含有高浓度的异黄酮并具有高溶解度的组合物及其制备方法

专利名称：含有高浓度的异黄酮并具有高溶解度的组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种含有异黄酮的组合物，尽管它具有高的纯度，但是其在水中高度溶解，本发明还涉及一种制备该组合物的方法。
背景技术：
在大豆中所发现的异黄酮主要包括游离的异黄酮甙，例如黄豆甙、染料木甙以及大豆异黄铜；丙二酰基异黄酮甙，例如6”-O-丙二酰基黄豆甙、6”-O-丙二酰基染料木甙和6”-O-丙二酰基大豆异黄铜；乙酰基异黄酮甙，例如6”-O-乙酰基黄豆甙、6”-O-乙酰基染料木甙和6”-O-乙酰基大豆异黄铜；以及异黄酮甙元，例如黄豆苷元、染料木素和黄豆黄素。
异黄酮是大豆中的活性成分，其具有多种活性，例如减轻骨质疏松症和更年期综合症，并且被广泛应用，例如，用作健康食品的添加剂。因此，为了有效地摄取异黄酮，已开发出许多提取和纯化异黄酮的方法。
JP-A 62-126186(专利文件1)披露了一种方法，其包括用水溶性有机溶剂回流提取豆汁或大豆而获得提取物、让提取物与例如苯乙烯-二乙烯基苯聚合物树脂的合成吸附树脂接触、然后用水溶性有机溶剂(例如，乙醇或70％甲醇)从树脂上洗下异黄酮。在专利文件1中，尽管对用于提取的水溶性有机溶剂的浓度没有详细的说明，但是在实施例2中所用的是80％乙醇水溶液。然而，专利文件1的目的是低成本地获得大量的异黄酮，因此没有关注所得组合物在水中的溶解性。
JP-A 8-283283(专利文件2)披露了一种纯化丙二酰基异黄酮甙的方法，包括用水提取大豆而得到提取物、将提取物与合成吸附树脂接触、然后用例如20-50％乙醇水溶液从树脂上洗下异黄酮甙。专利文件2规定合适的提取温度为45至65℃。专利文件2的目的是纯化具有相对高亲水性的丙二酰基异黄酮甙。然而，由于用水提取，异黄酮的提取率低，并且这样也不能得到含高浓度的异黄酮的组合物。此外，关于所得组合物在水中的溶解性，也没有描述。
专利文件1和2披露的方法所得到的组合物含低浓度的异黄酮，并且在水中的溶解性也不令人满意。
JP-A 2002-80474(专利文件3)披露一种得到游离的异黄酮甙部分的方法，包括用低级醇的水溶液(例如，70％乙醇)在室温至80℃下提取大豆胚轴得到提取物、将提取物与具有相同颗粒尺寸的阴离子交换树脂接触、用水冲洗树脂、然后用例如70％乙醇水溶液从树脂上洗脱游离的异黄酮甙。通过用阴离子交换树脂纯化所得到的组合物含有高浓度的异黄酮，也就是，含60％或更多。然而，由于是具有低溶解性的游离异黄酮甙的纯化产品，该组合物在水中溶解性差，因而在水溶液中存在稳定性的问题。
因此，专利文件1到3所披露的方法不能提供一种能被加到饮料中的具有高浓度的异黄酮并具有高溶解性的组合物。
这样的问题是由异黄酮本身的低溶解性所引起的。例如，黄豆甙的溶解度仅大约为3.3mg/100ml。JP-A 10-298175(专利文件4)披露了一种提高异黄酮水溶解性的方法，包括用70-90％醇水溶液在约70℃下回流提取大豆胚轴得到提取物，将提取物与合成吸附树脂接触，用30-80％醇水溶液洗脱树脂得到含有异黄酮的组合物，然后含有异黄酮的组合物与环糊精形成包合物。由于该方法需要向异黄酮提取物中加入至少等摩尔量的环糊精，最终产品中的异黄酮含量大为降低。而且，由于最终产品的溶解性取决于环糊精本身的溶解性，在使用时，需要通过加热来溶解包合物的步骤，此外，在更高浓度时，包合物也不能被溶解。
JP-A 2000-327692(专利文件5)披露了一种增加溶解性的方法，包括通过在α-甙糖化合物存在下甙转移酶的作用而形成α-甙异黄酮。然而，由于需要加入至少等摩尔量的糖化合物，该方法也存在降低异黄酮含量的问题。
