专利名称：：佐剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及佐剂和含有这些佐剂的疫苗。本发明的佐剂含有至少一种合成疏水脂多糖(它们可提供可不提供阴离子基团，却保留着全部的疏水性)的乳剂、成界面组分和可选择地含有水溶解物。这些佐剂能用于制备兽用或人用疫苗。所说合成疏水脂多糖的多糖形成部分被8到40个碳原子的直链或支链脂基酯化，这些脂基可以是脂族的或不饱和的，还可以任意含有一个芳香基。多糖中脂基与糖基的平均比例优选在0.2到4之间，更优选的是约1。脂多糖可连接可不连接阴离子基团(例如磷酸酯、硫酸酯、硝酸酯基团或羧基，最好是硫酸酯基团)，却保留着全部的疏水性，阴离子基团与糖基团的平均比率最好是在0.1到2之间。SLP系列疏水性由亲水-亲脂平衡(HLB)值确定，该值按Griffin的方法(W.C.Griffin，J.Soc.Cosmet.Chem.1，311，1949)测定并且被Porter引用(M.R.Porter，Handbook.ofSurfactants，Blackle，GlasgowandLondon，1991，42页)这种方法是基于水中表面活性剂的出现(appearance)，疏水的SLP系列的HLB值在9以下(即不溶的，溶解差的和不稳定的分解体系或稳定的不透明分散体系)，尤其可以在4以下(即不溶的)。成界面组分的例子是a).与水相不混溶的液体，如矿物、动物、植物或合成油或者其它有机液体。b).不溶盐，例如Al(OH)3、AlPO4、草酸钙、蛭石、膨润土、硅石。c).一种或多种聚合物或共聚物(例如，聚丙烯酸酯，聚(甲基-异丁烯酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、多糖、多肽、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸/乙醇酸)、聚氧乙烯-聚氧丙烯、聚乙烯亚胺、聚酰氨基胺)的微粒/微球。d).亲脂剂(如磷脂、季铵类)的脂质双层。e).一种或多种下列表面活性剂的胶囊-阴离子表面活性剂(例如，羧酸盐、聚烷氧基羧酸盐、N-酰肌氨酸盐、酰化蛋白水解产物、磺酰盐、烷基苯磺酰盐、具有酯键的磺酸盐、具有酰胺键的磺酸盐、具有醚键的磺酸盐、醇硫酸盐、磷酸酯)，-非离子表面活性剂(例如，乙氧基化物、醇乙氧基化物、羧酸酯、甘油酯、聚氧乙烯酯、羧酸酰胺(carboxylicamide)、聚氧乙烯脂肪酸酰胺、聚烯化氧嵌段共聚物)，-阳离子表面活性剂(例如胺、含胺氧、2-烷基-1-(2-羟乙基)-2-咪唑啉、季胺)，和-两性表面活性剂(如咪唑衍生物)。从实用的观点看，与SLP稳定配方结合并且为接受者(不论是动物还是人)完全耐受的成界面物质是优选的，从这点来，动植物来源的油，不溶盐如Al(OH)3和AlPO4，以及动植物来源磷脂的脂质双层特别合适。在如下所述的实施例中，矿物油或角鲨烷用作成界面组分。角鲨浣较好，因它是一种动物来源的油，并因此具有所期望的生物适合性和生物降解性(biodegrabilitg)。具有合适的亲水/亲脂平衡(HLB)值以改进水包或油包水乳剂稳定性的表面活性剂的实例(具有各种商品名)是a.阴离子表面活性剂，如SandopanKST;b.非离子表面活性剂，如Brij30、35、58、98、721;TritonN-57、X-100、X-102;Span20、40、60、80、85;Tween20、21、40、60、80、85;PluronicPE10100、PE10500、RPE2510、RPE2520，c.