含不溶解生物可吸收物质的修补物及其制备方法

专利名称：含不溶解生物可吸收物质的修补物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及植入哺乳动物体内的修补物，它包含用物理方法(代替化学试剂的交联)使之不溶解的生物可吸收物质，可用它来代替由生物可吸收物质包衣的常规修补物，并且本发明涉及不溶解在生物可吸收(bioable)物质上的细胞因子(Cytokines)。本发明也涉及制备这些修补物的方法。
本发明涉及含有能预防血液渗漏的生物可吸收物质的修补物，本发明具有不形成血栓的性质和与宿主细胞的亲和力，并且不具有典型地由生产常规修补物过程中所使用的化学试剂所引起的副作用。修补物包含生长因子，如成纤维细胞生长因子，用于刺激细胞如成纤维细胞和/或内皮细胞在修补物内或在其周围生长。
修补物重要的和必需的特性是没有体内降解力，具有适当的机械性质如保持形态，柔软性和柔韧性，不渗血性及下列性质(1)极好的不形成血栓作用，(2)生物学可接受性，如无毒性，无致癌性，无免疫原性和无异体反应，和(3)极好的新内膜愈合能力。
大多数心血管壁修补物是由纺织物(Woven)编织成紧密结合的聚酯纤维或展开的聚四氟乙烯制造的。为了形成较好的新内皮，已采用多孔物质作为修补物。
为了防止血液经多孔型修补物渗漏，通常在植入前，用新鲜的血将修补物密封。这种方法称做“预凝集”。最近，代替外科手术期间预凝集，在生产常规的心血管壁修补物期间，用生物可吸收的物质如胶原，白蛋白或明胶来包衣修补物。
通过化学试剂如戊二醛，甲醛或二异氰酸酯的交叉联结，使这些生物可吸收物质不溶解，然而，它们是细胞毒性的，并且甚至在很长时间以后，不良的副作用导致抗宿主组织的异体反应。根据最新的科学报告可知，由于非感染性炎症，修补物周围液体滞留和/或植入后通常引起的持续发烧，常常延期愈合。
当使用常规血管修补物时，可选择多孔型使得组织从外膜向腔内生长。通常，用新鲜血(预凝集)产生的纤维蛋白网状物将这些孔密封住。然而，由预凝集产生的纤维蛋白网状物由于纤维蛋白溶解现象，常具有被溶解的危险。在植入期间和植入后，当使用大量抗凝结剂时，尤其是这样，并且由纤维蛋白溶解引起的出血能导致严重的疾病。为了预防这种不需要的出血，将新的多孔血管修补物用与戊二醛，甲醛或二异氰酸酯交叉联结的生物可吸收物质包衣。如下所述，在本发明中，使用化学交叉联结的替代方法。
关于常规包衣的修补物，可用胶原蛋白，明胶和白蛋白作为生物可吸收物质。这些生物可吸收物质对宿主细胞原有高度亲和力，除非用化学方法来处理它们。在化学处理前，这些生物可吸收物质可诱导形成极好的新内皮并不产生副作用，然而，它们的好处不能令人满意地被利用。从外科手术期间抗出血这种安全的观点看，尽管常规包衣的修补物具有不良的副作用(因为近来的外科手术在植入期间和植入后要求使用大量抗凝剂)，但它已用于人类。据报道，在年老和/或体弱的病人(通常为患不幸或高危疾病的病人)中，植入常规修补物后产生正常的但却是不需要的结果。当重点是为了预防血液渗漏时，那么阻止由包衣的物质引起的副作用是困难的。只要使用了常规包衣的修补物，就不可能解决这种困境。
就生产方法而言，为了包衣和浸润常规修补物，使用生物可吸收物质的高粘性悬浮液。然而，由于物质的高粘性，它们只蓄积在腔的表面，这导致修补物壁内侧浸润不足并且浸润剂容易从修补物的表面分离下来。
本发明避开了常规修补物的缺点。本发明包括1.含有多孔物质和一种或多种至少用一种物理方法使之不溶解的生物可吸收物质的修补物，其中所述物理方法如缠结，干燥，热交联，γ照射，紫外照射和与电荷超水合作用引起的膨胀。这些物理方法不需要制备常规包衣修补物所使用的化学试剂。本发明修补物包含生长因子，如成纤维细胞生长因子，用来增加植入修补物宿主的接受几率。
2可通过用具有低粘度(如在22℃下，用粘度计测定粘度小于或等于1000mPa′s)的生物可吸收物质的分散溶液重复浸润多孔修补物的方法来制备通过本发明物理方法而不是化学方法保留一种或多种生物可吸收物质的修补物。当用胶原纤维作为生物可吸收物质时，分散的溶液可以是纤维的胶原蛋白悬浮液，其中胶原蛋白的浓度等于或小于约1.0wt％。可将修补物放到胶原纤维溶液中和/或将胶原纤维溶液放到修补物底物内侧，并且在修补物底物壁内(如在修补物底物壁的孔内)，通过修补物内、外的压力变化，可以捕获到胶原纤维。通过物理方法如缠结，干燥，热交联，γ照射，紫外照射和与电荷超水合作用引起的膨胀，使捕获到的生物可吸收物质(即胶原纤维)不溶解。此后，生长因子，如成纤维细胞生长因子可结合到生物可吸收物质上。
3.由生物可吸收物质制备的修补物，其中不需要多孔底物的支撑结构，生物可吸收物质本身即可成形为修补物，然后用本发明的物理方法，如干燥，热交联，γ照射，紫外照射和或与电荷超水合作用引起的膨胀，使生物可吸收物质固定或不溶解在适当的位置。使生物可吸收物质固定或不溶解后，生长因子，如成纤维细胞生长因子可结合在它的上面。
在生产与本发明有关的心血管壁修补物时，可选用常规的多孔修补物，如多孔结构的血管修补物或具有长纤维的e-PTFE修补物作为框架来使修补物成型。多孔结构用于给修补物提供一适宜的结构。因此，当制备心血管壁修补物时，可使用多孔管。当要求修补物为另外的形状时，可使用非管形的多孔结构。例如，当制备伤口敷料或皮肤移植物时，可使用薄片形的多孔结构。除去多孔结构的底物也是可能的，尤其当修补物的形状是简单的。例如，当生产伤口敷料或皮肤移植物时，生物可吸收物质本身即可成形为薄片形状或与自身的长度和宽度相比具有相对小厚度的象海绵一样的物质。
