抗感染物疫苗,治疗和预防hiv感染的组合物的制作方法

专利名称：抗感染物疫苗,治疗和预防hiv感染的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型的疫苗，尤其涉及用于HIV的治疗、预防和诊断的组合物。
更具体地讲，本发明涉及能够在哺乳动物尤其是在人类中产生免疫反应直接或间接中和HIV病毒的肽类。
已经描述了在抑制HIV-1复制中抗β2-微球蛋白(β2m)的单克隆抗体的重要性，尤其是在专利EP-B-0,470,989及多种出版物上。
尤其，已可证实这些抗体以两种机制起作用，即直接作用于病毒以及与β2m相关的细胞。
本发明概括了这些基本要素的进展，并基于对能产生完全或部分中和HIV病毒的抗体的从β2m或等价结构中得到的多肽序列的鉴定。
考虑到所用机制的复杂性，“HIV病毒的中和”可被认为是指具有体内破坏和/或阻止病毒增殖作用的任何机制。
体外，这些中和抗体可用于中和试图再接种或再导入人体中的任何体液，如用于对一个HIV血清阴性的妇女进行人工受精的HIV血清阳性的男性的精液。
然而，更为普遍的是，本发明建立在尤其可用于具有高突变力的寄生虫或病毒感染物的一种新型免疫接种方法基础之上。确实，就传统接种疫苗而言，是试图产生抗感染物组份的中和抗体，但当后者表现出高突变力时，如HIV，这种策略充其量只对将很快被突变或抗性分离株所取代的特定分离株产生有限的作用。
这种新型的免疫接种方法依据一种不同的概念并且适用于在生长周期中有胞内阶段的一些感染物。
确实，已知或有可能证实，对某些感染物，尤其是对于组成本发明一部分的HIV而言，在宿主被感染细胞中的感染物增殖期间，胞外感染物带走了宿主决定簇的组份。
本发明的一个目的在于不是将感染物本身，而是随之被带走的决定簇组份作为靶点，并且提供抗这些细胞决定簇的免疫接种，即使感染物本身已突变，这些细胞决定簇将持续保留。
当然，这种方法只局限于结合在宿主细胞上的抗原，只有用下述表位才可能进行这样一种免疫接种，即当被胞外感染物带走时才会暴露的细胞决定簇的隐蔽表位，或在细胞中天然状态下是非免疫原性的而当存在于病毒颗粒表面时被修饰的抗原决定簇。
如对HIV而言，已有可能证实β2-微球蛋白具有几个隐蔽表位，在HIV病毒增殖和胞外传代时暴露。因此免疫接种时，一方面没有自身免疫反应，另一方面该表位结合到不同的已测定的HIV分离株上，免疫接种是有效的，这与病毒本身的突变无关。
优先选择这种免疫接种用于胞内寄生虫和有包膜病毒如CMV，HPV，HSV和HIV。
应该清楚虽然这种免疫接种不能在所有的病例中使用，但它能为对更为传统方法产生抗性的感染物提供了一种有用的选择。
因此，本发明涉及一种抗感染物的疫苗，其特征为包含至少一种被胞内感染物移至细胞外时带走的细胞元件的隐蔽表位并且这种表位能被感染物所暴露。
优选地，这种感染物是寄生虫或有包膜病毒并且隐蔽表位位于细胞表面附近。
“隐蔽表位”是特指宿主中被隐藏或修饰的细胞决定簇的表位，因此可被免疫系统识别为异物，因而不能产生破坏相应的决定簇的自身免疫反应，并可用于免疫接种。
当隐蔽表位被感染物带走时，它应该明显地暴露，也就是说可被免疫系统接近和识别(如果它仍保持隐蔽，免疫接种将是不可能的)。
对β2-微球蛋白而言，已有可能证实这种表位的存在，事实上也在泌尿道清除β2-微球蛋白时发现它的天然形式。
因此，本发明涉及用于治疗或预防HIV感染的组合物，特征为它们包括作为活性成分的至少一种对应于序列1至22或等价序列的肽。“等价序列”是指能在体外通过单克隆抗体B1G6或B2G2.2提高HIV病毒中和作用的序列。
这些肽包括上述的β2-微球蛋白的隐蔽表位。
本发明的肽类如下所示01-P1 IQRTPKIQVYSRHPA(Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala)02-P4 FHPSDIEVDLLKDGE(Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Val-Asp-Leu-Leu-Lys-Asp-Gly-Glu)03-P9 ACRVNHVTLSQPKIV(Ala-Cys-Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val)也有可能使用这些15个氨基酸的能通过单克隆抗体B1G6或B2G2.2提高HIV病毒中和作用的较短部分(7个氨基酸)04-R-7-V RTPKIQV(Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val)05-S-7-K SQPKIVK(Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys)06-F-7-E