因此，有必要开发一种含有异黄酮的组合物，其具有高的纯度，在水中在高浓度下，能以自然方式被稳定地溶解，不需要使用任何的例如环糊精的助溶剂，或任何的例如糖化合物的附加剂，因而适用于饮料等等。
参考资料专利文件1JP-A 62-126186
专利文件2JP-A 8-283283专利文件3JP-A 2002-80474专利文件4JP-A 10-298175专利文件5JP-A 2000-327692发明内容本发明所要解决的问题本发明要提供一种新的含有异黄酮的组合物，尽管其具有高的纯度，但是在水中以自然状态具有高溶解性，不需要加入任何的助溶剂或应用任何的化学改性剂，本发明还提供一种生产该含有异黄酮组合物的方法。
解决所述问题的办法本发明者深入地研究，结果从大豆胚轴中制得一种含有异黄酮的组合物，其含有特定比例的丙二酰基异黄酮甙、除了丙二酰基异黄酮甙的异黄酮甙以及皂甙，后来发现该含有异黄酮的组合物令人惊讶地含有高浓度的异黄酮并且具有显著的高溶解性。此外，本发明人发现该含有异黄酮的组合物能够通过用醇水溶液在特定的温度范围内提取大豆胚轴、用非极性的合成吸附树脂吸附所得的提取物、然后用特定醇浓度的醇水溶液洗脱树脂而制得，作为一种特别优选的制备方法。
也就是，本发明披露了下列发明(1)一种含有异黄酮的组合物，其包括15-95％重量的丙二酰基异黄酮甙、0-50％重量的除了丙二酰基异黄酮甙的异黄酮以及5-60％重量的皂甙，将所述的组合物中异黄酮和皂甙的总量之和定为100％重量；(2)依照上述(1)的含有异黄酮的组合物，它是以大豆胚轴作为起始原料而制得的；(3)依照上述(1)的含有异黄酮的组合物，其中在皂甙中A组皂甙的比例为55％重量或更多，在所述的组合物中皂甙的总量为100％重量；(4)依照上述(1)的含有异黄酮的组合物，在25℃时，其水溶解度基于异黄酮的数量为20mg/100ml(5)一种生产依照上述(2)的含有异黄酮的组合物，包括在10-50℃下用15-95％体积的乙醇水溶液提取大豆胚轴的步骤；
(6)一种生产依照上述(2)的含有异黄酮的组合物，其包括步骤(A)在10-50℃下用15-95％体积的乙醇水溶液提取大豆胚轴得到提取物；(B)使(A)步骤所得到的提取液与非极性的吸附树脂接触，使异黄酮吸附于树脂上；和(C)用15-40％体积的乙醇水溶液从吸附树脂上洗脱异黄酮；(7)一种可食用的组合物，含有依照上述(1)的含有异黄酮的组合物；和(8)一种分离异黄酮和皂甙的生产工艺，其包括在10-50℃下用15-95％体积的乙醇水溶液提取大豆胚轴得到提取物，将提取物水溶液与非极性的吸附树脂接触，用15-40％体积的乙醇水溶液从吸附树脂上洗脱含有异黄酮的部分，然后用65-90％体积的乙醇水溶液从吸附树脂上洗脱含皂甙的部分。
发明的效果本发明能够提供一种含有异黄酮的组合物，其具有高的溶解性，并包含没有加任何的溶解助剂或没有应用任何的化学改性剂的以自然形态存在的高浓度异黄酮，并且与被认为在水中易溶的常规的含有异黄酮组合物相比，所述的组合物在水中具有高度的溶解性。
发明的最佳实施方式本发明的含有异黄酮组合物优选在总固体成分中包含25-95％重量的异黄酮，更优选25-60％重量，还更优选30-60％重量，最优选40-60％重量。
本发明的含有异黄酮组合物具有下列三个特征，其中在所述的组合物中所包含的异黄酮和皂甙的总量之和被定为100％1、丙二酰基异黄酮甙的含量为15-95％重量，更优选20-90％重量，还更优选25-85％重量，最优选30-80％重量；2、除丙二酰基异黄酮甙外的异黄酮的含量(举例来说，异黄酮甙、乙酰基异黄酮甙、异黄酮甙元等等，也就是，从所有异黄酮的总量中减去丙二酰基异黄酮甙的量后的数量)，为0-50％重量，更优选0-45％重量，还更优选0-40％重量，最优选0-30％重量；和3、皂甙的含量为5-60％重量，更优选10-50％重量，还更优选15-45％重量，最优选为20-40％重量。
