专利名称：含一种醚类脂/互补形类脂混合物的载体和其治疗用途的制作方法
技术领域：
本发明领域本发明涉及含醚类脂的药用组合物和涉及这种组合物在治疗各种疾病如癌症和炎症中的用途。
本发明背景癌症化疗的目的一般在于在避免伴随损害周围细胞和组织的同时减慢癌细胞的生长或破坏癌细胞；因此最有效的抗癌剂是那些能最好地选择性靶向进攻癌细胞而使正常细胞相对不受影响的物质。
醚类脂可有效的作为抗癌剂(参见例如Dietzfelbinger等(1993)；Zeisig等(1993)；Powis等(1990)；Berdel(1991)；Bhatia和Hadju(1991)；Reed等(1991)；Workman等(1991)；Workman等(1991)；Bazill和Dexter(1990)；Berdel(1990)；Counsell等(1990)；Tritton和Hickman(1990)；Muschiol等(1990)；Layton等(1980)；Runge等(1980)；Munder和Westphal(1990)；Lohmeyer和Workman(1995)；Lohmeyer和Bittman(1994)；英国专利1583661；美国专利3752886)。关于醚类脂对癌细胞的毒性已经提出了几种作用机制，包括癌细胞缺乏烷基裂解酶；所导致的不能水解醚类脂引起了其细胞内积累并结果损害了细胞膜类脂组织。其它可能的醚类脂作用机制包括对细胞内蛋白质磷酸化作用水平的影响和细胞类脂代谢的破坏。
正常细胞一般具有避免或克服醚类脂潜在毒性作用的能力，而癌细胞却没有。但是，没有这种能力的正常细胞如红血细胞(“RBCs”)和癌细胞一样会受醚类脂作用的破坏影响。事实上，已经发现源于RBCs暴露于醚类脂的溶血作用严重妨碍了醚类脂的治疗用途(参见例如Houlihan等，1995)。解决这种醚类脂导致的细胞毒性问题的一种方法是将所述药物混入到类脂基载体如脂质体中。
本发明提供一种类脂基载体，它具有一种包含所述醚类脂和与所述醚类脂互补分子形状的一种类脂的层状类脂组分；这种形状互补性可使比原本另外可能的浓度更高的醚类脂混入到类脂基载体中。以前并没有介绍在本发明的药用组合物中这种醚类脂和与其互补形状类脂的新组合。PCT/US95/12721描述了除了一种具连接到甘油骨架第二个位置上的一个甲氧基的甘油基醚类脂外还包含胆甾醇、磷酰胆碱和磷脂酰乙醇胺-二羧酸衍生物的脂质体。德国专利申请4132345描述了除了一种含甲氧基醚类脂外还包含胆甾醇和一种带正电荷或负电荷类脂的脂质体。日本专利申请61-022020描述了除了含乙酰基或丙酰基的甘油基醚类脂外还含胆甾醇和一种磷脂的脂质体。Mende等人描述了包含一种等摩尔比率的醚类脂/胆甾醇组合的脂质体的膜电势改变作用。然而，这些文献中没有一篇描述了包含互补形的类脂和在第二位具一甲氧基的甘油基醚类脂的药用组合物。
本发明概述已知醚类脂是有效抗癌剂；但是，也已知它们对一些正常细胞是有细胞毒性的。因此，醚类脂的有效治疗用途需要一种输送醚类脂的途径使其毒性被缓解而其治疗能力被维持。本发明以具一层状类脂组分的类脂基载体的形式提供了这种途径，所述层状类脂组分包含一种含醚键甘油类脂即“醚类脂”和一种“互补形的类脂”即一种具有与醚类脂的分子形状互补形状的类脂。所述甘油类脂具有下列分子式
式中R1优选为具有式-(CH2)n1CH3，更优选为-(CH2)17CH3的基团；Z优选为氧。因此最优选所述甘油类脂为
即“ET-18-OCH3”或(C-18醚类脂)。
所述互补形的类脂优选自中性甾醇、中性甾醇/阴离子甾醇组合、心磷脂、二和三酰基甘油、二花生四烯酰磷脂酰乙醇胺(“DAPE”)或类似的类脂。更优选所述互补形类脂是胆甾醇、胆甾醇硫酸盐(sulfate)或胆甾醇和胆甾醇硫酸盐的混合物。
含本发明的载体的药用组合物治疗上可用于例如通过将包括治疗有效量的甘油类脂的组合物对哺乳动物给药以降低哺乳动物肿瘤的大小。