将用生物可吸收物质或用生物可吸收物质包衣的多孔底物制备的修补物通过物理方法处理，使生物可吸收物质固定在适当的位置并且在不使用化学试剂如戊二醛，甲醛或二异氰酸酯时使生物可吸收物质不溶解。典型地，过去已经用戊二醛，甲醛或二异氰酸酯来使常规包衣修补物的生物可吸收物质不溶解。在本发明中，通过物理方法，包括缠结，干燥，热交联，γ照射，紫外照射或与电荷超水合作用引起的膨胀，使生物可吸收物质不溶解和/或固定在适当的位置，如附着在多孔底物上。代替先有技术中用化学试剂处理或反应，使用本发明物理固定或不溶解法，并且可单独或联合使用。
在本说明书中使用的表达“通过物理方法使生物可吸收物质固定或不溶解”是指使生物可吸收物质固定和/或不溶解在自身或多孔底物上的任何方法，它不包括使用化学试剂使生物可吸收物质在适当的位置不溶解，受保护，固定和/或交联。本说明书中使用的表达“使生物可吸收物质在适当的位置不溶解和/或固定”是指含生物可吸收物质的修补物可以在流动的水下冲洗约1小时而不会使生物可吸收物质从修补物上脱离下来。例如，如下述本发明几个实施例中所述，用流动的蒸馏水冲洗修补物24小时，没有生物可吸收物质从修补物表面脱离下来的任何迹象。如上所述，本发明物理方法包括缠结，干燥，热交联，γ照射，紫外照射，和与电荷超水合作用引起的膨胀。缠结包括使用纤维形的生物可吸收物质，如胶原纤维或用另一种生物可吸收物质包衣的胶原纤维，其中纤维与多孔底物或其自身如此缠结使得在流动的水下冲洗时，它们不会从修补物上脱离下来。干燥或热交联包括在室温或升高的温度下，干燥含生物可吸收物质的修补物，使得当随后用流动的水冲洗时，生物可吸收物质不会从经过这样干燥的修补物上脱离下来。与电荷超水合作用引起的膨胀包括使生物可吸收物带上负电荷，这样，当潮湿时，在生物可吸收物质框架内的带电荷物质，通过电荷彼此的排斥作用，吸收水分，单独或与底物一起膨胀。这种膨胀作用携助将生物可吸收物质固定在适当的位置或在底物内。由于超水合作用，生物可吸收物质可成不溶解状态并因此不能从修补物框架中流出来。为了使生物可吸收物质(如胶原蛋白，明胶，丝蛋白纤维素和壳多糖)带负电荷，与其它任何能够给生物可吸收物质传递负电荷的方法一起，使用琥珀酰化作用(Succinylation)和磺化作用。
本发明的一个目的是提供包含多孔底物和固定在其上面的生物可吸收物质的修补物，它不受化学试剂的影响。本发明修补物具有对宿主细胞的高度亲和力，不渗血，无形成血栓的性质，无致癌性，可形成较好的新内膜，并且是柔软的和柔韧的，不引起异体反应。
本发明的另一个目的提供生产修补物的方法，该修补物没有由化学试剂所引起的副作用，然而却具有与宿主细胞的高度亲和力，无渗血性，无形成血栓的性质，具有柔软性和柔韧性，无致癌性且形成较好的新内膜而不引起异体反应。
本发明进一步的目的是提供含带负电荷生物可吸收物质的修补物，在修补物上附着有细胞因子或能产生细胞因子的组织或细胞。细胞因子能提供促进成纤维细胞和毛细血管在修补物内和其周围生长的生长因子。
为了达到上述目的，适于生产修补物的框架如下所述。由多孔型底物塑造修补物的形状，其中的孔在植入后促进组织迅速从外膜向腔内生长。在本发明中，多孔型底物是不受限制的并且可以是管型或适宜大小的薄片。另外，多孔型底物材料是不受限制的并且可以是聚酯(如由Du Pont de Nemours & Co制造的Dacron)，聚氨基甲酸乙酯，聚乙烯醇，聚乙烯基共聚物，尼龙，聚丙烯，聚四氟乙烯，棉状物和丝。优选的底物包括常规多孔聚酯修补物，如多孔结构血管修补物和具有长纤维的e-PTFE修补物。
生长因子可直接粘着在生物可吸收物质上。生物可吸收物质如肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，硫酸皮肤素，透明质酸和琥珀酰化的胶原蛋白具有适宜的亲和力，使生长因子粘着或固定在修补物内，这样当将修补物植入宿主体内后，生长因子可逐渐在体内释放。或者，释放或分泌生长因子的组织或细胞可粘着或固定在生物可吸收物质上。在某种情况下，组织或细胞形式的生物可吸收物质可用作释放或分泌生长因子的组织或细胞。例如，能产生或分泌bFGF的骨髓组织和细胞可用作生物可吸收物质。优选通过缠结或其它物理方法来处理这样的组织和细胞，使它们不溶解或固定在修补物内，这不杀死或减少杀死组织和细胞，因为这在修补物植入宿主体内后，允许组织和细胞在体内经过较长的时间释放生长因子。从修补物中释放或分泌生长因子在很低浓度下，可有效地刺激所要求的细胞如成纤维细胞，平滑肌细胞和内皮细胞的生长。例如，在本发明修补物周围促进细胞生长的生长因子的有效浓度可低至1×10-9-1×10-11M。这是因为生长因子的作用是受它们与特异性，高亲和力的，用靶细胞来表示的受体(生长因子受体)结合来介导的。在本发明中，生长因子的靶细胞是植入修补物后，在修补物周围的宿主细胞。
由于生物可吸收物质本身可成形为修补物，省略多孔型底物也是可能的。例如，含约1-2wt％胶原蛋白或明胶溶液的溶液或泥浆可冻干并且形成一片海绵状物。在溶液或泥浆中可包含肝素或其它物质，它们具有与细胞因子结合的亲和力，这样在海绵状物形成后，将它浸入细胞因子的溶液中来给修补物提供生长因子。其使用方法是将得到的含有生长因子的海绵状物原样使用，或使其在溶液中搅碎以便产生胶原蛋白海绵状物的悬浮液，并且将悬浮液注射到需要生长因子的哺乳动物体内。通过控制胶原蛋白溶液的PH值，可以形成粉状的胶原蛋白。例如见美国专利4,749,689中的方法，引入本文供参考。如果在用于制备胶原蛋白粉剂的胶原蛋白溶液中含有肝素或其它具有将细胞因子结合在其上面的亲和力的物质，那么，为了结合上细胞因子，可将粉剂与细胞因子接触。可将得到的粉剂放在开放的伤口上或注射到哺乳动物需要细胞因子生长因子的部位。