通过使用在上述范围内的成分百分数，可制得含有异黄酮的组合物，尽管其包含高浓度的异黄酮，其在水中具有高溶解性，而且溶解之后，既便在冷藏下也保持高度稳定性。
只要在上述所述的范围之内，本发明的含有异黄酮组合物的成分百分数没有被特别限制。更具体地，除了异黄酮和皂甙之外，本发明的含有异黄酮的组合物可包含基于总固体成分的8-20％重量的蛋白质，以及还可包含糖。更优选皂甙的含量为异黄酮含量的1/4至3/4重量。
大豆皂甙包括A组皂甙、B组皂甙、E组皂甙等等。将所述的组合物中皂甙的总量定为100％重量，在本发明的含有异黄酮的组合物中所包含的皂甙中A组皂甙的合适比例为至少55％重量，更优选至少60％重量。
在本发明的含有异黄酮组合物中，异黄酮在水中的溶解度为25℃时至少20mg/100ml，优选50-1200mg/100ml，更优选100-1200mg/100ml，还更优选500-1200mg/100ml。本发明的含有异黄酮组合物不但具有高溶解性，而且如上所述的高浓度溶液甚至冷藏(10℃或更低)一段时间也不形成沉淀和变得混浊。在本发明中，“溶解度”被定义为在25℃时在100ml的水中能够溶解的溶质的最大数量(g)，并以异黄酮的量(mg)表示。
本发明的含有异黄酮组合物可以含有例如环糊精或淀粉琥珀酸辛酯的助溶剂，使不溶的物质溶解，或可以含有亲水性糖化合物，通过糖转移酶等的作用，使组合物中的异黄酮和糖化合物粘结。然而，加入这样的添加剂不是必需的，并且优选避免加入这样的添加剂。这是因为当加入这样的添加剂时，异黄酮在所得到的组合物总固体成分中的比例下降，并且，当组合物含环糊精时，由于环糊精在室温时低的溶解性，如果不加热，所得到的组合物几乎不溶解。因此，如果加入助溶剂，优选所加入的量少于含有异黄酮组合物中所含的异黄酮的量。
上面所述的本发明的含有异黄酮组合物是含高浓度的异黄酮并具有高溶解性的组合物，并且也是新的天然原料，其不需要加入任何的助溶剂和化学改进剂。还不能解释本发明的含有异黄酮组合物不顾组合物含有高浓度的通常在水中溶解性不好的异黄酮的事实而具有高溶解性的原因。换句话说，还不能说明增溶的机理。然而，看来在大豆胚轴中所含的按特定量共存的除皂甙和异黄酮以外的成分与异黄酮相互作用，由此而使异黄酮变得高度溶解。
下文中将描述制备本发明的含有异黄酮组合物的方法方面。
(用于提取的起始原料)用于提取本发明的含有异黄酮组合物的起始原料包括但不限于整个大豆、脱脂大豆、分离后的大豆蛋白、大豆凝乳废物(okara)等等。优选使用大豆胚轴。大豆胚轴的异黄酮含量占总固体成分重量的1-2％，这比大豆种子中含量10倍还要多。因此，大豆胚轴是用来获得具有高的纯度的含有异黄酮组合物的优选原料，并对于获得具有高溶解性的含有异黄酮组合物来说也是重要的。尽管溶解性和皂甙组分之间的关系是未知的，A组皂甙占大豆胚轴的总皂甙重量比例为60％或更多而B组皂甙的比例更低。在大豆胚轴与大豆子叶中这样的皂甙组分(A组∶B组的比例)是不同的。制备大豆胚轴的方法没有特殊的限制，例如通过去除大豆的表皮、然后将其粗粗地碾压便可以将其容易地分离出。优选地，这样得到的大豆胚轴通过筛分，提高了胚轴的纯度。作为选择，也可使用被作为“大豆胚轴”或“大豆微生物”而出售的商业性产品。为了改善其香味等，对大豆胚轴进行预处理，例如加热处理。然而，通过加热，丙二酰基异黄酮甙可能转化为游离的甙，并在这情况下，将异黄酮从其他成分例如皂甙中分离出来变得困难。因此，优选使用未加工过的大豆胚轴或微热处理后的大豆胚轴。也可以使用全脂大豆或脱脂大豆。然而，它们的异黄酮含量低，所以获得所要纯度的异黄酮是费时和费钱的。因此，大豆胚轴是优选的(提取溶剂)作为从大豆胚轴中提取异黄酮的溶剂，可以使用水溶性的含醇有机溶剂，例如乙醇、甲醇或丙醇。考虑到用于食品，优选使用乙醇。提取溶剂的醇浓度优选为15-95％体积，更优选30-90％体积，还更优选40-85％体积，并最优选为60-80％体积。当醇浓度太低时，异黄酮难于被提取出，导致异黄酮的产率下降，另外，在大豆胚轴所天然含的β-甙酶的作用下，在提取过程中，如大豆甙和染料木甙和丙二酰基异黄酮甙的异黄酮甙将趋于转化成如大豆甙元和染料木素的异黄酮甙元，以至于难于获得具有高溶解性的含有异黄酮组合物。当醇浓度太高时，异黄酮的产率下降，此外，产品的成本提高。因此，这样的高浓度醇水溶液是不合适的。