FHPSDIE(Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu)共有的结构PKI(3个氨基酸)好象是发挥作用的单位；因此进行如下的氨基酸修饰07-TLSRTPKIQV(Thr-Leu-Ser-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val)No.18508-IYLTQPKIKV(Ile-Tyr-Leu-Thr-Gln-Pro-Lys-Ile-Lys-Val)No.18609-IQRTPKIQVY(Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr)No.18710-TLSQPKIVKN(Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Asn)No.18811-IQRTPQIVKW(Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Gln-Ile-Val-Lys-Trp)No.18912-IQRTPNIVKW(Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Asn-Ile-Val-Lys-Trp)No.190也有可能引入一个半胱氨酸和一个糖基化位点13-CYNPSDIE(Cys-Tyr-Asn-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu)14-YCNPEST(Tyr-Cys-Asn-Pro-Glu-Ser-Thr)15-NFLNCYVS(Asn-Phe-Leu-Asn-Cys-Tyr-Val-Ser)16-LNCYVSPSD(Leu-Asn-Cys-Tyr-Val-Ser-Pro-Ser-Asp)最后，有可能根据物种(鼠，灵长类，兔，豚鼠)使用不同的肽类的变体17-KTPQIQV(Lys-Tyr-Pro-Gln-Ile-Gln-Val)18-FHPPQIE(Phe-His-Pro-Pro-Gln-Ile-Glu)19-FHPPHIE(Phe-His-Pro-Pro-His-Ile-Glu)20-AEPKTVY(Ala-Glu-Pro-Lys-Thr-Val-Tyr)21-SQPKTVY(Ser-Gln-Pro-Lys-Thr-Val-Tyr)22-ILSRTPKIQV(Ile-Leu-Ser-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val)SEQ ID 1至22的这些肽类仅包含了优先的选择；如上所述，有可能发现等价的肽类。
实施例5中描述了可用来鉴定等价肽类的方法。
这些肽类优选结合到载体系统；它可以是连接到所述肽类的N-和/或C-末端上的一个或多个蛋白片段，特别用于产生免疫反应；然后，它们将被称作“缀合蛋白质”。在可使用的蛋白质中，尤其该提及白蛋白，匙孔槭血蓝蛋白(KLH)多抗原肽(MAP)或其它的已知免疫原性的蛋白。也有可能设想通过非肽键如二硫桥或通过钙离子连接的蛋白或蛋白片段。
在研究本发明的各种肽类时，发现PKI结构发挥重要的作用，虽然这仅仅是一个不能限制本发明的理论。确实，脯氨酸是一种决定构象的氨基酸，并且限制四级肽结构的可能性。在这种情况下，KI(Lys，Ile)结合在暴露的与抗体反应的位点上。
在这种情况下，构建载体蛋白时，优先使用可接近的PKI结构是可行的。
可以通过例如用Ala分别取代每一个氨基酸尤其是位于RTPKIQV区的筛选，来确定可能的氨基酸的方法，进行P1、P9和P10所选择的结构域的分析。也有可能用将每个多肽生物素化的技术，然后再通过酶免疫测定(EIA)用抗体选择以确定结合力的丧失。
那么，有可能设想用上述的表位与非蛋白组份如多糖和/或脂类相联，以便构成具有增强疫苗活性的脂蛋白；再者，也有可能设想共价键或其它键。
通过化学合成或生产重组蛋白的领域内已知的重组技术可获得多种类型的化合物。
重组技术的灵活性使得可以生产出带有许多同样或不同的表位的蛋白并且最终的产物具有增强的活性。也可以设想将本发明组合物的多种组份共表达。
依据本发明的一个方面，肽类将可能导入一个已知结构的HIV蛋白。尤其可采用将有用的肽类插入到gp120 V3环的高变区的结构。
gp120的V3区是HIV-1重要的中和区和病毒嗜性的主要决定簇之一。因此，这种突变能用于研究与R7V相连的HIV-1的中和作用以及宿主谱的修饰。HIV-1分离株中gp120的V3区的高变性是优选这个区域的另一个原因。我们推测，与HIV-1基因组的另一个更为保守的区域内突变比较而言，V3区的7个氨基酸序列的取代所导致的生存重组的机会更大一些。重组蛋白gp120/R7V可在用于蛋白表达的合适系统中平行表达，以获得大量免疫原R7V。
载体蛋白的使用不是至关重要的；可以选择其它的载体系统。“载体系统”是特指可以导致产生一个整体而后者产生抗上述肽类的免疫反应的，或可以保护肽类免受降解，尤其是快速的蛋白水解的任何组份。
本发明的组合物还可包括增强肽类和/或蛋白免疫原性的组份，尤其是免疫佐剂，特异的或非特异的，如弗氏佐剂，多糖或等价化合物。
这些是疫苗领域中已知的方法。
本发明的组合物可以任何适于所选择的给药途径的形式使用，尤其是注射途径，然而，本发明的组合物还可通过其它途径，尤其是口服或气雾剂途径来诱导保护粘膜。
本发明还涉及用于给药后在原位表达上述肽和/或蛋白的组合物。
尤其是，本发明涉及可以表达至少一种上述的隐蔽表位的DNA表达盒，尤其是序列1至22的肽和/或含有这些肽的蛋白或能与如上定义的肽或有等价序列的肽相偶联的蛋白。
“等价序列”是特指编码上述等价肽的序列。
当然，这些DNA表达盒可用于直接在原位表达，也可用于产生如上所述可使用的肽或蛋白。
使用DNA序列的疫苗系统是已知的，已在文献中广泛描述。
它们基本上是允许抗原蛋白在人体中或细胞中表达，然后再用于免疫接种的系统；当转化细胞是在体外处理的宿主细胞时，这种处理可称为是离体的。
表达系统可以是很不相同的；尤其如在VICAL公司专利或专利申请书WO90/11092中所描述的“裸DNA”型系统。这样的话，编码肽或含有这种肽的蛋白的DNA以基本身被注射，许多情况下，这种注射可导致编码蛋白的表达。