在本发明中，可使用任何种类的生物可吸收物质，如聚羟基乙酸(polyglycolic acid)，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物，生物可吸收的(3-羟丁醇酯-4-羟丁醇酯)聚酯共聚物，聚二噁烷，胶原蛋白，明胶，琥珀酰化的胶原蛋白，硫酸软骨素，琥珀酰化的明胶，壳多糖，纤维素，丝蛋白，藻酸，肝素，硫酸乙酰肝素，透明质酸，硫酸皮肤素及其衍生物。生物可吸收物质通常是亲水性的，尽管疏水性生物可吸收物质是已知的并且可用于本发明中。本文所使用的词“生物可吸收物质”定义为一种物质，优选对宿主具有低毒性，在植入宿主一段时间后可被宿主吸收。在以上所列出的生物可吸收物质中，优选胶原蛋白，明胶，琥珀酰化的胶原蛋白，琥珀酰化的明胶，壳多糖，纤维素，丝蛋白，白蛋白，藻酸，肝素，硫酸乙酰肝素，透明质酸，硫酸软骨素，硫酸皮肤素及其衍生物。依赖特定物质该物质可以是具有较宽分子量范围的单分子或多分子物质。例如，硫酸乙酰肝素和透明质酸可分别为具有约5,000-20,000和约10,000和约2,000,000分子量的多分子物质。
由于本发明未使用化学法处理生物可吸收物质来使其不溶解或固定或保留在修补物上，所以这些生物可吸收物质没有机会具有在包衣或其不溶解过程中，由化学试剂引起的致免疫性。因此，优选不致免疫或很少免疫性的物质如明胶，atelocollagen和从动物的跟腱得到的纯化的胶原纤维。如果物质具有较强的免疫性应该在减低免疫性后使用。
除此之外，也可使用哺乳动物的组织和细胞作为生物可吸收物质，尤其是自身组织和细胞，即植入修补物的宿主的组织和细胞。用组织和细胞作为生物可吸收物质的优点包括(1)组织和细胞是足够大的，容易形成多孔底物的间隙，及彼此间的间隙。
(2)组织和细胞可提供适宜的环境供宿主细胞移动和增殖，即使在消毒或干燥过程中死亡。如果组织能维持其生存能力，它们将促进修补物表面新内膜形成。
(3)自身组织和细胞可合成某些细胞因子，如生长因子。由于具有这些细胞因子，组织和细胞可维持其生存能力并且促进彼此活下来和在它们所在处产生器官。
本文所使用的术语“细胞因子”(“Cytoline”)作为蛋白质的通用词，词在本领域是公知的术语，它引起或调节细胞与细胞间的交换，例如，调节细胞的生长和分化，并包括治愈，修补和对疾病的应答(例如炎症，免疫性和癌血症)。细胞因子的活性是宽的且相互重迭。个别的细胞因子具有专门的名称。这些包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α，cachectin)，TNF-β(淋巴细胞毒素)，干扰素-α，-β和-γ。生长因子也可能是细胞因子。生长因子可定义为多功能的，局部作用的，细胞内作用的多肽，它控制个体发育并且维持组织的形式和功能。可用于本发明的生长因子包括表皮生长因子(EGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，转移生长因子-α和-β(TGF)，成纤维细胞生长因子(FGF，碱性FGF，酸性FGF)及克隆生长因子(CSF)。新的生长因子不断地增加到已知的细胞因子中，并且关于已知细胞因子的新功能不断有报道。
尤其，本发明所使用的用作生长因子的细胞因子是成纤维细胞生长因子，它可以通过体内生物技术从正常细胞中得到(如bFGF是从骨髓中合成的)。这些也可以通过商业渠道购得并且由供市场销售的生物技术公司生产。
优选的是生长因子是碱性生物因子(bFGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDGF)和肝细胞生长因子(HGF)。BFGF是各种类型细胞，包括成纤维细胞，神经皮肤细胞(neurectodermal cell)和毛细血管和大血管内皮细胞的有效的分裂素。VEGF是内皮细胞的分裂素。PDGF诱导成纤维细胞和平滑肌细胞的增殖。尤其优选BFGF和VEGF。从Genzyme Corporation，Cytokine ResedrchProducts，Boston，MA，U.S.A和其它公司可购得这些生长因子和其它的生长因子。
通过与修补物底物的多孔型结构缠结，可以容易地将生物可吸收物质缠住。为了此目的，优选具有长丝形状或较大体积的可吸收物质(即细胞或组织)，但也可以使用那些具有非长丝形状或较小体积的生物可吸收物质。为了网缠住丝状物质，可使用该物质稀释的悬浮液或其溶液，在22℃下，用粘度计测定胶原纤维悬浮液，其粘度低于或等于约1000mPa′s，胶原蛋白的浓度等于或低于约1.0wt％。由于使用这种低粘性的悬浮液，当修补物底物壁内、外悬浮液的压力不同时，在修补物底物内网缠住丝状物质是可，能的。通过网缠住这种低粘性的悬浮液和通过让它通过修补物壁的孔，丝状物质可逐渐蓄积在修补物的壁内和修补物底物的壁上。如果悬浮液是高粘性的，丝状物质不能透过修补物，因为一根细丝堵住了另一根细丝通过多孔型修补物底物壁间隙的通路。利用该方法，使大量细丝与修补物底物的多孔型框架缠结。