(提取温度)在本发明中，提取温度10至50℃是重要的，更优选20至40℃。由于室温在上述温度范围内，所以没有必要说可以在室温下进行提取。当提取温度太低时，提取的效率下降。相反，当提取的温度太高时，丙二酰基异黄酮甙发生热降解然后转变成游离的异黄酮甙，结果难于获得在25℃时具有高溶解性的含有异黄酮组合物。以胚轴作为起始原料，通过用如上所述的特定浓度的溶剂并在特定的温度下提取，异黄酮能以80％或更多的高产率以高浓度的含有异黄酮的溶液形式被提取得到，其取决于提取的条件。为了提高异黄酮的产率，上述所述的提取步骤优选被重复不止一次。
(吸附剂的处理)上述所述的提取步骤所获得的异黄酮粗提取物，经过纯化而得到具有高溶解性并含高浓度的异黄酮的含有异黄酮组合物。第一步纯化包括将粗提取物溶于水中，如必要的话，将粗提取物与非极性吸附树脂。由于通过上述所述的提取步骤所获得的提取物含有醇，如有必要的话，优选将其进行预处理，例如除去醇并浓缩。由于起始原料中所含的油脂在提取溶剂的醇浓度高时可能被提取出来，起始原料或提取物可以被脱脂。所使用的非极性吸附树脂优选包括非极性的合成吸附树脂，例如HP-20(Mitsubishi化学公司所制造)、SP-825(Mitsubishi化学公司所制造)、Amberlite XAD-2和XAD-4(Rohm和Haas公司所制造)、以及Duolite S-861和S-862(Sumitomo化学工业公司所制造)，它们为多孔苯乙烯-二乙烯基苯树脂。极性阳离子交换树脂Duolite C26A(Sumitomo化学工业公司所制造)，以及阴离子交换树脂WA-30(Mitsubishi化学公司所制造)，由于它们不吸附异黄酮或所得的异黄酮原料的低溶解性，所以是不合适的。通过将吸附树脂放入罐中，或者将吸附树脂装入柱中，来对吸附剂进行批处理。从产率和生产力角度来说，最好是将粗提取物的水溶液通过装有树脂的树脂柱。
(含有异黄酮组合物的洗脱)
下一步，用含醇有机溶剂的水溶液从吸附于吸附树脂的片段中选择性地洗脱并收集特定的异黄酮。含醇有机溶剂的水溶液优选为乙醇水溶液。在本发明中，重要的是洗脱溶剂的乙醇浓度为15-40％体积，更优选为20-35％体积。当乙醇浓度太低时，需要大量的溶剂来收集异黄酮组合物，并且异黄酮不好被洗脱下来，结果在所得的组合物中异黄酮的浓度降低。当乙醇浓度太高时，除异黄酮以外的大量的杂质，例如皂甙，将要被洗脱下来，结果所得的组合物中异黄酮的纯度下降，此外，具有低水溶性的非极性物质，例如异黄酮甙元，也要被洗脱下来，结果不能获得具有高溶解性的异黄酮片段。
(含有异黄酮组合物的生产方法)通过上述所述的产品制备方法而获得的含有异黄酮组合物在被加热之后，减压蒸发以除去有机溶剂，然后进行浓缩，浓缩物可被用作为“异黄酮提取物”，或通过喷雾干燥、冷冻干燥等制成粉末。这样所获得的含有异黄酮的组合物为包含高浓度异黄酮的新的含有异黄酮组合物，并具有非常高的溶解性，其中异黄酮浓度占总的固体成分重量的25-95％，并且在25℃时水溶解度至少基于异黄酮的数量为20mg/100ml。