附图的简要说明
图1为各种类脂的单层膜的表面压力对每分子平均分子面积(“MMAM”)的关系图。类脂为ET-18-OCH3(a)、胆甾醇(b)、POPC(c)、DOPC(d)和DOPE(e)。膜以15cm2/min压制。每条曲线是三次压制的平均值。
图2.A)作为ET-18-OCH3含量的函数的每分子平均分子面积，这里单层由与DOPC(●)、POPC(▲)、DOPE(■)或胆甾醇()混合的ET-18-OCH3形成。数据是3次试验的平均值，±S.D(标准偏差)。虚线代表对基于各个MMAM值的简单加合性的胆甾醇/ET-18-OCH3混合物的期待值(A0)。B)作为ET-18-OCH3函数的MMAM百分降低率。
图3.混入通过挤压过一个100nm孔径滤器形成的脂质体中的ET-18-OCH3的溶血活性。各符号代表游离ET-18-OCH3(◆)、以40％(摩尔)混入具有类脂POPC(●)、DOPC(▲)、DOPE(■)和胆甾醇()的脂质体的ET-18-OCH3。每个制备进行三次并且误差条(bar)代表S.D。脂质体粒径通过动态光散射测量并发现除了ET-18-OCH3/胆甾醇脂质体平均直径为77nm外各样品均为约40nm。
图4.类脂分子形状对收集结构影响的示意图。涂黑区域代表亲水类脂首基；阴影区域代表类脂的疏水烃区域结构。
图5.各种摩尔比率的ET-18-OCH3与其它类脂的混合物的磷核磁共振(x-轴ppm)(a)在23℃下的ET-18-OCH3/CHOL(60∶40摩尔比率)；(b)在23℃下的ET-18-OCH3/CHOL(50∶50摩尔比率)；(c)在23℃下的ET-18-OCH3/CHOL(40∶60摩尔比率)；(d)在37℃下的ET-18-OCH3/CHOL(40∶60摩尔比率)；(e)在23℃下的ET-18-OCH3/POPC(40∶60摩尔比率)；(f)在23℃下的ET-18-OCH3/DOPC(40∶60摩尔比率)；(g)在23℃下的ET-18-OCH3/DOPE(40∶60摩尔比率)；(h)在37℃下的ET-18-OCH3/DOPE(40∶60摩尔比率)；(a)的各向同性峰被定为0 ppm的值。
本发明的详细说明本发明提供了具有层状类脂组分的类脂基载体，它们包括互补形状的类脂和具有一个三碳甘油骨架的类脂，即“甘油类脂”。这些甘油类脂包括一烃基链(“R1”)，其端头的亚甲基碳通过一氧原子在1号位连接到甘油骨架上。因此，烃链通过醚键的方式连接到甘油骨架上以及本发明的甘油类脂是“含醚键”甘油类脂或“醚类脂”。一个甲基通过一个氧原子或一个硫原子在所述甘油骨架的2号位连接到甘油骨架上并且在3号位连接了一个磷酸胆碱基(-OP(O)3CH2CH2N(CH3)3)。因此，本发明的甘油类脂具有下列L-或D-异构体的结构通式，尽管本发明优选L-异构体
R1是具有式Y1Y2的基团，式中Y1是基团-(CH2)n1(CH＝CH)n2(CH2)n3(CH＝CH)n4(CH2)n5(CH＝CH)n6(CH2)n7(CH＝CH)n8(CH2)n9。n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9的和是一个9到23的整数。n1是零或一个1到23的整数，n3是零或一个1到20的整数，n5是零或一个1到17的整数，n7是零或一个零到14的整数，n9是零或一个1到11的整数；n2、n4、n6和n8各分别为零或1。Y1优选饱和，具有式-(CH2)n1CH3，n2、n3、n4、n5、n6、n7和n8因此均等于0。Y2是C(O)2H或CH3并优选为CH3。
R1因此优选是-(CH2)n1CH3，更优选-(CH2)17CH3。Z是O或S，但是优选O。因此本发明的甘油类脂优选为
即1-O-十八烷基-2-O-甲基-sn-3-磷酸胆碱(C-18醚类脂，“EL-18”或“ET-18-OCH3”。