这些文件中的信息清楚地包含在本说明书中作为参考。
也可以使用“裸DNA”系统，但包括它们自身的表达系统，尤其是用于提高表达。
也可以使用促进表达的系统，或通过整合，或通过自主复制，优选质粒或病毒型系统。
在这些用于表达所述肽序列的系统中，应该提及使用痘病毒、腺病毒，逆转录病毒和疱疹型病毒的系统或如脊髓灰质炎病毒的其它更新型的系统。
在载体中，优先使用产生体液反应和粘膜(反应)的载体。
为获得疫苗可使用其它的病毒，特别是-腺病毒如N.R.Rabinovich等，科学(Science)，1994，265，1401-1404和所列举的文献中所描述；-逆转录病毒如Sue E.Cowford，病毒学杂志(Journal of Virology)，1994-9，5945-5952中所描述；-痘病毒，尤其是痘苗病毒，还有动物痘病毒如金丝雀痘(canari pox)，在Paoletti和Moss的工作中有描述；-流感病毒，在N.R.Rabinovich等(1994)中有描述。
通过这种技术可使脊髓灰质炎病毒作为多种抗原的疫苗载体，在RaulAndino等，科学，265，2448-51中有专门的描述。
将这种构思用于本发明的内容中，可获得适于口服途径的疫苗；为了达到这个目的，将编码肽和视需要选择的载体蛋白的序列克隆到脊髓灰质炎病毒中，如减毒的Sabin病毒；也可使用编码多种表位的病毒的混合物。
在宿主细胞，尤其是人宿主细胞中，用质粒或病毒表达蛋白是已知的，不再详述。具体结构明显依赖于所选择的宿主、表位和载体。
也可使用细胞疫苗，也就是说，例如在基因治疗的情况下，提议从病人收集细胞，用上述的载体转化它们，然后将它们再植入以便在原位表达蛋白。
然而，就免疫接种而言，这种方法并不很方便。优选使用可大量得到的细胞、细菌和酵母细胞，它们表达上述蛋白，如位于表面，在一些情况下，可增强蛋白的免疫原性。
例如可以用包括沙门氏菌属的疫苗作为表达系统，这在T.R.Fouts等，疫苗(Vaccine)(1995)13，待发表；Tacket C.O.等，感染免疫(Infect.Immun.)，(1992)60，536-541和Hone等，J.Chim.Invest.(1992)90，412-420(对其作为人体疫苗载体的评述)中有描述。
这种疫苗涉及使用产生本发明肽的细胞，尤其是细菌细胞，或其它疫苗载体的某些菌株，在Chad P Muller，今日免疫(Immunology Today)，Vol.15 No.20.1994，458-459中有描述。
尤其当蛋白在细胞表面表达以及细胞是非毒性和非致病性时(减毒的或杀死的菌株)，可使用这些产生本发明肽或蛋白的细胞本身，也可用它们来产生纯化后方可使用的肽和/或蛋白。
那么，不仅获得细菌细胞而且得到酵母或高等细胞，尤其是动物、植物或昆虫细胞都是有好处的。
对本发明而言，用C.J.Arntzel等在《疫苗》94中专门描述的方法可提供使用植物来源的疫苗。
肽或蛋白在细胞系统中表达的方法以及纯化的技术是已知的。
已经提及，本发明的组合物可以与可增强DNA序列活性的佐剂一起使用，尤其是和DNA构成复合物的组份，如阳离子的脂类或脂质体或微粒型结构。
本发明还涉及含有抗本发明肽之抗体的组合物或含有编码抗本发明肽抗体之序列的组合物。
当然，含有抗体的组合物的使用要求抗体适于人的服用；可用已知的技术专门将抗体人源化或直接用DNA序列在原位表达。
本发明还涉及抗本发明肽并能中和HIV病毒的抗体的应用，本发明特别涉及包括这种抗体的抗血清或通过免疫纯化从所述血清中获得的抗体。
本发明还涉及一种诊断方法，其特征为在病人的血清中检测抗本发明一个表位的抗体的存在。
这种诊断可通过任何已知的方法来进行抗体的鉴定，优选ELISA和RIA方法以及由此而衍生的所有的方法。
所有这些方法都优选基于上述抗体和上述的抗原肽的结合，然后在进行结合显示。这种诊断有很大的好处；确实，实例表明含有本发明抗体的HIV血清阳性个体，在绝大多数情况下不再发展，也就是说他们不发展成AIDS。这种预后是非常有用的，它可避免昂贵的治疗。对母体(HIV+)中存在这些抗体的妊娠而言尤其如此，新生儿好象可以避免感染。
可用已知的方法来生产本发明的组合物，用化学途径合成蛋白，化学途径或PCR扩增合成DNA。蛋白可经适当的合成通过重组途径获得。
以下的实施例将论述本发明的其它特征和优点。
在附图中，-

图1A和1B表示显示用R7V-KLH免疫的兔血清对各种抗原反应性的ELISA。- 图2表示显示用β2m免疫兔的抗血清反应性的ELISA。- 图3A和3D表示不同的抗血清和所选择的肽的ELISA。- 图4表示R7V和不同的抗β2m抗体的ELISA。- 图5表示R7V-BSA和β2m与抗β2m抗体和兔血清的ELISA。- 图6至13表示显示在MT4和PBL中不同病人的血清与HIV病毒的不同分离株的中和作用效果的曲线图。实施例1
本实施例可证实兔抗所选择的与载体蛋白偶联的肽的免疫反应。
肽抗原7AA和KLH(匙孔槭血蓝蛋白)相偶联，在有完全弗氏佐剂存在时注射到兔体内。
在完全弗氏佐剂存在的情况下在D0、D14、D28、D42免疫动物，免疫前在35、49、56以及70天进行采血实验。
使用的肽类是R7V-KLH、S7K-KLH和F7E-KLH。
肽R7V(RTPKIQV)加上两个氨基酸以便偶联。用作免疫原的结构是RTPKIQVGY。
免疫的618兔抗体用ELISA测定，将与多种载体蛋白相偶联的肽加入到孔的底部(与KLH，BSA(牛血清白蛋白)或MAP相偶联)。
图表表示在稀释度d100和d1000，也就是说将血清稀释1/100和1/1000，或不同的时间得到的结果。