(酸沉淀处理)上述所述方法获得的含有异黄酮组合物可在常用的浓度范围内被应用，例如，基于异黄酮的量为20mg/100ml。然而，当含有异黄酮的组合物以高浓度被加到酸性食物或饮料中时，可事先将含有异黄酮的组合物的pH调整到酸性范围，接着除去所产生的不溶性物质(例如，蛋白质)，以提高溶液的澄明度。可用可食用无机酸或有机酸来调节pH值，例如可用盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、马来酸、柠檬酸或抗坏血酸维生素C。含有异黄酮组合物的pH可被调到要加入的食物或饮料的pH或更低，通常为pH4或更低，优选pH3.5或更低。然后，将含有异黄酮的组合物在酸性pH下保持一段预定的时间。在整个时间过程中，组合物在室温或更低温度下，优选10℃或更低温度下，保持稳定。大豆胚轴等提取物通常包含蛋白质和异黄酮。当提取物中的蛋白质在酸性条件下沉淀时，其沉淀通常趋向于与异黄酮的沉淀相结合(共沉淀)。然而，在本发明中，由于用醇提取并用吸附树脂纯化，降低了本发明的含有异黄酮提取物中蛋白质的含量，从而避免发生这样的共沉淀。可通过像过滤和离心的常规固-液分离方法来从不溶性物质中分离出异黄酮。
(含皂甙组分的洗脱)在本发明中，在用15-40％体积的乙醇水溶液从非极性吸附树脂洗出含有异黄酮组分之后，主要包含皂甙的组分仍然被吸附在树脂上。用更高浓度的醇能够洗脱含皂甙的组分，优选用60-95％体积、更优选65-90％体积的乙醇水溶液来得到皂甙含量占总固体成分重量的40％或更多的含皂甙组合物。如上所述，通过在特定温度下获得提取物、将提取物吸附于非极性吸附树脂上并接着用不同浓度的醇水溶液从树脂上洗出组分而有效地分离含高浓度的异黄酮并具有高溶解性的异黄酮组分以及含高浓度皂甙的皂甙组分，并由此能够提供含高浓度皂甙的皂甙原料。
(食物的适用性)由于含有异黄酮的组合物含高浓度的异黄酮，所以通过仅仅加入少量的如此获得的含有异黄酮的组合物到像药品、食品和饮料的各种可食用的组合物中，便能够向摄取所述的可食用的组合物的人提供大量的异黄酮。而且，由于在含有异黄酮的组合物中同时含有皂甙，异黄酮和皂甙两成分能够有效地被吸收。由于含有异黄酮的组合物是高度溶解的，在液体药物和食物方面，其特别有效。该含有异黄酮的组合物可以以如片剂或胶囊的固体形式被供应。通过利用其高溶解性，该含有异黄酮的组合物也可以以如一份的浓缩液形式被供应，因而可被用作例如果酱和沙司的调味品的成分。
在本发明中，根据日本健康食品和营养品食品协会所制订的大豆异黄酮标准分析方法来进行异黄酮的分析。通过下面所述的薄层色谱来测定皂甙，通过Kjeldahl方法来测定蛋白质。
(异黄酮的定量方法)精确称取1到10mg的异黄酮样品，并向样品中加入25ml的70％(V/V)乙醇。在室温下搅动30分钟提取之后，对提取物进行离心。用上述同样的方法再提取残余物两次。合并三次的提取液，用70％(V/V)乙醇调整体积为100ml，然后用0.45μm的PVDF滤纸过滤，得到供试溶液。在异黄酮的确认试验中，供试溶液的峰的确认是通过与12种标准品，即大豆甙、染料木甙、大豆异黄铜、大豆甙元、染料木素、黄豆黄素、丙二酰基大豆甙、丙二酰基染料木甙、丙二酰基大豆异黄铜、乙酰基大豆甙、乙酰基染料木甙以及乙酰基大豆异黄铜(均由Waco Pure化学工业研究所制备的)相比较，具有大约相同的保留时间，进行确认。在含量测定方面，通过使用大豆甙标准品作为内标，来测定供试溶液中12种异黄酮的浓度(等量转换为大豆甙)。通过将所得的值乘以下列数量因子来计算真正的异黄酮的浓度大豆甙(1.000)、染料木甙(0.814)、大豆异黄铜(1.090)、丙二酰基大豆甙(1.444)、丙二酰基染料木甙(1.095)、丙二酰基大豆异黄铜(1.351)、乙酰基大豆甙(1.094)、乙酰基染料木甙(1.064)以及乙酰基大豆异黄铜(1.197)、大豆甙元(0.583)、染料木素(0.528)、以及黄豆黄素(0.740)。从所有异黄酮浓度的之和测得异黄酮的总量。供试溶液和标准溶液的HPLC条件如表1所示。
(表1)HPLC条件