通过上述方法将生物可吸收物质灌注到多孔底物中，可重复使用该方法再次将生物可吸收物质灌注到心血管修补物上。例如，在第一次灌注后，将移植物干燥，并将另一种生物可吸收物质的悬浮液或溶液灌注到修补物底物的孔中，其中已含有先前的生物可吸收物质。此后，再次将移植物干燥，如通过冻干或在空气中干燥。
如果要求提供心血管壁修补物，那么第二次或再次灌注修补物可能是更有用的。例如，第一次可将胶原纤维灌注到多孔型底物上或多孔型底物内，然后第二次可将肝素灌注到多孔型底物上或多孔型底物内。两次灌注后，修补物可获得抗血栓形成性质及在修补物壁内的有效的负电荷，这有效地在修补物内保留大量水。如果用胶原纤维作为第一次灌注剂，并且用硫酸皮肤素作为第二次灌注剂，那么修补物可获得与宿主细胞的高亲和力，因为硫酸皮肤素能为宿主细胞的移动提供极好的环境。如果用藻酸，硫酸乙酰肝素或透明质酸作为第二次灌注剂，那么修补物可分别获得相应的特性。
热交联是使网缠住的生物可吸收物质不溶解的最适宜的物理方法。彻底干燥后，在约100-180℃的温度范围，将带有生物可吸收物质的修补物加热约1-48小时。加热参数依赖于生物可吸收物质的种类，如果生物可吸收物质为琥珀酰化的胶原纤维，那么优选在约130℃-140℃加热约10-24小时。按照这些方法，当加热生物可吸收物质时由于脱水作用，使生物可吸收物质交联。例如，通过共价结合交联物质中的羟基。
γ照射和紫外照射是使生物可吸收物质不溶解的另一种优选的物理方法。二者之中，前者是更有效和有用的，因为经过γ照射，可同时进行不溶解化作用和消毒作用。典型的γ和紫外照射条件是在干燥或湿润状态下和在室内空气或氮气环境下，在约0.1Mrad-5Mrad，优选约2-3Mrad下进行γ或紫外照射。这些条件依赖于特定的生物可吸收物质。例如，在琥珀酰化的胶原蛋白中，优选在潮湿环境下在2.5Mrad下照射。
不溶解或固定在修补物中的生物可吸收物质可以带上负电荷或正电荷。优选修补物带负电荷，因为负电荷表面可阻止带负电荷的血小板的粘着。另外，在潮湿状态下，在底物框架和生物可吸收物质内的带负电荷的物质通过彼此排斥电荷，吸收水份而膨涨。这种膨涨作用有助于将生物可吸收物质支撑于多孔底物中。由于这种超水合作用，使物质变得不溶解并且不能从修补物的框架内流出来。为了提供吸收物质(如胶原蛋白，明胶，丝蛋白纤维素和壳多糖)的负电荷，琥珀酰化作用和磺化作用是有用的。然而，也可使用其它将负电荷传递给生物可吸收物质的方法。
VEGF和bFGF可以与各种带负电荷的物质结合，尤其该物质至少可捕获到一种下列生物可吸收物质如肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，硫酸皮肤素，透明质酸，琥珀酰化的胶原蛋白等。当用这些物质制备血管修补物时，为了在体内缓慢释放VEGF和bFGF，可将这些细胞因子固定。该方法不仅可应用于血管植入物，而且可应用于任何种类的生物物质，如那些用于促进伤口愈合的物质如伤口敷料(包括那些类似于皮肤的相应的产物)，用于创口愈合的基板(basement templates)和促进伤口愈合和粘连的填塞物。
关于生产本发明心血管壁修补物的方法，可采用下列方法用在22℃时粘度低于或约等于1000mPa′s的生物可吸收物质的悬浮液重复通过管状多孔型修补物的底物，并且通过在修补物内、外之间提供压力差，将生物可吸收物质网缠在修补物底物中，由此生产出保留生物可吸收物质的心血管壁修补物。典型的胶原纤维悬浮液含有胶原蛋白的浓度低于或等于约1.0wt％。通过物理方法如缠结，干燥，热交联，γ照射，紫外照射和由电荷的超水合作用引起的膨涨将网缠住的生物可吸收物质不溶解和/或固定在适当的位置。如果需要，可将被包被的管状修补物切开来提供象纸张一样的修补物。
本发明修补物可用作心脏壁的修补物和血管修补物，但原料及其生产方法也可用于其它领域，如用于组织修补物，伤口敷料和止血药中。
实施例实施例1将长度小于2cm，厚度小于10μm织物血管修补物浸润在带有负电荷的胶原纤维中。全部密封过程如下用琥珀酐将取自牛跟腱的胶原纤维琥珀酰化，并且悬浮在含盐酸或醋酸的PH为4.5的蒸镏水中，制得0.2wt％的胶原蛋白悬浮液。用典型的粘度计测定制得的胶原蛋白悬浮液的粘度，在22℃时为800mPa’s。将织物血管修补物(Dacron聚酯，在120mmHg下，其水孔积率为4,000ml/cm2/min)包裹在氯乙烯袋中并且连接到内含悬浮液的注射器上。用一个三通和一个连接管制成封闭的循环系统。通过用注射器加压注射，使胶原蛋白悬浮液透过织物 血管修补物壁。将透过修补物壁的悬浮液部分用注射器再次注射。将该渗透过程重复几次，胶原纤维缠在修补物的小孔处。将修补物浸于0.1N的碳酸钠溶液中来中和胶原纤维周围残留的酸，并且用蒸留水从里面冲洗数次以便除去腔表面残留的胶原纤维。此后，将修补物在流动的冷水中冲洗24小时，然后冷冻干燥。将修补物在130℃下加热24小时使胶原纤维热交联并且同时消毒该包被的修补物。通过该过程制备由带负电荷的胶原纤维浸润的织物 修补物。
实施例2
按实施例1方法生产的修补物的微观结构及其通透性的评估如下。通过光学显微镜观察修补物的交叉片断，可见胶原纤维包含于聚酯底物纤维的小间隙中。电子扫描显射镜观察显示，聚酯底物纤维和胶原纤维以复杂的或复合的方式缠结。相邻胶原纤维之间的距离约为2μm并且每个胶原纤维的厚度平均约为0.8μm。测定修补物壁中胶原纤维的数量，结果每cm2的修补物捕获约4mg的胶原蛋白。在潮湿条件下，发现胶原纤维约保留100mg/cm2的水。因此，极小量的胶原纤维可以在修补物内侧保留大量的水。水通透性的测定显示，由实施例1得到的修补物具有低孔性，在120mmHg下，其水孔积率为0.1ml/cm2/min。这些结果表明用极小量的胶原纤维和大量的水即可密封移植物。