ELISA方法如下所示ELISA方法1)抗原结合到96孔板上(Immulon IV-Dynatech)·碳酸盐缓冲液pH9.6稀释抗原→(Ag)终浓度＝1μg/ml·每孔分配100μl，即每孔100ng·37℃孵育2小时或4℃过夜(在潮湿环境中)。2)冲洗·用0.05％Tween20的PBS溶液冲洗5次。3)孔饱和·每孔分配300μl含10％马(或牛)血清的PBS溶液·37℃孵育1小时(在潮湿环境中)。4)冲洗(方法同2)5)与特异的抗血清孵育·用PBS-10％马血清稀释血清(1/50，1/100，1/1000)·每孔分配100μl，37℃孵育1小时(在潮湿环境中)。6)冲洗(方法同2)7)与第二抗体孵育(抗人免疫球蛋白的与过氧化物酶偶联的羊免疫球蛋白)
·用PBS/10％马血清稀释第二抗体2/1000·每孔分配100μl，37℃孵育1小时(在潮湿环境中)。8)冲洗(方法同2)9)用OPD显色·25ml磷酸柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH5.5)中溶解10mg OPD·在最后时刻加入10μl H2O2·每孔分配100μl，室温下黑暗中孵育30分钟(可在405nm读出)·用50μl 12.5％的H2SO4终止反应。10)492nm读出结果。
图1A和1B表示用R7V-KLH免疫兔618所得到的结果。
血清的抗-KLH反应掩盖了抗-R7V的反应性，与R7V-KLH和KLH相比，R7V-BSA和BSA的抗-R7V反应性明显不同。应该指出抗-R7V反应性在D68比在D132更强一些。
如果使用BSA蛋白，可增强反应的特异性。
图2再一次显示了来源蛋白β2m令人满意的识别。
免疫兔的抗血清证实与R7V-BAS以及与用于选择R7V的称为P1、P4和P9的来源肽的高度反应性，即使与P1的反应性较弱(图3A-3D)。
图4证实B1G6和B2G2.2识别R7V依赖于剂量，和C21.48的识别较差；因此，优先用mAbs B1G6和B2G.2筛选等价肽。
这些结果证实R7V表位，与BSA偶联，能产生令人满意的免疫反应。实施例2R7V导入HIV-1 LAV gp120的V3环重组原病毒的构建本实施例的目的是将R7V序列导入HIV-1 LAV gp120的第三个可变区V3。方法用PCR-定点突变构建嵌合重组病毒。获得基于R7V序列和HIV-1 LAV的两个构建物，其中gp120的V3区的7个氨基酸被R7V序列取代。突变序列的位点如下表所示HIV-1 LAV(V3)NNNTRKSIRIQRGPGRAFVTR7V RTPKIQV (1)RPLR7V RTPKIQV (2)PLG用克隆到载体Bluescript中的HIV-1 LAV的EcoRI5278-XhoI8401片段作为随后构建物的模板。在第一阶段，通过PCR扩增合成一端含有BglII限制性内切酶位点的引物另一端为编码R7V的核苷酸序列的DNA片段以构建RPL和PLG。所用的突变寡核苷酸由一条(+)引物ACACCAAAGATACAAGTTGTTACAAATAGGAAAA和一条(-)引物TTGTATCTTTGGTGTTCTCTGGATCCGGATACTTT组成以构建RPL，由一条(+)引物CGTACACCAAAAATCCAGGTCCAGAGAGGACCA和一条(-)引物GATTTTTGGTGTACGCGTATTGTTGTTGGGTCT组成以构建PLG。在第二阶段，将每一个结构的PCR产物混合用含有BglII限制性内切酶酶切位点的引物扩增。用BglII酶切RPL和PLG片段并插入到BglII酶切的含有HIV-1LAVEcoRI5278-XhoI8401片段的载体Bluescript中。除R7V序列外，含有核苷酸序列修饰的扩增引物导致在RPL和PLG结构中分别出现新的BamHI和MluI限制性内切酶酶切位点，但氨基酸序列没有额外的修饰。新的限制性内切酶酶切位点用来筛选突变的序列。最后，将含有RPL和PLG结构的HIV-1 LAV的EcoRI5278-XhoI8401片段利用EcoRI和XhoI限制性内切酶酶切位点通过同源重组插入到质粒pNL4-3中。构建物用限制性酶切分析鉴定。转染真核细胞抽提200ml大肠杆菌TG1的质粒DNA并用Qiagen半制备试剂盒纯化。通过钙共沉淀技术用7μg的质粒转染COS细胞(约4×106)的半铺满的培养物。第二天用甘油处理单层细胞并与CEM细胞系或与从健康供体获得的PHA(PBL，106细胞/ml)激活的原代血淋巴细胞共培养。两天后将单层的COS细胞和CEM或PBL细胞分离，分别培养。病毒生产将COS或PBL细胞的1ml无细胞上清超离心，用标准的逆转录酶反应检测沉淀的病毒。一些实验中，100μl的细胞上清用于测定p24gag蛋白的产生。
转染COS细胞和与CEM细胞的共培养逆转录酶活性(cpm/ml)感染后天数RPL1 PLG2NL4-35 7282 7730458389 3282 530232661813382 630 ND16200 300 ND通过钙共沉淀技术用7μg的质粒转染4×106COS细胞。加入4×105CEM细胞/ml使终体积达到5ml。共培养两天后，悬浮的CEM细胞和单层的COS细胞分离。CEM培养物上清的逆转录酶活性用cpm/ml表示。
PBL的感染逆转录酶活性(cpm/ml)感染后天数RPL1 PLG2 NL4-34 734 782200087 202 21610 262 28214 454 26217 204 138RPL1+PBLPLG2+PBL1 350 33627063624 230 28229628427 588 510620980