(皂甙的测定)精确称取样品，用乙醇搅动1小时提取，然后离心得到提取液。再重复该操作。合并所得的提取液，将合并后溶液的体积调到预定的体积。将该样品溶液在薄层色谱(TLC)板上点样。样品点的Rf值与皂甙标准品的Rf值相比较，以确认样品中有皂甙斑点。通过使用事先用皂甙标准品而制得的标准曲线，测得斑点面积的积分值，这样便测得皂甙的量。薄层色谱的条件如表2所示。
(表2)TLC条件

实施例在下文中，通过不限制本发明的技术范围的实施例，来解释本发明。
实施例1向500g的未加工的大豆胚轴中加入2.0L的70％体积的乙醇水溶液，在30℃下搅动混合物8小时进行提取。通过过滤分离提取液之后，按上述所述的方法，用2.0L的70％体积的乙醇水溶液再提取残余物一次。合并两次提取溶液。
在40℃下，减压浓缩该合并后的提取液，以完全除去有机溶剂。将所得的粗提取物溶于水中，并在SV2时加到装有非极性合成吸附树脂Diaion HP-20(由Mitsubishi化学公司所制造的)的柱上。然后，用30％体积乙醇水溶液洗脱柱子，得到异黄酮馏份。该馏份被在40℃下减压浓缩、干燥并粉碎，得到15g的含有异黄酮的组合物。在所得的含有异黄酮的组合物中异黄酮的含量为占总固体成分重量的48.0％。该组合物也含23.8％的皂甙和14.1％的蛋白质。
试验实施例1提取溶剂中乙醇浓度的研究除提取溶剂的乙醇浓度按表3所示变化外，用与实施例1相同的方法提取大豆胚轴，并测定所得的提取物中异黄酮的相对比例变化以及从大豆胚轴中提取异黄酮的产率。结果如表3所示。
(表3)乙醇提取液的异黄酮的相对比例以及异黄酮的产率

*Mal-ISO丙二酰基异黄酮甙Ac-ISO乙酰基异黄酮甙ISO异黄酮甙Agl异黄酮甙元当提取溶剂的乙醇浓度为10％体积时，异黄酮的产率会下降，异黄酮甙元的量会增加，并且丙二酰基异黄酮甙的量会迅速下降。这很可能是因为大豆胚轴中的β-甙酶由于乙醇浓度低而对丙二酰基异黄酮甙起作用并导致丙二酰基异黄酮甙降解为甙元。当乙醇浓度为100％体积时，异黄酮的产率会迅速下降，异黄酮甙的量会增加，并且丙二酰基异黄酮甙的量会迅速下降。因此，提取溶剂中合适的乙醇浓度至少为15-95％体积，优选为30-90％，更优选为40-85％体积，最优选为60-80％体积。
比较实施例1高温下用乙醇提取向500g的未加工的大豆胚轴中加入1.5L的70％体积的乙醇水溶液，在70℃下加热回流提取混合物8小时。通过过滤分离提取液之后，按上述所述的方法，残余物用1.5L的70％体积的乙醇水溶液再提取一次。合并两次提取溶液。
在60℃下，减压浓缩该合并后的提取液，完全除去有机溶剂。将所得的粗提取物溶于水中，并在SV2时加到装有非极性吸附树脂HP-20(由Mitsubishi化学公司所制造的)的柱(100mL)上。用30％体积乙醇水溶液洗脱柱子，得到异黄酮馏份。该馏份在60℃下减压浓缩、干燥并粉碎，得到20g的含有异黄酮的组合物。在所得的含有异黄酮的组合物中异黄酮的含量为占总固体成分重量的38％。皂甙含量占总固体成分重量的18％。
比较实施例2用高浓度乙醇提取除了用来从柱子上洗脱异黄酮的乙醇水溶液的浓度为70％体积外，按实施例1的相同方法得到异黄酮馏份。该馏份在60℃下减压浓缩、干燥并粉碎，得到30g的含有异黄酮的组合物。在所得的含有异黄酮的组合物中异黄酮的含量为占总固体成分重量的20.7％。皂甙含量占总固体成分重量的33％。
比较实施例3高温提取、阴离子树脂以及用高浓度乙醇洗脱向500g的未加工的大豆胚轴中加入1.5L的70％体积的乙醇水溶液，在70℃下加热回流提取混合物8小时。通过过滤分离提取液之后，按上述所述的相同方法，残余物用1.5L的70％体积的乙醇水溶液再提取一次。合并两次提取溶液。