阳离子表面活性剂，如Arguat2HT-75、ArosurfTA100，双(氢化脂烷基)二甲基氯化铵，d.两性表面活性剂，如Lonzaine10S、12C、16S;ScherotaineCAB、IAB、MAB，Amphosol。在下面所述的实验中，非离子表面活性剂(尤其是Tween80)被用于稳定SLP和油的乳剂。动物油的例子有角鲨烷和角鲨烯。合适的植物油可从大豆、花生、芝麻籽、棕榈等获得。矿物油的例子有Markol52、Krakel、Kremol等。用于本发明佐剂中的水溶解物有例如盐水、磷酸盐缓冲的盐水或纯水。优选的是通过先混合合成疏水脂多糖和油，再将油团在水中分散，或者通过先混合脂多糖和表面活性剂，加入水，再将油分散到所得到的水相中来制备本发明的佐剂。该佐剂可用于人或动物用疫苗中。疫苗可包含表现病毒、细菌、支原体或寄生虫或任何其它引起免疫反应物质特性的抗原物。这一抗原物可以例如由活生物体、灭活生物体或所谓的亚单位(后者例如由合成、或由重组DNA的方法或从完整有机体分离制备的)组成或含有这些物质。为制备疫苗，抗原物或在使用前混入，或在使用时混入。本发明进一步由下列实验说明。实施例1SLP分散体系作为佐剂的应用在下述实验中，除非另外说明，均使用特定的亲脂硫脂多糖(SLP)-衍生物(即SLP-H2-一种硫酸酯∶脂∶单糖平均比例约为0.1∶0.8∶1.0∶的SLP-衍生物)。在不同实验中使用的疫苗以下列方式之一制备。Ⅰ.将SLP以合适浓度溶于油相(角鲨烷)中，可通过微热角鲨烷(70℃)来改善SLP的溶解状况，接着，将油相加入到70℃预热的水相(磷酸盐缓冲的盐水，含2%Tween80)中，剧烈搅拌。所得预制乳状液进一步通过超声破裂或微观流化法乳化。如果油滴小于1微米(用1000倍相差显微镜估测)，则认为该乳剂可被使用。混合一体积的(约4℃的)佐剂溶液与一体积的抗原溶液制备疫苗。所指SLP的量用Ficoll作参照，以糖含量表示(干物质为约2倍多)。Ⅱ.将SLP溶于有机溶剂(如乙醇、氯仿或二氯甲烷)并与油混合。在60或70℃和低压下充分蒸发除去溶剂。接着在剧烈搅拌下将油相加到70℃预热的水相(磷酸盐缓冲的盐水，含2%Tween80)中。所得预制乳状液进一步通过超声破裂或微观流化法乳化。如果油滴小于1微米(用1000倍相差显微镜估测)，则认为该乳剂可被使用。混合一体积的(约4℃的)佐剂溶液与一体积的抗原溶液制备疫苗。Ⅲ.将SLP加到佐剂溶液(如水包矿物油乳剂)中，并通过超声破裂分散SLP。如果在macroscopy(40倍)和显微镜(400倍和1000倍)下无沉淀(precipate)可见，则认为该佐剂溶液可以使用，混合一体积的佐剂溶液和一体积的抗原溶液制备疫苗。Ⅳ.将SLP油和含有2%Tween80的水相置于一个容器中，剧烈混合，接着，保持温度在约70℃采用超声破裂或微观流化的方法乳化。如果油滴小于1微米(用1000倍相差显微镜估测)，则认为该乳剂可以使用。混合一体积的(约4℃的)佐剂溶液与一体积的抗原溶液制备疫苗。Ⅴ.将SLP溶于合适体积的液体表面活性剂(如Tween80)中，剧烈混合下加入水相，得到清辙的或乳光的悬浮液。将角鲨烷加入到这一悬液中，用微观液化方法乳化该混合物。Ⅵ.除了将在有机溶剂中的SLP与液体表面活性剂(如Tween80)混合并且在加入水相之前或之后蒸去有机相之外，都按Ⅴ进行。尽管在佐剂活性上看不出明显的不同，但制备方法Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ较好，因为这些方法相对来说易于进行和易于用于大规模生产。一种典型的SLP/S/W(硫脂多糖/角鲨烷/水)佐剂疫苗每毫升含有下列成分2.5mgSLP，0.05ml(40mg)角鲨烷、0.01ml(10mg)Tween80。