用5000cpm/106量的PBL转染(表1)后得到的1994.12.19无细胞上清感染2.5×106PBL。感染17天后，2×106新分离的PBL加入到2×106感染的PBL中(RPL1+PBL，PLG2+PBL)。培养上清中的逆转录酶活性用cpm/ml表示。
转染COS细胞和与PBL的共培养感染后天 逆转录酶活性(cpm/ml)数 PLG2-25 PLG2-30 PLG2-95 NL4-33 250084003500 21507 446 398 5825300010 174 336 3067400014 730 834 48245778感染后天数 逆转录酶活性(cpm/ml)RPL1 PLG23 20338220007 682 41811 552 466通过钙共沉淀技术用7μg的质粒转染4×106COS细胞。用PHA刺激的PBL细胞以106细胞/ml的量加入直到终体积为5ml。共培养两天后，悬浮的PBL细胞和单层的COS细胞分离。PBL培养物上清的逆转录酶活性用cpm/ml表示。实施例3本实施例的目的是用选择的肽类检测病人血清中的潜在地抑制HIV的抗体(抗β2-微球蛋白抗体)，尤其要证实病情不再发展的病人血清中保护性抗体的存在。“病情不再发展的病人”或“NP”是指呈血清阳性多于10年但不发展成为AIDS的病人，尤其是T4细胞水平正常的病人。材料与方法1/合成所用肽并通过Neosystem(法国)与BSA偶联。
2/病人血清在用于ELISA前保存在-20℃或-80℃。
3/抗人或兔免疫球蛋白的第二抗体从Amersham(法国)得到。OPD从Sigma(法国)得到。血清阳性病人血清的ELISA1/病人血清中有抗-R7V抗体的存在(滴度1/100和1/1000)。
2/检测病情不再进展的病人的46份血清(培养中无病毒复制)，滴度1/100时，16份血清是R7V阳性(37％)，27份阴性(63％)，3份不能确定(表1)。
3/病情不再进展的46个病人，34个进行了抗-肽抗体的检测R7V，P1，P4，P9。滴度1/100时，14份血清对至少一种肽是阳性的(51.8％)，13份血清仍是阴性的。4份血清不能归于阳性或阴性(图2)。
表1R7V与NP血清的ELISA
表2肽与NP血清的ELISA
(？)未确定实施例4下面的实验可检测在病情不再进展的病人体内的中和多种HIV分离株，尤其是BRU和NDK的抗体，同样的病人有抗-R7V抗体。这可以使中和作用与经过本发明治疗产生抗体的预防HIV的特性显示出较好的相关性。材料与方法MT4细胞的培养MT4是无限增殖化细胞(CD4+)，对HIV的致细胞病变效应非常敏感，是由成人的T白血病中衍生的细胞。细胞在补加10％胎牛血清，1％谷氨酰胺和1％抗生素的RPMI培养基中培养。PBL的培养在含有10％胎牛血清、1％谷氨酰胺、1％抗生素、2μg/mlPolybrene、20IU/ml白细胞介素-2(IL-2)的完全RPMI培养基中用植物凝集素P(PHA P)刺激淋巴细胞3天。然后，冲洗细胞并以106细胞/ml的量在完全RPMI培养基中培养。中和实验用于试验之前血清要脱补体和过滤。MT4中的中和血清在24孔板(Costar)中稀释，总体积为0.8ml。加入HIV-1BRU病毒(贮存液的100μl 10-1稀释液)或HIV-1 NDK病毒(贮存液的100μl10-3稀释液)，混合物在5％CO2中37℃孵育1小时30分钟。然后将每孔都加入200μl的细胞并且每ml含1.5×106细胞。感染3天后，培养物用10％RPMI培养基稀释(1/3)。通过每天在显微镜下观察syncitia(多成核巨细胞)的形成来监测用HIV-1病毒感染的细胞。不同血清的病毒中和作用定义为与野生型HIV诱导的syncitia(+)的形成相比较不形成syncitia(-)或形成很少的syncitia(+/-)。PBL中的中和在96孔板中将血清(50μl)与HIV-1 BRU病毒(贮存液的50μl 2×10-1稀释液)混合，放入5％CO2中37℃1小时30分钟。混合物加入到24孔板(Costar)的106PBL中，5％CO2中37℃保持3天。冲洗细胞，以106细胞/ml的量在25em2培养瓶中培养。每3或4天用“逆转录酶”酶活性测定实验监测病毒的产生。“逆转录酶”(RT)活性实验1ml离心的培养物上清(1500rpm，RT，10min)用TL100离心机(Beckman)通过超离心(95000rpm，4℃，5min)浓缩100倍。得到的沉淀中加入10μl NTE缓冲液-0.1％Triton X100。酶反应在50μl的以下反应混合物中进行50mM Tris pH7.8；20mM MgCl2；20mM KCl；2mM二硫苏糖醇；Oligo dT12-18 0.25 OD/ml；poly rA 0.25 OD/ml和2.5μ Ci3HdTTP。37℃孵育1小时，反应产物用20％三氯乙酸沉淀，Millipore膜过滤，测定β放射性。结果用CMP/ml表示。中和实验的报告用申请人改进的特异的ELISA可检测HIV+病人血清中的抗肽R7V的抗体。检查了这些血清中对两个野生型病毒HIV-1BRU和NDK的中和活性的存在。进行两个中和实验，一个用MT4细胞系(随后形成syncitia)，另一个用健康的外周血淋巴细胞PBL(随后出现“逆转录酶”酶活性)。