实施例3缠连在用实施例1方法制备的修补物上的胶原纤维的稳定性评估如下将修补物在流动的蒸馏水中冲洗24小时。结果是尽管长时间冲洗，但没有胶原蛋白从修补物表面脱离的迹象。
实施例4用实施例1方法生产的修补物的血渗漏评估如下将修补物植入没有预先形成血凝块的狗的胸降主动脉中。在外科手术期间及植入后的一周内，修补物未显示通过修补物壁有血渗漏，证明修补物防止血渗漏是安全的。
实施例5用实施例1方法生产的修补物用作心脏壁修补物时，其评估如下将此修补物沿纵向切口，得到作为心脏壁修补物的膜。作为心脏壁修补物，将它植入狗的右心室-肺动脉流出支中。该修补物非常柔软并且柔韧。因此，它容易适应厚的心室壁和薄的肺动脉壁。植入后，将狗全身肝素化(300IU/kg)，但修补物壁未显示任何血液渗漏。从该实验可见，该修补物对于血液的肝素化是安全的，并且证明该修补物是作为心脏壁修补物的适宜的修补物。
实施例6将用实施例1方法生产的修补物(内径10mm，长6cm)植入没有预先形成血凝块的三条狗的胸降主动脉内。植入后，修补物变成红色，但没有血液通过修补物壁渗漏。植入后的第一天，取出三条狗中一条的修补物，该修补物表面覆盖一薄层纤维蛋白。通过光学显微镜可见在聚酯底物纤维的小间隙中稠密的胶原纤维网状物。在胶原蛋白网状物内捕获大量红细胞，白细胞、血小板及纤维蛋白的纤维。腔表面没有血栓沉积。植入后的第十天，从另一条狗中取出第二块修补物。修补物的腔表面是不反光的白色。通过光学显微镜可见，腔表面覆盖薄薄的一层纤维蛋白。在修补物中层含有底物聚酯纤维，胶原纤维和纤维蛋白网状物。在胶原纤维的小间隙中可见一些成纤维细胞。在修补物外侧的四周，有大量成纤维细胞和毛细血管，但没有巨细胞，浆细胞或淋巴细胞，提示在修补物周围没有异体反应。修补物显示出对宿主细胞的高亲和力。植入后六个月，取出第三块修补物。腔表面是反光的白色，没有血栓沉积。通过光学显微镜可见，腔表面整齐地排列着连续的单层内皮细胞。在内皮细胞下面可见多层平滑肌细胞。在修补物壁的内侧，有大量成纤维细胞和毛细血管游走，但没有在刚植入后观察到的胶原纤维。胶原纤维已被吸收了。在外膜一侧，移植物表面完全被包含大量成纤维细胞和毛细血管的结缔组织层所覆盖。在修补物壁的四周及内侧没有异体反应。这些观察证明，本发明修补物是具有良好的形成新内膜性质并且没有异体反应的安全的移植物。
实施例7用实施例1的方法，可得到用胶原蛋白密封的修补物。如实施例4所示，将修补物纵向切开，得到心脏壁修补物。按照实施例5的方法，将三块心脏壁修补物植入狗的流出血管内。分别在手术后的第一天，第十天和第六个月时，将它们取出。通过肉眼和显微镜的方法观察可见，得到类似于实施例6的结果。
实施例8除了用γ照射来代替热交联和下述其它不同之处外，用实施例1类似的方法，用琥珀酰化的atelo collagen来包被长纤维ePTFE修补物的底物。完全密封的处理显示如下通过加压注射，使琥珀酰化的atelocollage的悬浮液(0.2wt％)滤过纤维长为90μm的ePTFE修补物的底物。将该滤过过程重复数次，结果，用atelocollage密封住修补物的孔。将修补物在空气中干燥，然后在潮湿条件下，用2.5Mrad的γ射线照射，同时消毒了修补物。用光学显微镜观察修补物的交叉片断，可见在ePTFE的小间隙中有胶原纤维。通过电子扫描显微镜可见，胶原纤维以复杂的或复合的方式被捕获到ePTFE的小间隙中。相邻胶原纤维之间的距离平均约为2μm。该修补物在120mmHg下的水渗透率为0.1ml/cm2/min。
实施例9
用实施例8的方法生产的修补物上的atelo-collage的稳定性评估如下将修补物在流动的蒸馏水中冲洗24小时。结果是没有胶原蛋白从修补物表面脱离的迹象。
实施例10用实施例8的方法生产的修补物的血液渗漏的评估如下将修补物植入没有用先有技术预先形成血凝块的狗的腹主动脉内的适当位置。在手术期间及植入后的一周内，修补物未显示血液透过修补物壁渗漏。证明，修补物防止血液渗漏是安全的。
实施例11用实施例8方法生产的修补物作为心脏修补物的评估如下将修补物纵向切开，得到作为心脏壁修补物的腹。作为心脏壁修补物，将它植入狗的右心室-肺动脉的流出支内。该修补物非常柔软并且柔韧，因此，它容易适应厚的心室壁和薄的肺动脉壁。植入后，将动物全身肝素化(300IU/kg)，但是修补物的壁上未显示任何血液渗漏。从该实验中可见，修补物对于血液肝素化是安全的，并且证明是作为心脏壁修补物的适宜的修补物。
实施例12将通过实施例8的方法制备的修补物(内径6mm，长6cm)分别植入没有预先形成血凝块的三条狗的腹主动脉内。植入后，修补物马上变成红色，但没有血液透过修补物壁渗漏。在植入后的第一天，取出三条狗中一条的修补物。修补物的表面覆盖薄薄的一层纤维蛋白。通过光学显微镜观察可见，在ePTFE小纤维的小间隙内有胶原纤维稠密的网状物。胶原蛋白网状物捕获大量红细胞，白细胞，血小板和纤维蛋白的纤维。腔表面没有血栓沉积。另外两个移植物分别在植入后的第十天和第六个月取出。通过肉眼和显微镜的方法观察可见，得到类似实施例5的结果。
实施例13用实施例8的方法，得到用胶原蛋白密封的修补物。如实施例5所示，将修补物纵向切开，得到心脏壁的修补物。按照实施例5的方法，将三块心脏壁修补物分别植入狗的流出血管内。将它们分别于手术后的第一天，第十天和第六个月取出。通过肉眼和显微镜的方法观察可见，得到类似实施例5的结果。