所用SLP衍生物具有0.8/0.1的脂/硫酸酯平均含量(多糖的每单糖单位的基团数目)。实施例2SLP-H2/角鲨烷/水用作鼠和豚鼠中各种抗原的佐剂材料和方法动物从HarlanZeist，TheNetherlands获得RandomSwiss，雌鼠和豚鼠。除非加外说明，给约10周龄的每组5只动物在第0和第3周用0.2ml疫苗在皮下(sc)、腹膜内(ip)或肌内(im)免疫，在第3和第6周收集血液。SLP-H2/角鲨烷/水佐剂将在有机溶剂(二氯甲烷或氯仿)中的SLP-H2与角鲨烷(SigmaChem，Comp.St.Louis.USA)混合，至少用6小时在60℃和减压条件下用旋转蒸发器(BuchiLab-TechnikAG，Switzerland)蒸发除去有机溶剂。将含有SLP的角鲨烷与含有2%Tween80的磷酸盐缓冲的盐水(PBS/2%Tween80)混合，混合物分两步乳化。通过在旋涡搅拌器中剧烈振荡制备预制乳状液。接着，采用增压法(200到600大气压)经两或三个周期将预制乳状液微观流化(MicrofluidicsCorp，Newton，USA)。所得乳剂通过在显微镜下(放大1000倍)确定油滴尺寸以及通过微粒尺寸仪(microparticle-sizer)(Malvernlnstruments)进行分析。重复乳化过程直到多数液滴直径小于1μm，并且没有直径大于10μm的粒子存在。SLP-H2/S/W乳剂中加入最终浓度为0.01%的硫柳汞，该佐剂在4℃下贮藏。除非另外说明，所使用的佐剂每毫升含有5mgSLP、0.1ml(80mg)角鲨烷和0.02ml(20mg)Tween80。疫苗和接种待试疫苗通过在注射前至少一天混合一体积的抗原溶液和一体积的佐剂溶液制备。鼠接受0.2ml的含有或不含有佐剂的下列疫苗中的一种疫苗Ⅰ.每剂含有10μg二硝基苯基化牛血清白蛋白(DNP-BSP)(实验Ⅰ)。疫苗Ⅱ.每剂含有10μgDNP-BSA、1μgMRC-11和10μg卵清蛋白(OVA)(实验Ⅱ)。疫苗Ⅲ.每剂含有1μgMRC-11和10μgOVA(实验Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ)。疫苗Ⅳ含有5log10TCID50灭活的假狂犬病病毒颗粒(iPRV)、0.44μgA/Swine、0.4μgMRC-11和0.2μgX-79(实验Ⅳ)。给豚鼠注射带有和不带有佐剂的疫苗。疫苗Ⅳ的抗原组合物可与猪SuvacyniAuj/Flu3疫苗相比，并且只将猪用剂量的1/10注入鼠或豚鼠中。下列佐剂在鼠上进行试验1.每剂含有40mg油的矿物油(Markol52)/磷酸盐缓冲的盐水加1%Tween80(O/W)的乳剂(182组)，2.每剂含有0.5mgSLP和40mg矿物油(Markol52)的SLP/O/W乳剂(188组)，3.每剂含有8mg角鲨烷的角鲨烷/W(S/W)乳剂(951，1063，1083，1688和2322组)，4.每剂含有0.5mgSLP和8mg角鲨烷的SLP/S/W乳剂(952，953，1062，1082，1691，1966和2334组)，5.每剂含有1.0mgSLP和8mg角鲨烷的SLP/S/W乳剂(1692组)，6.每剂含有2.5mgSLP和8mg角鲨烷的SLP/S/W乳剂(1693组)，7.每剂含有2mg角鲨烷的S/W乳剂(1683组)，8.每剂含有0.5mgSLP和2mg角鲨烷的SLP/S/W乳剂(1685组)，9.每剂含有1.0mgSLP和2mg角鲨烷的SLP/S/W乳剂(1686组)，10.