MT4的结果检测13位病人，其中有6个被检出有中和血清活性(表3至5)-两个血清中和HIV-1 NDKZUM AM(ELISA阳性)COC PH(ELISA阴性)-两个血清中和HIV-1 BRUMEC EV(ELISA阳性)OUA VE(ELISA阴性)-两个中和HIV-1 BRU和HIV-1 NDKSAU CH(ELISA阳性)BUB JE(ELISA阳性)PBL的结果用血清MEC EV、SAU CH和BUB JE(1/50)以及用血清阴性个体的血清进行实验。SAU CH和血清阴性的血清没有检测出中和活性。相反，MECEV和BUB JE检测出抗两个野生型病毒HIV-1 BRU和NDK的中和活性(图6至13)。实施例5可检测等价肽的方法所选择肽通过抗-B1G6 β 2单克隆抗体中和HIV-1 NDK的作用方法总体积为110μl的100μg/ml或50μg/ml的肽(40μl或20μl的贮存液，5mg/ml)与5μg/ml B1G6(10μl的1mg/ml贮存液)在试管中温和搅拌下37℃水浴2小时。接着，加入HIV-1 NDK(贮存液的100μl的2×10-4稀释液)，试管在37℃水浴中孵育1小时。分成两个试管，将每100μl加到24孔板的106PBL中。细胞在5％CO2环境中37℃培养3天。第3天，冲洗细胞，培养并在25cm3园底瓶中至少增殖20-25天。每3或4天用逆转录酶(RT)实验监测病毒的产生。结果肽R7V和F7E可抵消单克隆抗体B1G6对PBL产生HIV-1 NDK的中和作用。修饰R7V的序列，6个新肽中(185，186，187，188，189，190)有3个丢失了R7V的抵消作用肽185，189和190。
表3
表4a
<p>表4b
表5a
表5b
实施例6抗-R7V抗体的存在与疾病进展的相关性使用90份HIV感染的病人的血清样品。它们是如下分布的28位病人三年多无症状，24位长期幸存者以及38位AIDS病人。对照组是69位从血库中得到的血清阴性自愿者。
淋巴细胞用间接免疫荧光计数，用Epic Profile(Coultronics，Margency，法国)分析。β2m血清水平用免疫扩散测定(El Nanorid试剂盒)。p24抗原水平用Coulter p24检测试剂盒(Coultronics，Margency，法国)检测。
抗-R7V抗体的血清浓度通过ELISA检测。结果以μg/ml的B1G6单克隆抗体等价物的浓度来表示。中和实验将人的血清脱补体并稀释到含200μg/ml或100μg/ml的B1G6等价物。含有100TCID50的50μl的HIV与50μl的稀释血清(总体积100μ1)在96孔板上37℃于5％CO2中预孵育90分钟。含有病毒和血清的反应混合物加入8×104MT4细胞后稀释2倍(血清最终稀释度从1/120至1/20)，感染3天后再稀释3倍。syncytia的形成可显示病毒的感染，在培养孔中观察HIV在MT4细胞系中的融合作用7天。感染7天后，在400μl无细胞上清中测定逆转录酶活性。
计算每个病人和每一组的抗-R7V抗体水平的平均值。HIV感染的人血清中含有抗-R7V抗体，HIV血清阳性的血清中的抗-R7V抗体的浓度大大高于血清阴性的血清。以B1G6等价物表达的抗-R7V抗体水平，在HIV感染的组中和没有HIV感染的组中，分别为35至2558μg/ml(n＝90)以及27至1790μg/ml(n＝69)。
根据他们的临床特征可将HIV病人的小组分成三个类型病情不再进展的一组，他们是长期呈HIV阳性血清并在实验室已被检测三年多无艾滋症状的病人；长期幸存(LTS)的一组，他们已长期为艾滋病人；最后一组是具有不良预后的艾滋病人。
与疾病进展的一组(从35到630μg/ml)(p＝0.001)相比，无症状一组的抗-R7V抗体大大增加(从91到2558μg/ml)，与LTS组(从59到1864μg/ml)相比没有什么明显差异。LTS组的抗-R7V水平比进展组(p＝0.004)的高。进展组的抗-R7V抗体水平与健康的受试者相比没有差异。
在进展组中，根据抗-R7V抗体水平，在他们最后一次去实验室后不久即死去的受试者(从35到508μg/ml，n＝23)与患病但仍活着的(从77到586μg/ml，n＝14)(p＜0.03)之间有明显的区别。
纵向的跟踪研究没能建立抗-R7V抗体水平与其它生物参数如循环中的总淋巴细胞数、CD4和CD8细胞、p24和β2m的相关性。
在NP病人中，R7V水平好象是稳定的，在LTS病人中是波动的。
为了使ELISA实验和病人血清的生物活性相关，用两个无关的病毒HIV-1LAV株与高度致细胞病变的HIV-1NDK株进行中和实验，以MT4细胞为显示者。调整血清稀释度得到含有5μg B1G6等价物的中和混合物。这个浓度被定义为B1G6抗体中和感染的最适值。表5中显示，18份血清中有17份阻止了NDK和LAV感染MT4细胞。为得到含5μg B1G6等价物的培养物，所测试的18份血清中有13份的稀释度要小于1/50。为消除可能血清成分的非特异活性，将低B1G6等价物水平的这些血清稀释1/100，用于中和实验。这样，培养物中B1G6等价物的量低于5μg(从2.5μg/ml到0.3μg/ml)。1/100稀释度时，14份血清中有9份仍能中和HIV病毒LAV和NDK株。来自健康对照的3份血清没有中和活性。