实施例14除了用紫外线照射来代替热交联和下述其它不同之处外，用实施例1类似的方法，用琥珀酰化的atelocollagen来包被长纤维ePTFE修补物的底物。完全密封的处理显示如下通过加压注射，将琥珀酰化的atelocollagen的悬浮液(0.2％重量)滤过纤维长为90μm的ePTFE修补物的底物。将该滤过过程重复数次，结果用atelocollagen密封住修补物的孔。将此修补物在空气中干燥，然后在潮湿条件下，用2.5Mrad的紫外线照射，同时将修补物消毒。通过光学显微镜观察修补物的交叉片断，可见在ePTFE的小间隙中有胶原纤维。通过电子扫描显微镜可见，胶原纤维以复杂的或复合方式被捕获到ePTFE的小间隙中。相邻的胶原纤维之间的距离平均约为2μm。修补物在120mmHg下的水渗透率为0.1ml/cm2/min。
实施例15用实施例14的方法制备的修补物上的atelocollagen的稳定性的评估如下将修补物在流动的蒸馏水中冲洗24小时，结果没有胶原蛋白从修补物表面脱离的迹象。
实施例16用实施例14的方法制备的修补物的血液渗漏的评估如下将修补物植入没有用先有技术预先形成血凝块的狗的腹主动脉内。在手术期间及移植后一周内，没有血液透过修补物壁渗漏。证明修补物防止血液渗漏是安全的。
实施例17用实施例14的方法制备的修补物作为心脏壁修补物的评估如下将修补物纵向切开，得到心脏壁修补物的膜。作为心脏壁修补物，将它植入狗右心室-肺动脉的流出支内。修补物非常柔软并且柔韧，因此，它容易适应厚的心壁和薄的肺动脉壁。植入后，将动作全身肝素化(300IU/kg)，但修补物的壁上未显示任何血液渗漏。从该实验中可见，修补物对抗血液肝素化是安全的，并且证明它适宜作心脏壁修补物。
实施例18将用实施例14的方法制备的修补物(内径6mm，长6cm)分别植入没有预先形成血凝块的三条狗的腹主动脉内。植入后，修补物立即变为红色，但没有血液透过修补物的壁渗漏。在植入后的第一天，取出三条狗中一条的修补物。修补物的腔表面覆盖薄薄的一层纤维蛋白。通过光学显微镜观察可见，在ePTFE的小间隙内有稠密的胶原纤维网状物。在胶原纤维网状物内侧捕获大量红细胞，白细胞，血小板和纤维蛋白的纤维，但腔表面没有血栓沉积。另外两个移植物分别于植入后的第十天及第六个月取出。通过肉眼和显微镜方法观察可得到类似实施例5的结果。
实施例19用实施例14的方法，得到用胶原蛋白密封的修补物。如实施例5所示，将修补物纵向切开，得到心脏壁修补物。按照实施例5的方法，将三块心脏壁修补物分别植入狗的流出血管内。将它们分别于手术后的第一天，第十天和第六个月取出。通过肉眼和显微镜的方法观察可见，得到类似实施例5的结果。
实施例20用明胶和肝素作为生物可吸收物质。用实施例8类似的方法，用明胶来包被长纤维ePTFE移植物。再次使用γ照射来使其固定。完全密封的处理方法显示如下将琥珀酰化的明胶悬浮(10wt％)并通过加压注射使其滤过具有90μg纤维长度的ePTFE修补物(类似于实施例1中所使用的方法)。将该滤过过程重复数次，结果用琥珀酰的明胶密封住修补物的孔。然后将修补物冷冻干燥。将1％(重量百分数)肝素溶液灌注于修补物壁内，并再次干燥。在潮湿条件下，用2.5Mrad的γ射线照射，同时消毒该修补物。通过肉眼和显微镜的方法观察可见，得到类似实施例8的结果。所得到的修补物的水渗透率在120mmHg下为0.1ml/cm2/min。
实施例21用实施例20的方法制备的修补物上明胶的稳定性的评估如下将修补物在流动的蒸馏水中冲洗24小时。结果，没有明胶从修补物表面脱离的迹象。
实施例22用实施例20的方法制备的含有肝素的修补物的抗血栓形成性质的评估如下将修补物植入没有预先形成血凝块的狗的腹主动脉内。植入期间及植入后，都没有血液透过修补物壁渗漏。植入后1小时，取出修补物。腔表面没有丝毫的血栓沉积。证明用肝素固定的修补物具有抗血栓形成的性质。
实施例23用琥珀酰化的胶原蛋白和硫酸皮肤素作为生物可吸收物质。用带负电荷的胶原纤维素包被多孔织物血管修补物。用多孔织物血管修补物(Dacron聚酯，在120mmHg下其水孔积率为4，000ml/cm2/min)作为底物。用琥珀酐将取自牛跟腱的胶原纤维琥珀酰化，并且悬浮在含盐酸或醋酸的PH为4.5的蒸馏水中，得到0.2wt％的胶原蛋白悬浮液。通过用注射器加压注射，使胶原蛋白悬浮液滤过多孔织物血管修补物壁。将滤过修补物壁的悬浮液部分用注射器再注射。将该滤过过程重复数次，使得胶原纤维缠绕在修补物的小孔中。然后冷冻干燥。将冷冻干燥的修补物浸于1wt％的硫酸皮肤素中以便将硫酸皮肤素灌注到聚酯底物纤维的小间隙及胶原纤维中。然后，将修补物在空气中干燥。将得到的修补物在130℃下加热24小时，使胶原纤维和硫酸皮肤素热交联，同时消毒修补物。用光学显微镜观察最终得到的修补物的交叉片断，可见在聚酯底物纤维的小间隙内有胶原纤维。电子扫描显微镜显示，底物的聚酯纤维和胶原纤维以复合的或复杂的方式缠结。该修补物具有低孔性，其水孔积率在120mmHg下为0ml/cm2/min。
实施例24用实施例23方法制备的修补物上的胶原蛋白和硫酸皮肤素的稳定性评估如下将修补物在流动的蒸馏水中冲洗24小时。结果，没有胶蛋白和硫酸皮肤素从修补物上脱离下来的迹象。