每剂含有2.5mgSLP和2mg角鲨烷的SLP/S/W乳剂(1687组)，11.每剂含有0.5mgSLP的在含有Tween80的磷酸盐缓冲的盐水(PBS/T)中的SLP悬浮液(973，974，1061，1081，1964和2327组)，12.每剂含有0.2mgSLP的在含有Tween80的磷酸盐缓冲的盐水(PBS/T)中的SLP悬浮液(1962组)，13.每剂含有8mg角鲨烷和0.5mgFicoll的加有Ficoll的S/W乳剂(1998组)。下列佐剂在豚鼠上进行试验1.每剂含有40mg油(Markol52)的O/W乳剂(实验Ⅳ第1组;实验Ⅴ第2组)，2.每剂含有8mg角鲨烷的S/W乳剂(实验Ⅰ第2组;实验Ⅱ第4组;实验Ⅲ第9组;实验Ⅳ第6组;实验Ⅴ第3组)，3.每剂含有0.5mgSLP和8mg角鲨烷的SLP/S/W乳剂(实验Ⅰ第3组;实验Ⅱ第5组;实验Ⅲ第10组;实验Ⅴ第8组)，4.每剂含有0.25mgSLP和8mg角鲨烷的SLP/S/W乳剂(实验Ⅳ第7组)，5.每剂含有1.25mgSLP和8mg角鲨烷的SLP/S/W乳剂(实验Ⅳ第8组)。下列佐剂在猪上进行试验1.每剂含有400mg油的O/W乳剂，2.每剂含有80mg角鲨烷的S/W乳剂，3.每剂含有5mgSLP和80mg角鲨烷的SLP/S/W乳剂，4.每剂含有5mgSLP的在PBS/T中的SLP悬浮液。血清中抗体滴度的测定抗-DNP-BSA抗体应答由血细胞凝集(HA)作用测定，以二硝基苯基化羊血红细胞(DNP-SRBS)作指示细胞。简单地说，血清用含有1%正常兔血清(已予先用羊血红细胞吸附)的盐水在园底96孔板上连续稀释二倍，并加入DNP-SRBC悬浮液。刚发生凝结时的交互血清稀度被认为是滴度。抗OVA抗体应答由与OVA结合的SRBC的血细胞凝集作用测定。抗-iPRV抗体滴度由血清中和试验(SN)测定。简单地说，血清在96孔板上连续稀释二倍，血清稀释物与100TCID50的Aujeszly病毒悬浮液合并。在37℃下培养24小时后，将每孔2.10e4PD-5细胞加至血清病毒的混合物中。在37℃培养5天后，对病毒筮菌区记数，引起病毒50%中和的交互血清稀度被认为是抗体滴度。抗-iFlu抗体滴度由血细胞凝集作用抑制反应(HI)测定。通过在96孔园底板上将一体积的血清加到四体积的高岭土(分别为50μl加200μl)中的立法，用高岭土预处理血清。在室温下培养30分钟后，离心除去高岭土，收集上清液并在园底96孔板上以含有0.1%BSA的佛罗那缓冲盐水连续稀释二倍。将流感病毒的四HA单位加到各孔中，将板在室温下培养1小时，鸡血红细胞用含有0.1%BSA的佛罗那缓冲盐水洗涤三次后，以0.25%的浓度加入到各孔中。30分钟到2小时内，检测凝结作用，表明抑制血细胞凝集作用的最高交互血清稀度认为是滴度。结果在鼠中的佐剂活性用于抗各种抗原的抗体应答的SLP/S/W的佐剂活性在鼠上分别在六个实验中进行研究(表1)。将SLP/S/W的作用与SLP、S/W、O/W或者不含佐剂的抗原的作用进行比较。抗DNP-BSA的抗体应答明显被SLP/S/W加强而不被O/W加强(实验Ⅰ)。单独SLP的作用较SLP/S/W差，S/W的作用比SLP或SLP/S/W的都差(实验Ⅲ)。不同的所试佐剂显著刺激了抗-MRC-11抗体应答。SLP/S/W较单独的S/W更有效(实验Ⅲ到Ⅳ，除实验Ⅱ外)。单独的SLP表现出相当大的佐剂活性，其活性可与SLP/S/W相比(实验Ⅲa、Ⅲb)或低于SLP/S/W的活性(实验Ⅱ、Ⅴ、Ⅵa)。抗-MRC-11抗体应答随SLP剂量增加而增加，也随SLP/S/W中角鲨烷含量的增加而增加(实验Ⅴ)。