除了醚类脂外，所述层状类脂组分包含其分子形状与醚类脂互补的两亲类脂分子即“互补形类脂”。在含水环境中，两亲类脂一般具有锥形、圆柱形或倒锥形的分子形状(图4)。水合两亲类脂分子的具体形状取决于分子的极性首基和疏水酰基链区域结构的相对尺寸(参见例如Kumar等，1991；Rand等，1975；Madden和Cullis，1982；Wu等，1991；Wu和Chi，1991；和Israelachvill等，1976，各文献内容均通过引用并入本文)。
锥形类脂具有比其烃区域结构横截面小的首基表面积；这些类脂在含水环境中形成胶束，其中类脂首基绕着所述胶束的外部排列，而烃链在其内部螯合。倒锥形类脂具有大于疏水区域结构横截面面积的首基表面积；这些类脂形成了相反胶束，其中所述首基排列在其结构的内部，所述烃绕着其外部排列。圆柱形类脂具有大致与其疏水区域结构的横截面面积相等的首基表面积。这些类脂可本身形成双层，然后其烃链以一般为同一平面肩并肩的形式在所述双层的内部排列，而所述类脂首基朝着周围水环境排列。
圆柱形类脂特别适合于形成层状结构，因为它们具有的沿着其分子的长轴的对称。这种对称可让所述类脂在双层中采取同一平面肩并肩的形式，这种排列能提供最大程度地遮蔽疏水烃链免受与周围水在能量上不利地接触。
首基和烃链区域结构尺寸不同的锥形和倒锥形类脂一般本身并不形成层。它们分子形状的不对称意味着对于遮蔽类脂的酰基链区免受与含水环境接触来说双层排列不是最有效的排列。在双层中锥形和倒锥形类脂的肩并肩填充将会因为分子形状的不对称而让很大部分的类脂的烃区域结构暴露于含水环境中。反向(inverted)胶束(对于锥形类脂)和胶束(对于倒锥形类脂)暴露了这些类脂较少的烃区，因此对于这些类型的类脂来说是更适合的结构。
但是，混合的锥形和倒锥形类脂可形成层，因为所述混合提供了沿着混合的类脂分子的长轴的近似对称。对于大致等摩尔的锥形和倒锥形类脂的混合物来说最大程度地将酰基链区与水隔离通过其在一双层结构中的排列提供。因此，“互补形类脂”是一种具有不对称、非圆柱形分子形状的类脂，其可与第二种不对称形状的类脂分子一起形成一种具有沿着混合分子长轴的大致对称的一个类脂分子对。因此，对于倒锥形分子如本发明的甘油类脂来说，互补形状类脂是一种锥形类脂。
两亲类脂的首基和酰基链区的相对尺寸和由此所述类脂的分子形状可通过按照等式S＝V/(a)(I)[式中“V”是类脂的烃区域结构的体积，“a”是所述类脂的首基表面积，“I”是烃链的长度]测定的类脂的填充参数“S”值表达。具有大致对称形状的圆柱形类脂具有约0.74-1的填充参数。其极性区比其疏水区域占更大空间的倒锥形类脂具有小于约0.74的填充参数。具有较小的极性区和较大的疏水区的锥形类脂具有大于约1的填充参数。因此，此中的“互补形类脂”是锥形的，因为醚类脂是倒锥形的，所述互补类脂也具有大于约1的填充参数。
由一类脂分子占据的空间量的度量也是一类脂分子在类脂形成的单层中占据的平均面积(“MMAM”)。各种类脂的MMAM值可容易地由本领域技术人员按本发明所述如在下面的实施例1中所述的那样测定。简要地说，MMAM值可通过首先通过将类脂溶液滴加到水介质的表面而在容纳于一适合槽内的水介质表面上形成一所述类脂的单层而测定。将类脂溶液连续加到介质表面直到表面压力开始增加，然后降低所用槽的区域从而使面积也降低。记录不同表面积的表面压力并绘出面积对压力曲线。通过将曲线的最陡部分外推到零压力处的类脂表面积得到MMAM值。
在由锥形和倒锥形类脂混合形成的单层中类脂分子占据的平均面积可按照式A0＝X1·A1+X2·A2来计算(参见Ali等，其内容通过引用并入本文)，其中“A0”是在二组分系统中类脂的期待MMAM，X1和X2是在所述混合物中类脂的相对摩尔百分比率，A1和A2是各类脂测得的MMAM值。因此，在二组分单层中类脂的混合将期待产生反应每个组分类脂存在于混合物中的相对比例的每类脂分子的平均分子面积(“MMAM期待”)。就是说，按照上式计算，类脂的MMAM期待值将是加合值。