表5实验中5μg的B1G6等 中和两株HIV的血清数/价物的血清稀释度 所测血清总数稀释度≥1/50 5/51/50＞稀释度≥1/20 10/11稀释度＜1/20 2/2合计 17/18序列表SEQ ID No.1的资料类型氨基酸长度15个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.1Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-AlaSEQ ID No.2的资料类型氨基酸长度15个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.2Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Val-Asp-Leu-Leu-Lys-Asp-Gly-GluSEQ ID No.3的资料类型氨基酸长度15个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.3Ala-Cys-Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-ValSEQ ID No.4的资料类型氨基酸长度7个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.4Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-ValSEQ ID No.5的资料类型氨基酸长度7个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.5Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-LysSEQ ID No.6的资料类型氨基酸长度7个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.6Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-GluSEQ ID No.7的资料类型氨基酸长度10个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.7Thr-Leu-Ser-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-ValSEQ ID No.8的资料类型氨基酸长度10个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.8Ile-Tyr-Leu-Thr-Gln-Pro-Lys-Ile-Lys-ValSEQ ID No.9的资料类型氨基酸长度10个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.9Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-TyrSEQ ID No.10的资料类型氨基酸长度10个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.10Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-AsnSEQ ID No.11的资料类型氨基酸长度10个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.11Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Gln-Ile-Val-Lys-TrpSEQ ID No.12的资料类型氨基酸长度10个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.12Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Asn-Ile-Val-Lys-TrpSEQ ID No.13的资料类型氨基酸长度8个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.13Cys-Tyr-Asn-Pro-Ser-Asp-Ile-GluSEQ ID No.14的资料类型氨基酸长度7个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.14Tyr-Cys-Asn-Pro-Glu-Ser-ThrSEQ ID No.15的资料类型氨基酸长度8个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.15Asn-Phe-Leu-Asn-Cys-Tyr-Val-SerSEQ ID No.16的资料类型氨基酸长度9个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.16Leu-Asn-Cys-Tyr-Val-Ser-Pro-Ser-AspSEQ ID No.17的资料类型氨基酸长度7个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.17Lys-Thr-Pro-Gln-Ile-Gln-ValSEQ ID No.18的资料类型氨基酸长度7个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.18Phe-His-Pro-Pro-Gln-Ile-GluSEQ ID No.19的资料类型氨基酸长度7个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.19Phe-His-Pro-Pro-His-Ile-GluSEQ ID No.20的资料类型氨基酸长度7个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.20Ala-Glu-Pro-Lys-Thr-Val-TyrSEQ ID No.21的资料类型氨基酸长度7个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.21Ser-Gln-Pro-Lys-Thr-Val-TyrSEQ ID No.22的资料类型氨基酸长度10个氨基酸拓扑构型线性序列描述SEQ ID No.22Ile-Leu-Ser-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val