抗OVA抗体应答为SLP，S/W和SLP/S/W所加强，但SLP/S/W明显较单独SLP或S/W更有效(实验Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb和Ⅳ)。抗-OVA应答的SLP/S/W佐剂活性在试验范围内不随SLP或角鲨烷剂量的增加而增加。对抗iPRV体液应答进行测定，SLP/S/W明显增加了应答(实验Ⅵa和Ⅵb)并证明较S/W更有效。单独的SLP约与SLP/S/W效果相仿。结果总结于表1A和1B。在豚鼠吉的佐剂活性在豚鼠中将SLP/S/W对猪iPRV+iFLU3疫苗的抗体应答的作用与S/W和O/W比较。豚鼠已被广泛用作猪疫苗和抗iPRV和iFLU成分抗体应答的模型，并被认为能指示疫苗在猪上的效果。五只动物为一组在第0周和第3周用0.2ml疫苗使各组动物皮下免疫，在第6周测定抗体滴度。对下列疫苗组合物进行试验。a.适于灭活假狂犬病毒的SLP/S/W(表2;实验Ⅰ-Ⅴ)。b.适于灭活流感病毒株A/Swine，MRC-11和X-79的SLP/S/W(实验Ⅳ和Ⅴ)，并且实验Ⅰ-Ⅲ表明，水包角鲨烷(S/W)和SLP/S/W明显提高了抗iPRV抗体滴度，SLP/S/W较S/W更有效。在实验Ⅳ和Ⅴ中，不同组间可见抗-iPRV抗体滴度的微小差异。然而在这些实验中可见抗iFLU3抗体滴度的明显不同。SLP/S/W和O/W较S/W或单独抗原引起更高的抗体滴度。SLP/S/W与O/W一样有效。实施例3SLP/角鲨烷/水用作猪中iPRV，iFLU和活PRV的佐剂材料和方法猪将约10周龄的每5只猪分为一组，用于该实验，在第0周和第3周用0.2ml疫苗对这些动物肌内免疫，在第6周收集血液。疫苗和接种被试疫苗含有一体积的抗原和一体积的佐剂溶液。抗原溶液包括6log10TCID50灭活的假狂犬病病毒粒子、4.4μg流感病毒株A/Swine、4.0μgMRC-11和2.0μgX-79。所使用的佐剂溶液是前述的SLP/S/W(每ml佐剂溶液含5mgSLP和80mg角鲨烷)或者是标准的水包矿物油乳剂(50%矿物油)。冻干的活PRV在稀释剂或佐剂溶液(预先用稀释剂1∶1稀释)中恢复，在10分钟内注入。结果抗iPRV和iFLU3抗体应答的刺激在五个独立的实验中，在猪上对SLP/S/W与标准O/W的佐剂活性进行比较。至少5头猪为一组，用iPRV+iFLU3加SLP/S/W或用iPRV+iFLU3加标准O/W或者用无佐剂的iPRV+iFLU3对各组动物进行免疫(表3)。免疫后用SLP/S/W测定的抗-iPRV抗体滴度与O/W引起的没有明显不同(P＞0.20)。在五个实验的四个中，与标准O/W相比，注入SLP/S/W之后，检测到抗不同流感病毒株的3到4倍高滴度。综合结果和统计分析表明抗A/Swine(P＜0.01)、MRC-11(P＜0.01)和X79(P＜0.01)滴度明显增加。n头猪为一组在第0和第3周用iPRV+iFlu3加佐剂使各组动物肌内免疫，在第6周测定抗体滴度，增长因子按下式计算2e(用SLP/S/W的滴度-用O/W的滴度)。SLP/S/W和O/W差的P值由学生试验计算。P值＞0.05被认为不显著。NS不显著;S显著。实验Ⅳ第1组15只动物中的4只没有产生明显的抗流感病毒株MRC-11的抗体应答(在这些动物中的平均滴度＜5.6)，但测量到抗其它抗原的正常应答。表4表4(续)抗活PRV抗体应答的刺激在四个独立的实验中，研究了SLP/S/W和标准O/W对于抗活PRV抗体应答的作用。猪被免疫二次，每次接种后三周测量抗-PRV抗体滴度。在所有情况下，第一次注射后都观察到较低到中等的抗体滴度，而第二次免疫后滴度增加(表4)。与在稀释剂中的活PRV相比，在第一次免疫后，SLP/S/W和O/W能略微提高抗体滴度。