)使下式的羧基被护的胱氨酸衍生物或其盐酸盐与其中R1和COX如上定义的式R1-COX化合物反应，
式中R2和R3P如上定义，然后，脱除保护基R3P，形成下式化合物，
o)在碱性含水溶液中使下二式的胱氨酸衍生物和半胱氨酸衍生物或其碱盐的混合物进行平衡，
式中R1和R2如上定义，形成下式化合物，
最后，需要时，将由a)-o)方法中任意一种得到的化合物转化成生理上可接受的盐。
9.一种药物组合物，其中包含权利要求1-7中任一项的化合物作为活性成分。
10.根据权利要求9的药物组合物，它为剂量单位形式。
11.根据权利要求9-10的药物组合物，其中包含活性成分和可药用载体。
12.权利要求1-7中任一项的化合物作为治疗活性物质的应用。
13.权利要求1-7中任一项的化合物在制备具有免疫调节作用的药物中的应用。
14.治疗哺乳动物(包括人)的免疫系统缺陷引起的疾病的方法，其特征在于使需要所述治疗的宿主服用有效量的权利要求1-7中任一项的化合物。
全文摘要
新的、具有免疫调节作用的3，3′-联硫基二(丙酸)及其酯，它们的制备方法，含有它们的药物组合物及它们的药理应用方法。
文档编号A61K31/105GK1057647SQ9110432
公开日1992年1月8日 申请日期1991年6月28日 优先权日1990年6月28日
发明者卡尔-芒努斯·A·安德逊, 斯滕·H·A·贝里斯特兰, 安德斯·R·哈尔贝里, 本特·O·塞尔斯特兰, 佩·A·S·图内克 申请人:阿斯特拉公司