专利名称：促脑康的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种神经生长刺激肽(NTPS)，临床应用于脑外伤或脑类后遗症及各种精神、神经疾病的治疗。
在本领域，具有刺激神经元突起生长和支持存活作用的生物因子主要分两大类1、神经营养因子(NTPS)，这些因子对神经细胞具有营养和支持存活的作用，包括神经生长因子(NGF)及其基因家庭成员脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养素III(Neurotrophin3)以及睫状神经营养因子(CNTF)等[1]，2、神经突起生长因子(NTPS)，它们主要能促进神经元的突起形成和生长上述因子中，NGF、BDNF、NT-3和CNTF的分子结构，氨基酸序列目前均已清楚。NGF和BDNF已有基因工程产品上市，并已取得初步的临床效果[2、3]，但因价格昂贵而难以临床推广应用。脑活素，是奥地利依比威大药厂从成年猪脑组织中制备的脑蛋白水解液，主要成分是一系列小分子多肽和氨基酸，对神经元具有一定的营养作用，现已用于治疗各种神经系统疾病[4、5]。国内也有与脑活素相似的同类产品问世。以上产品均从成年猪脑中来源，而从健康幼年哺乳类动物脑中制备NTPS活性物质，目前尚未见。
本发明的目的在于提供一种从健康幼年哺乳类动物的脑中提取具有较高生物活性的神经生长刺激肽(NTPS)，供临床上用于治疗脑外伤、脑炎后遗症及多种神经系统疾病可以是口服液和肌肉注射，或与其它药物配伍静脉滴入。
本发明是一种稳定的神经生长刺激肽(NTPS)。具有如下特征(1)在PH2-10范围内稳定；(2)耐热75-80℃，30min，活性不改变；加热100℃，15min后活性丧失；(3)在多种蛋白水解酶，37℃，2小时条件下生物活性丧失；(4)在DNAse，RNAse，37℃，2小时条件下，生物活性丧失；(5)在加入3-8％甘露醇冻干密封条件下，室温贮存1年，4℃贮存2年，-20℃贮存3年，生物活性不改变；(6)用HPLC分析，主要由3个组份组成。各峰面积及保留时间分别为36.274％、2.65分，12.548％、3.90分，42.316％、4.56分；(7)经SDS-PDGE分析；显示两条主要色带、分子量别为9600，8860Da；(8)经紫外光谱扫描分析；在波长250.6±2nm和230.5±2nm处有两个吸收峰。
附
图1为本发明的NTPS的紫外光谱扫描分析图谱；附图2为本发明的NTPS的HPLC的图谱；实例一可用下述方法表现本发明药物生物活性，取SD胚胎鼠(16-20)天，无菌分离胎鼠大脑皮层，胰酶分离神经细胞，用DMEM培养基洗涤3次后，用含10％小牛血清的DME/F12培养基接种于Costar 96孔(3596)培养板内，每孔150ul；37℃，5％CO2条件下24小时。用含5％血清的DME/F12培养基(内加阿糖胞苷2×10-5M用于抑制非神经元细胞的生长)换液后，实验孔分别加入不同稀释度的NTPS，使最终浓度分别为5，10，20，40ug/ml，对照孔仅加DME/F12培养基，继续培养68小时，每孔加入5ulMTT(1.5mg/ml)，DME培养基配制)，继续培养4-6小时，每孔加入二甲基亚砜100ul终止反应，置酶标仪570nm条件下测OD值，测定结果如下。
NTPS对神经元脱氢酶活力的影响n CD值P对照组4 0.15±0.03NTPS组(ug)5 4 0.21±0.03 ＜0.05104 0.23±0.03 ＜0.01204 0.30±0.05 ＜0.01404 0.30±0.01 ＜0.01实例二从幼年动物制备NTPS[Y]与成年动物同等条件下制备的NTPS[A]比较，NTPS[Y]活性较高，活性测定方法参见上例每毫克NTPS[Y]含活性单位为50iu，而每毫克NTPS[A]仅为12.5iu。
下面是本发明的NTPS的HPLC的数据SAMPLEMETHODMeoh∶Water＝10∶90 Flow0.8TYPEAREA PERCENT RUN NUMBER2INDEX1WAVELENTH254nmPEAK# AREA％ RT AREA BC1 2.277 0.87 811092 022 1.325 2.01 471730 023 *36.2742.65 12918549 0814 0.152 3.06 54295 055 0.078 3.31 27592 06 8 0.068 4.33 24220 069 *42.3164.56 15070735 08310 3.227 6.63 11491290511 0.283 7.89 100819 0612 1.452 8.74 517069 07TOTAL 100.00 35614071本发明药物的药理作用实现如下三月龄SD大鼠16只，体重300g，1％戊巴比妥钠麻醉后固定于脑立体定位仪上，环形钻开颅，用自制双刃刀在右侧顶皮质切一宽2mm，深2.5mm的冠状切口，切口坐标是前囱后3mm，旁中线1.5mm。