实施例25用实施例24的方法制备的带有胶原蛋白和硫酸皮肤素的修补物对宿主细胞的亲和力评估如下将修补物植入没有预先形成血凝块的狗的腹主动脉内。在手术期间和术后一周内，没有血液透过修补物壁渗漏。植入后的第十天取出修补物。补修物的腔表面覆盖薄薄的一层纤维蛋白。在吻合部位附近，可见排列成行的内皮细胞。在外膜一侧，大量成纤维细胞自动地游走到聚酯纤维底物的小间隙内。证明用硫酸皮肤素固定的修补物具有极高的宿主细胞亲和力。
实施例26用组织和细胞浸润多孔织物血液修补物。显示修补物壁完全密封，活细胞游走及增生的过程如下所述将取自全身麻醉下实验用狗髂骨的骨髓悬浮于盐的溶液中。在加压下，将悬浮液注入多孔聚酯修补物底物的腔中(在120mmHg下水渗透率为ml/cm2/min)。吸取透过修补物壁的悬浮液部分并且再次注射。重复注射几次后，骨髓及包含在骨髓组织中的血细胞完全占据并密封了修补物底物的壁。然后将修补物植入被抽取骨髓的动物的腹主动脉处。在手术期间及植入修补物后一周内，未见修补物壁出血。植入后三周时，内皮细胞将修补物完全密封住。在移植物的内侧，骨髓细胞存活下来并且合成碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，它是一种细胞因子，可作为毛细血管和成纤维细胞生长的促进因子。按免疫组织化学的方法，用单克隆抗体染色修补物来固定bFGF。在骨髓细胞的周围，可见大量毛细血管，成纤细胞的游走和增殖。在三个月的观察期内可见，在修补物壁中保留有愈合极好的新内膜。
实施例27该实施例是包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的本发明包被修补物的范例。在加压下，将多孔织物血管修补物底物(在120mmHg下水渗透率为1，200ml/cm2/min，由Inter Vascular CoLtd生产)浸润在由1wt％琥珀酰化的胶原蛋白和0.02wt％的肝素组织的混合悬浮液中，冷冻干燥并且在130℃下加热20小时，使得胶原纤维彼此之间以及和肝素分子之间进行热交联。然后在流动的蒸馏水中冲洗，洗掉未结合的肝素。再次冷冻干燥并且用环氧乙烷气体消毒。为了将bFGF固定在血管修补物上，在植入前将它浸入bFGF溶液中。为了测定bFGF的结合情况，将修补物浸入含1μg放射性同位素标记的bFGF的100ml盐溶液中30分钟。然后在500ml纯盐溶液中冲洗30分钟洗三次，以便冲掉游离的，未结合的bFGF。用γ计数器来测定修补物中bFGF的数量。结果表明修补物可结合bFGF0.01μg/cm2。
实施例28该实施例是包含bFGF的本发明包被修补物的范例。在加压下，将多孔聚酯血管修补物底物(在120mmHg下水渗透率为1，200ml/cm2/min)浸润在由1wt％琥珀酰化的胶原蛋白和0.02wt％的肝素组成的混合悬浮液中。冷冻干燥并且在130℃下加热20小时，使得胶原纤维彼此之间以及和肝素分子之间进行热交联。然后在流动的蒸馏水中冲洗，以便洗掉多余的，未结合肝素。再次冷冻干燥并且用环氧乙烷气体消毒。在手术室，将它浸在含1μg bFGF的100ml盐溶液中30分钟，并且在500ml盐溶液中冲洗30分钟，洗三次，以便洗掉未结合的bFGF。然后作为血管替代物，将它植入腹主动脉处。在手术期间及术后一周内，没有透过修补物壁出血。在第三周，移植物壁上覆盖着由排列整齐的内皮细胞构成的新内膜。在修补物壁的内侧，存在大量毛细血管，它促进新内膜的形成。
实施例29该实施例是可用作伤口敷料的海绵样物质形状的本发明包被修补物的范例。用下列方法可得到由纤维状胶原蛋白制备的多孔海绵。将含0.02wt％肝素的1wt％的胶原蛋白冷冻干燥5cm2并且厚0.5cm的胶原蛋白片。在130℃下加热20小时，使得胶原纤维彼此之间以及和肝素分子之间进行交联。然后用流动馏水冲洗，洗掉未结合的肝素。再次冷冻干燥，用环氧乙烷气体消毒。为了进行动物试验，在免子后背切开7cm2的伤口。将制备的胶原蛋白海绵浸于含1μgbFGF的100ml盐溶液中30分钟，并且用500ml盐溶液溃洗30分钟，洗三次，以便洗掉未结合的bFGF。然后，将它植入所制备伤口正下方的皮下层。植入后一周，在胶原蛋白片的内侧，可见大量毛细血管。也含有大量成纤维细胞。随着毛细血管和成纤细胞的游走。促进皮肤伤口的愈合。在伤口底部产生粉色的肉芽组织。
用同样的方法制备对照伤口，但未植入bFGF的胶原蛋白海绵，则伤口处肉芽未形成。对照伤口显示愈合迹象，但只限于伤口边缘。
实施例30该实施例是用作伤口敷料的海绵样物质形式的本发明包被修补物的范例。用下列方法，得到用胶原纤维制备的多孔海绵。将含0.02wt％肝素的1wt％的胶原蛋白冷冻干燥，得到5cm2并且厚0.5cm的胶原蛋白片。冷冻干燥并且在130℃下加热20小时，使得胶原纤维彼此之间以及和肝素分子之间进行热交联。然后用流动的蒸馏水冲洗，洗掉未结合的肝素。每次冷冻干燥并且用环氧乙烷消毒。为了动物试验，在免子的背部节开7cm2的皮肤伤口。将制得的胶原蛋白海绵浸入含有bFGF的50ml盐溶液中30分钟，并且用500ml盐水冲洗30分钟，洗三次，洗掉未结合的bFGF。然后，将海绵的悬浮液。将此悬浮液注入所制备的皮肤伤口正下方下的皮下层。植入后一周，可见在注射胶原蛋白悬浮液的区域有大量毛细血管。胶原海绵几乎全被吸收，但仍有悬浮的胶原海绵的碎片保留在皮下层。也含有大量成纤维细胞。随着毛细血管及成纤维细胞的游走，促进皮肤伤愈合。在伤口的底部产生粉色肉芽组织。
用同样方式制备，但没有注射胶原蛋白海绵悬浮液的对照伤口没有肉芽形成。伤口有愈合的迹象，但只限于伤口的边缘。