在60℃下，减压浓缩该合并后的提取液，完全除去有机溶剂。将所得的粗提取物溶于水中，并在SV2时加到装有阴离子交换树脂WA-30(由Mitsubishi化学公司所制造的)的柱(100mL)上。然后用70％体积乙醇水溶液洗脱柱子，得到异黄酮馏份。该馏份在60℃下减压浓缩、干燥并粉碎，得到6g的含有异黄酮的组合物。在所得的含有异黄酮的组合物中异黄酮的含量为占总固体成分重量的75％。皂甙含量占总固体成分重量的0.5％。
表4中显示实施例1和比较实施例1-3所得的含有异黄酮组合物中异黄酮的相对比例。与比较实施例1到3中所得的含有异黄酮组合物相比较，实施例1所得的含有异黄酮组合物中丙二酰基异黄酮甙的比例高而异黄酮甙和异黄酮甙元的比例低。在比较实施例1中，丙二酰基异黄酮甙比例下降的原因可能是因提高提取温度至70℃，使丙二酰基异黄酮甙降解为异黄酮甙。在比较实施例2中，丙二酰基异黄酮甙比例下降的原因可能是因增加洗脱用的乙醇的浓度，使大量的非丙二酰基异黄酮甙的成分被洗脱下来。
(表4)(单位％)

比较实施例4使用环糊精制备可溶性的异黄酮在80℃时，在500ml的50％乙醇水溶液中，溶解5g的比较实施例1(用高浓度乙醇提取)所得的含有异黄酮组合物和25g的β-环糊精(由Nihon Shokuhin Kako Co.生产)，并将溶液在80℃下搅动3小时。将溶液在室温下放置过夜。上清液减压干燥，得到10g粉末。这样得到的含有异黄酮的组合物，异黄酮的含量占总固体成分的重量的8.4％。皂甙的含量占总固体成分的重量的1.8％。
试验实施例2在25℃，在pH7.0，将实施例1和比较实施例1-4所得的含有异黄酮组合物边搅动溶解到水中，以至于异黄酮的浓度为20mg/100ml。搅动后，测得溶解度。在4℃下冷藏2周，也测得其稳定性。结果示于表5中。
(表5)

(测定标准)○没有观测到沉淀和混浊。
×观测到沉淀或混浊。
如表5所示，在实施例1中，在总固体成分中异黄酮的百分含量高达48％，并且在25℃时的溶解性也非常高。在实施例1中，冷藏2周后的稳定性也非常地好。因此，用实施例1的条件能够得到具有高浓度的异黄酮和非常高水溶解性的含有异黄酮组合物。在25℃下，实施例1所得到的含有异黄酮组合物在水中溶解的最大量(溶解度)，令人惊奇地，基于异黄酮的量至少为1,000mg/100ml。
在比较实施例1中，尽管异黄酮的含量高达38％，但是在25℃的溶解性和冷藏后的稳定性都差。这很可能是因为包括异黄酮甙元、异黄酮甙和色素在内的通常情况下水不溶性的物质由于高温(在70℃)加热回流提取的结果而被提取出来。
在比较实施例2中，异黄酮的含量低达20％，并且25℃时的溶解度也差。这很可能是因为用高浓度的乙醇水溶液洗脱异黄酮馏份使大量的弱水溶性的非极性物质被从吸附树脂上洗脱下来。
尽管比较实施例3所得的含有异黄酮组合物中异黄酮的含量高达75％，但是该组合物在25℃时在水中根本不溶解。这可能因为异黄酮自身的溶解度通常低达约5mg/L，而通过高度的纯化不能提高其溶解度。
在比较实施例4中，由于异黄酮与环糊精的包合作用造成总固体成分中糖的百分比增加，异黄酮的含量低达8.4％。所得到的含有异黄酮的组合物在25℃时在水中根本不溶解。这很可能是由于所得的组合物的溶解度取决于环糊精的溶解度，但在25℃时环糊精在水中不溶解。为了溶解该组合物，需要在80℃时加热10分钟或更多。
从上述所述的结果看出，仅在实施例1中，也即在组合用特定浓度的乙醇提取、洗脱和在特定温度下提取的情况下，所得到的含有异黄酮的组合物具有高的纯度、高溶解度并在冷藏下具有好的稳定性。对具有这样突出优点的组合物中的成分的相对比例进行测定。结果，发现重要的是(1)异黄酮的含量高达占总固体成分重量的25％或更多；(2)将异黄酮和皂甙的总量之和作为100％重量，丙二酰基异黄酮甙含量为15-95％重量，更优选为30-90％重量，还更优选为35-85％重量，最优选为35-80％重量；以及(4)将异黄酮和皂甙的总量之和作为100％重量，皂甙的含量为5-60％重量，更优选为10-50％重量，还更优选为15-45％重量，最优选为20-40％重量。