第二次接种后，抗体滴度被SLP/S/W和O/W明显增加。SLP/S/W引起抗PRV抗体滴度增加23倍，而O/W引起抗PRV抗体滴度增加7倍。在以活的PRV加佐剂SLP/S/W免疫的免疫试验后病毒分泌的减少含有SLP/S/W或O/W的活PRV疫苗的功效通过测定免疫试验后病毒分泌进行研究。动物在第二次免疫后五周进行intranasaly免疫试验，在tonsillarswabs上的病毒滴度在后续14天内被监测(图1)。滴度以10logTCID50表示免疫试验后的11到24天，未接种动物分泌大量PRV，对照组五只动物中的两只在测试期间死亡。无佐剂动物免疫既降低了分泌病毒的时间又降低了分泌病毒的滴度。用在SLP/S/W或O/W中重新构成的PRV接种导致分泌时间和分泌病毒量的进一步减少。用O/W在四天内至少4log10的病毒滴度被分泌，而用SLP/S/W，仅一天就测到3.5log10的最大病毒滴度。通过计算在log病毒滴度对免疫试验后时间间隔曲线(AUC)下的面积测定总的病毒分泌。对照组动物的AUC被认为是100%。接受无佐剂抗原动物的AUC是57%。带有O/W和SLP/S/W的接种所得AUC分别为39%和26%。实施例4在鸡中的佐剂每10只鸡为一组，在第0和第3周用0.5ml疫苗使各组动物免疫，在第0、3和6周测定抗体滴度。SLP/S/W与灭活的Newcastle疫病(NCD)病毒混合。结果总结于表5。表5</tables>实施例5免疫调节活性与免疫佐剂活性对一种亲水SLP-衍生物的作用进行研究，这种衍生物对特定免疫应答中的非特定抗性(EP295，749)具有确认的刺激活性。将硫酸酯/脂平均比例为0.1/0.8的疏水SLP-衍生物和硫酸酯/脂平均比例为0.6/0.01或1.6/0.8的亲水SLP-衍生物的佐剂活性进行比较。通过将SLP加入到油滴小于1μm的S/W乳剂和接着进行乳剂的超声处理制备不同的SLP/S/W乳剂。每5只鼠或豚鼠为一组，用0.2ml每剂含有0.5mgSLP-衍生物和8mg角鲨烷的疫苗使各组动物免疫，用2.0ml每剂含有5mgSLP-衍生物和80mg角鲨烷的疫苗使猪免疫。结果示于表6。表6从用不同抗原在不同动物品种上的实验结果可清楚看出，在S/W中的疏水SLP是比在S/W中的亲水SLP更有效的佐剂。权利要求1.佐剂组合物，该组合物含有至少一种合成疏水脂多糖、成界面组分以及可选择地含有水溶解物。2.如权利要求1的佐剂组合物，其特征在于脂多糖的脂基与糖基的平均比例为0.2到4。3.如权利要求1或2的佐剂组合物，其特征在于脂多糖与阴离子基团连接，却保留着全部的疏水性。4.如权利要求1-3的佐剂组合物，其特征在于脂多糖具有小于9的亲水-亲脂平衡(HLB)值。5.如权利要求1-3的佐剂组合物，其特征在于脂多糖具有小于4的亲水-亲脂平衡(HLB)值。6.如权利要求1-5的佐剂组合物，其特征在于成界面组分是与水相不混溶的液体。7.如权利要求1-6的佐剂组合物，其特征在于成界面组分是不溶于水相的固体。8.含有如权利要求1-7所述佐剂和免疫原的疫苗。全文摘要本发明的佐剂含有一种至少含有一种合成疏水脂多糖(它们可连接可不连接阴离子基团，却保留着全部的疏水性)的乳剂、一种成界面组分(如油)和一种水溶解物选择组分，特别是，佐剂和用它制成的疫苗含有一种脂多糖，这种脂多糖的HLB值小于9，更好的小于4。文档编号A61P37/04GK1074135SQ92115240公开日1993年7月14日申请日期1992年12月19日优先权日1991年12月23日发明者L·A·T·希尔格斯,P·-P·L·I·帕拉滕堡申请人:杜法尔国际研究公司