权利要求
1.包含用物理方法固定和使之不溶解的生物可吸收物质的修补物。
2.权利要求1的修补物，其中物理方法不包括使用化学试剂。
3.权利要求1的修补物，其中物理方法至少为下列中的一种缠结，干燥，热交联，γ照射，紫外照射和由电荷水合引起的膨涨。
4.权利要求1的修补物，它进一步包含结合在生物可吸收物质上的生长因子。
5.权利要求1的修补物，它包含一种以上生物可吸收物质。
6.权利要求1的修补物，其中生物可吸收物质选自胶原蛋白，明胶，琥珀酰化的胶原蛋白，硫酸软骨素，琥珀酰化的明胶，壳多糖，纤维素，丝蛋白，白蛋白，藻酸，肝素，硫酸乙酰肝素，透明质酸，硫酸皮肤素，上述物质的衍生物和哺乳动物的细胞和组织。
7.权利要求1的修补物，其中生物可吸收物质带有正或负电荷。
8.权利要求1的修补物，其中物理方法是通过在约100℃-180℃的温度下，将生物可吸收物质加热约1-48小时来进行热交联。
9.权利要求1的修补物，其中物理方法是通过用约0.1Mrad-5Mrad范围的γ射线照射生物可吸收物质来进行γ照射。
10.权利要求1的修补物，其中物理方法是超水合作用，它包括使生物可吸收物质带上负电荷并且使带负电荷的生物可吸收物质与水接触。
11.权利要求1的修补物，其中物理方法是通过用约0.1Mrad-5Mrad的紫外线照射生物可吸收物质来进行紫外照射。
12.权利要求1的修补物，它包含将生物可吸收物质固定在其上面的多孔底物。
13.权利要求12的修补物，它进一步包含结合在生物可吸收物质上的生长因子。
14.权利要求12的修补物，其中生物可吸收物质具有长小于2cm并且宽约10μm的细丝形状。
15.权利要求12的修补物，其中生物可吸收物质选自胶原蛋白，明胶，琥珀酰化的胶原蛋白，硫酸软骨素，琥珀酰化的明胶，壳多糖，纤维素，丝蛋白，白蛋白，藻酸，肝素，硫酸乙酰肝素，透明质酸，硫酸皮肤素，上述物质的衍生物和哺乳动物的细胞和组织。
16.权利要求12的修补物，其中多孔底物为聚酯纤维的多孔管并且生物可吸收物质为琥珀酰化的胶原纤维，通过将琥珀酰化的胶原纤维与多孔底物缠结，然后在约100℃-180℃下加热约1-48小时来制备修补物。
17.权利要求12的修补物，其中多孔底物为聚酯纤维的多孔管并且生物可吸收物质为琥珀酰化的胶原纤维，通过用多孔底物使琥珀酰化的胶原纤维固定，然后用约0.1Mrad-5Mrad的γ射线照射缠结了琥珀酰化的胶原纤维的多孔底物来制备修补物。
18.权利要求12的修补物，其中多孔底物为展开的聚四氟乙烯管并且生物可吸收物质是琥珀酰化的胶原纤维，通过用多孔底物使琥珀酰化的胶原纤维固定，然后在约100℃-180℃下加热1-48小时来制备修补物。
19.权利要求12的修补物，其中多孔底物为展开的聚四氟乙烯管并且生物可吸收物质为琥珀酰化的胶原纤维，通过用多孔底物缠结琥珀酰化的胶原纤维，然后用约0.1Mrad-5Mrad的γ射线照射缠结琥珀酰化胶原纤维的多孔底物来制备修补物。
20.权利要求12的修补物，其中物理方法是超水合作用，它包括使生物可吸收物质带上负电荷并且使带负电荷的生物可吸收物质与水接触。
21.权利要求12的修补物，其中多孔底物为聚酯纤维的多孔管并且生物可吸收物质是琥珀酰化的胶原纤维，通过用多孔底物缠结琥珀酰化的胶原纤维，然后用约0.1Mrad-5Mrad紫外线照射缠结琥珀酰化胶原纤维的多孔底物来制备修补物。
22.权利要求12的修补物，其中多孔底物是在其上面固定生物可吸收物质的生物可吸收材料并且生物可吸收物质和生物可吸收材料选自胶原蛋白，明胶，琥珀酰化的胶原蛋白，硫酸软骨素，琥珀酰化的明胶，壳多糖，纤维素，丝蛋白、白蛋白、藻酸，肝素，硫酸乙酰肝素，透明质酸，硫酸皮肤素，上述物质的衍生物和哺乳动物的组织和细胞。
23.生产修补物的方法，它包含步骤(1)提供多孔底物，(2)制备至少一种生物可吸收物质的溶液或悬浮液，该物质在22℃下粘度小于1000mPa，(3)通过将溶液或悬浮液放到修补物的一侧使溶液或悬浮液通过修补物并且施加压力将生物可吸收物质捕获或缠结在多孔型底物内，(4)干燥得到的修补物，和(5)用非化学试剂处理干燥的修补物，使生物可吸收物质固定在多孔物质上。
24.权利要求23的方法，其中用同一生物可吸收物质或其它生物可吸收物质的溶液或悬浮液来重复步骤(2)～(4)。
25.权利要求23的方法，其中处理步骤(5)是在约100℃-180℃下热交联约1-48小时。
26.权利要求23的方法，其中处理步骤(5)是用约0.1-5.0Mrad范围的γ射线来处理。
27.权利要求23的方法，它另外包含步骤(6)，即，修补物与生长因子接触，使生长因子结合在修补物上。
28.权利要求23的方法，其中处理步骤(5)是用约0.1-5.0Mrad范围的紫外线来处理。
29.权利要求23的方法，其中步骤(2)和(3)包括使生物可吸收物质带上负电荷，并且步骤(5)包括用水处理来使修补物膨涨。
全文摘要
本发明涉及包含一种或多种生物可吸收物质的修补物，其中生物可吸收物质通过不包括化学试剂的物理方法不溶解和/或固定在适当的位置。生长因子可结合到生物可吸收物质上来刺激例如成纤维细胞和内皮细胞在修补物周围或进入修补物内生长。本发明修补物无血液渗漏并且由于植入后早期迅速产生具有内皮细胞层的新内皮，提供极好的抗血栓形成性。
文档编号A61L27/34GK1142974SQ9610425
公开日1997年2月19日 申请日期1996年3月20日 优先权日1995年4月25日
发明者野一色泰晴 申请人:有限会社耐斯