实施例2在100ml的水中，溶解5g实施例1所得的含有异黄酮组合物，并用柠檬酸调节溶液的pH3.0。在室温下将溶液放置过夜，以3000g离心溶液10分钟，收集上清液。用碳酸氢钠调节上清液的pH至6.5、干燥并粉碎得到4g粉末。这样得到的含有异黄酮的组合物的异黄酮含量为总固体成分重量的37％。这样所得到的含有异黄酮组合物在中性范围内(pH7.0)甚至在酸性范围(pH3.0)具有非常高的溶解度，基于异黄酮的量，其至少为100mg/100ml。此外，冷藏2周，在该组合物中没有观测到沉淀和混浊。因此，得到具有高溶解度和良好稳定性的含有异黄酮组合物。
实施例3含有异黄酮的饮料用表6中所示的混合比，将实施例1所得的异黄酮组合物进行混合，然后超热杀菌处理制得饮料。
(表6)

该饮料具有高度的溶解性、良好的外观和好的口感。喝50ml的该饮料能够摄入40mg的异黄酮。
实施例4含有异黄酮的包装饮料的制备用表7所示的混合比，将实施例2所得的含有异黄酮组合物进行混合，超热处理然后无菌灌装到产品包装(10g×15)中。
(表7)

当用100ml的水稀释时，这样所得的包装饮料具有良好的外观，以及良好的口感。饮用一袋这样的包装饮料能够摄取40mg的异黄酮。该包装饮料也非常便于携带。
工业适用性根据本发明，能够显著地扩大异黄酮在包括要求异黄酮在低温下易溶于水的饮料在内的各种食品以及药品和化妆品中的应用。尤其是，本发明能够极大地贡献于与利用异黄酮各种生理功能的健康食品有关的工业。
权利要求
1.一种含有异黄酮的组合物，其包括15-95％重量的丙二酰基异黄酮甙、0-50％重量的除丙二酰基异黄酮甙外的异黄酮以及5-60％重量的皂甙，在所述的组合物中异黄酮和皂甙的总量之和为100％重量。
2.根据权利要求1所述的含有异黄酮的组合物，其是以大豆胚轴作为起始原料而制得的。
3.根据权利要求1所述的含有异黄酮的组合物，其中在皂甙中A组皂甙的比例为55％重量或更多，将所述的组合物中皂甙的总量定为100％重量。
4.根据权利要求1所述的含有异黄酮的组合物，在25℃时，其水溶解度基于异黄酮的数量至少为20mg/100ml。
5.一种生产权利要求2所述的含有异黄酮的组合物的方法，其包括在10-50℃下用15-95％体积的乙醇水溶液提取大豆胚轴的步骤。
6.一种生产权利要求2所述的含有异黄酮的组合物的方法，其包括步骤(A)在10-50℃下用15-95％体积的乙醇水溶液提取大豆胚轴得到提取物；(B)使(A)步骤所得到的提取液在水中的溶液与非极性的吸附树脂接触，使异黄酮吸附于树脂上；和(C)用15-40％体积的乙醇水溶液从吸附树脂上洗脱异黄酮。
7.一种含有权利要求1所述的含有异黄酮组合物的可食用组合物。
8.一种分离异黄酮和皂甙的生产工艺，其包括在10-50℃下用15-95％体积的乙醇水溶液提取大豆胚轴得到提取物，使提取物为水溶液与非极性的吸附树脂接触，用15-40％体积的乙醇水溶液从吸附树脂上洗脱含有异黄酮的部分，然后用65-90％体积的乙醇水溶液从吸附树脂上洗脱含皂甙的部分。
全文摘要
本发明提供一种包含有异黄酮的组合物，该异黄铜具有高的纯度并且以天然形态在水中高度溶解，不需要加入任何的助溶剂或应用任何的化学改性剂。已发现包含具有高的纯度和高的水溶解度的异黄酮的组合物能够通过用含水的醇在特定的温度范围内提取大豆胚轴、然后用合成吸附树脂吸附所得的提取物并且用特定浓度的含水的醇进行洗脱而制得。
文档编号A61K31/7084GK1750762SQ20038010981
公开日2006年3月22日 申请日期2003年12月22日 优先权日2002年12月24日
发明者和根崎智, 荒木秀雄 申请人:不二制油株式会社