其中8只经腹腔注射神经营养因子0.5ml(广州空军医院科研室研制)每天一次，对照组注射生理盐水0.5ml，存活3周后经心脏主动脉插管，生理盐水和4％多聚甲醛连续灌注、固定。取脑置于25％蔗糖磷酸缓冲液(0.1mol/l)中保存15-20小时。冰冻切片机作连续失状切片，片厚40um，切片分两套，一套作尼氏染色，一套按Hedreen荐的方法显示AChE阳性纤维，具体步骤是(1)0.1mol/L醋酸缓冲液(pH5.8)洗2次；(2)室温下孵育30分钟(孵育液含碘化乙酰硫胆硷12.5)；(3)0.1ml/L醋酸冲液(pH5.8)洗5次；(4)1％硫化铵处理1分钟，醋酸缓冲液洗5次；(5)0.1％硝酸银染色1分钟，0.1％mol/L醋酸缓冲液1洗5次。裱片，晾干常规脱水、透明、封片，在光学显微镜下观察和照相。用标准目镜方格测试系统(10×10)在40倍物镜下计数切口嘴侧、尾侧以及对照鼠相应区域的皮质、IV、V层内AChE阳性纤维的密度。以AChE阳性纤维与测式线的交点数(N)表示纤维的密度(N/10000um2)。每只动物取切口中1/3的5张切片进行计数。结果发现损伤后三周时对照组切口两缘基本对合，但不整齐，切口区可见明显的疤痕组织形成，切口嘴侧纤维增多，一些细的纤维向切口区靠近，切口尾侧区纤维较嘴侧稀少。神经营养因子处理组，损伤后三周时皮质切口已全部对合，较对照组对合整齐。切口区内疤痕组织很少，形成一条窄细的线几乎不能辨认，嘴侧区AChE阳性纤维大量增生，逼进切口区形成一密集的纤维带，并见少数纤维跨过切口区进入尾侧但这些穿过切口的纤维走行迂曲，不能做长距离的跟踪，尾侧区纤维比嘴侧区稀少。纤维网格计数结果显示，神经营养因子注射组无论是切口嘴侧还是切口尾侧皮质内的AChE阳性纤维的密度均较对照组明显增多，见下表皮质损伤后三周AChE阳性纤维密度对照组 NTPS组切口嘴侧 第IV层 193.04±10.21 217.34±14.37**第V层 174.23±9.48195.06±11.26**切口尾侧 第IV层 134.81±9.27178.26±12.74**第V层 127.05±9.43151.34±10.89*表中数据为AChE阳性纤维与测试线交点数(N/10000um2)×±SD，n＝8；* 表示与对照组比较差异有显著意义；**差异有高度显著意义。
本发明药物选取健康幼年哺乳类动物如乳猪、新生小牛及新生羊的脑。
本发明药物在临床上可用于治疗脑外伤或脑炎后遗症、老年性痴呆、脑血管意外、少儿智力发育不良、神经衰弱以及各种精神、神经疾病的辅助治疗。
本发明药物可在临床单独使用，也可与其它中西药单方或复方合用。
本发明药物可制成一种保健食品——神脑口服液。
权利要求
1.一种神经系统疾病治疗药--促脑康，神经生长刺激肽(NTPS)是从健康幼年哺乳类动物脑中制备提取，其特征是(1)、在PH2-10范围内稳定；(2)、耐热75-80℃，30min，活性不改变；加热100℃，15min后活性丧失；(3)、在多种蛋白水解酶，37℃，2小时条件下生物活性丧失；(4)、在DNAse，RNAse，37℃，2小时条件下，生物活性不丧失；(5)、在加入3-8％甘露醇冻干密封条件下，室温贮存1年，4℃贮存2年，-20℃贮存3年，生物活性不改变；(6)、用HPLC分析，主要由3个组份组成。各峰面积及保留时间分别为36.274％、2.65分，12.548％、3.90分，42.316％、4.56分；(7)、经SDS-PDGE分析显示两条主要色带，分子量分别为9600，8860Da；(8)、经紫外光谱扫描分析在波长250.6±2nM和230.5±2nM处有两个吸收峰。
全文摘要
本发明涉及的是一种神经生长刺激肽(NTPs)，它是一种从健康幼年哺乳类动物的脑中提取具有较高生物活性的神经生长刺激肽(NTPs)，分子量小于1万和/或5万道尔顿，临床应用于脑外伤或脑类后遗症及各种精神、神经疾病的治疗；可以是口服液和肌肉注射，或与其它药物配伍静脉滴入。
文档编号A61K38/17GK1120456SQ9411632
公开日1996年4月17日 申请日期1994年10月10日 优先权日1994年10月10日
发明者孔祥平 申请人:中国人民解放军空军广州医院