附图的图例说明图1A的图例
图1B的图例
图2的图例R7V或β2m免疫的兔抗血清的ELISA兔618(R7V-KLV免疫)血清稀释度1/100
图3A的图例肽包被的孔中兔抗血清的ELISA
图3B的图例免疫兔血清的ELISA
图3C的图例免疫兔血清的ELISA
图3D的图例免疫兔血清的ELISA
图4的图例R7V与B1G6、C21.43、B2G2.2mAb的ELSIA
(？)未确定实施例4下面的实验可检测在病情不再进展的病人体内的中和多种HIV分离株，尤其是BRU和NDK的抗体，同样的病人有抗-R7V抗体。这可以使中和作用与经过本发明治疗产生抗体的预防HIV的特性显示出较好的相关性。材料与方法MT4细胞的培养MT4是无限增殖化细胞(CD4+)，对HIV的致细胞病变效应非常敏感，是由成人的T白血病中衍生的细胞。细胞在补加10％胎牛血清，1％谷氨图8的图例SAV CH血清(1/50)对PBL产生HIV-1 BRU-1的影响
SAU CH 50
SAU CH 50′
BRU
BRU′图9的图例HIV病人的血清对PBL产生HIV-1的影响
SN5
SN5′
BRU
BRU′图10的图例MEC-EV血清(1/50)在PBL中对HIV-1 NDK的中和
MEC EV 50
MEC EV 50′
NDK 5-4图11的图例BUB JE血清(1/50)在PBL中对HIV-1 NDK的中和
BUB JE 50
BUB JE 50′
NDK 5-4图12的图例SAU CH血清(1/50)对PBL产生HIV-1 NDK的影响
SAU CH 50
SAU CH 50′
NDK 5-4图13的图例一HIV病人的血清对PBL产生HIV-1 NDK的影响
SN5 50
SN5 50′
NDK 5-权利要求
1.用于治疗和/或预防传染性疾病的疫苗，感染物在其增殖周期中至少有一个宿主内的胞内阶段，其特征为其包含至少一种被胞内感染物在移至细胞外时带走的细胞元件的隐蔽表位并且这种表位能被感染物所暴露。
2.权利要求1中的疫苗，其特征为感染物为细胞内寄生虫或有包膜的病毒。
3.权利要求2中的疫苗，其特征为其中的病毒选自HIV、CMV和HPV。
4.用于治疗或预防HIV感染的组合物，其特征为其包含作为活性成分的至少一种对应于序列1至22号或等价序列的肽。
5.权利要求4中的组合物，其特征为肽和载体系统相连。
6.权利要求5中的组合物，特征为载体系统由通过肽键与肽N-或C-末端相连的一个或多个蛋白片段组成。
7.权利要求4中的组合物，其特征为载体系统通过非肽键与肽相连。
8.权利要求4到7之一的组合物，其特征为其中肽具有R7V序列。
9.权利要求4到8之一的组合物，其特征为它包含几种肽。
10.权利要求4到9之一的组合物，其特征为其中载体系统选自白蛋白、KLH和MAP。
11.权利要求4到10之一的组合物，其特征为它包含额外的非特异的免疫佐剂。
12.用于治疗或预防HIV感染的组合物，其特征为其包含编码序列SEQIDNo.1至22或等价序列的任何一个肽的DNA序列。
13.权利要求12中的组合物，其特征为其中DNA序列编码具有肽序列SEQIDNo.1至22或等价序列的肽。
14.权利要求13中的组合物，其特征为其中DNA序列之前有确保其在宿主细胞中表达的序列。
15.权利要求12到14之一的组合物，其特征为其中DNA序列被表达载体所携带。
16.权利要求15中的组合物，其特征为其中表达载体是自主复制的。
17.权利要求15中的组合物，其特征为其中表达载体是染色体整合载体。
18.权利要求15到17之一的组合物，其特征为其中表达载体是细菌质粒。
19.权利要求15到18之一的组合物，其特征为其中表达载体由全部或部分缺陷和/或非致病病毒组成。
20.权利要求1到19之一的组合物，其特征为其中肽在宿主细胞中表达。
21.权利要求20中的组合物，其特征为所述细胞是真核或植物细胞。
22.用于权利要求1到21之一的组合物的抗肽的抗体。
23.包含权利要求22中的至少一种抗体的组合物。
24.诊断病情不再发展的病人的方法，其特征为通过免疫测定检测权利要求19的抗体的存在。
25.权利要求24中的方法，其特征为其中免疫测定是ELISA或RIA测定。
全文摘要
本发明公开了一种治疗和/或预防传染病的疫苗,其中感染剂在其增殖周期中至少有一个胞内阶段。该疫苗包含至少一种被胞内感染物离开细胞时所带走的细胞元件的隐蔽表位,且该表位被所述感染物所暴露。还公开了一种治疗和/或预防HIV感染的组合物,抗目的肽的抗体和诊断方法。
文档编号A61K35/76GK1193349SQ96196335
公开日1998年9月16日 申请日期1996年6月28日 优先权日1995年6月30日
发明者J－C·舍曼, C·里·康泰尔, P·佳利 申请人:国家健康科学研究所