但是，在本发明的类脂层中当甘油类脂与互补形状的类脂混合时，MMAM值的加合并不是这样。而是当在本发明的层中类脂的每分子平均分子面积实际测量时(“MMAM实际”)，发现其至少比相应的MMAM期待值低20％。就是说，在本发明的甘油类脂/互补形类脂层中由每个类脂分子占据的平均面积比按照上式测定的基于单个类脂的平均分子面积的原本期待值低至少约20％。因此，“互补形类脂”也是一种与按此中所述比例的甘油类脂在一层中混合时其MMAM实际比相应的MMAM期待低至少约20％的类脂。
具体的互补形类脂没有限制，包括中性甾醇；阴离子甾醇衍生物诸如磷酸盐、硫酸盐和有机二羧酸盐衍生物；心磷脂；各种磷脂酰乙醇胺诸如二花生四烯酰磷脂酰乙醇胺(“DAPE”)；二和三酰基甘油；类脂质；和这些类脂的混合物。另外的互补形类脂可由本领域技术人员按本发明所述(例如鉴别锥形类脂，其具有大于约1的填充参数并且其形成的甘油类脂/互补形类脂混合物具有比按此中所述计算的相应MMAM期待值低至少约20％的按此中所述测得的MMAM实际值)容易地验证。
优选的互补形类脂是中性甾醇和中性甾醇与阴离子甾醇衍生物的混合物，所述混合物中的中性甾醇与阴离子甾醇衍生物的摩尔比率优选为约5∶1。更优选所述互补形类脂是中性甾醇胆甾醇、阴离子甾醇衍生物胆甾醇硫酸盐或5∶1(摩尔)胆甾醇与胆甾醇硫酸盐的混合物。在本发明的层中互补形类脂优选与甘油类脂混合，从而使类脂基载体的层状类脂组分包含约30％(摩尔)到小于约50(摩尔)甘油类脂和大于约50％(摩尔)到70％(摩尔)互补形类脂。更优选所述混合物含约40％(摩尔)甘油类脂和约60％(摩尔)互补形类脂。因此，在本发明最优选的实施方案中，所述类脂层基本上由约40％(摩尔)甘油类脂ET-18-OCH3和约60％(摩尔)互补形类脂(胆甾醇、胆甾醇硫酸盐或5∶1摩尔比率的胆甾醇与胆甾醇硫酸盐的混合物)组成。
已经计算和测定了二组分类脂系统的MMAM值(见下面和图3A和3B)，所述二组分类脂系统包括以二种类脂的各种摩尔比率的甘油类脂ET-18-OCH3和类脂棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(“POPC”)、二油酰磷脂酰胆碱(“DOPC”)、二油酰磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)或胆甾醇(“CHOL”)。ET-18-OCH3与POPC或DOPC的混合物展现出至多10-15％MMAM的降低，即在所测的类脂浓度范围内存在10-15％MMAM期待值和相应的MMAM实际值的差异。ET-18-OCH3/DOPE混合物也展现出小于约20％的MMAM降低。因此，POPC、DOPC和DOPE均不是互补形类脂。
但是，对于ET-18-OCH3浓度为约30-50％(摩尔)的ET-18-OCH3和胆甾醇的混合物来说，MMAM实际值比相应的MMAM期待值的降低程度大于20％。例如40％(摩尔)ET-18-OCH3/60％(摩尔)CHOL混合物展现出约35％的MMAM降低，而50％(摩尔)/50％(摩尔)混合物展现出42％的MMAM值的降低。因此，在所述相同类脂浓度下，类脂混合物中用胆甾醇取代DOPE产生了与所获MMAM降低程度的显著差异。这种在ET-18-OCH3/CHOL和ET-18-OCH3/DOPE混合物间MMAM降低程度上的差异不能基于CHOL和DOPE的技术知识预测，因为这两种类脂均是锥形以及两者均具有约1.2-1.3的填充参数。然而，CHOL与甘油类脂混合获得了大于约20％的MMAM降低，而DOPE没有。所以，CHOL是一种“互补形类脂”，而DOPE不是。
按下面实施例2所述制备的ET-18-OCH3/CHOL、DOPE、POPC或DOPC脂质体的溶血活性也已测定，如下文实施例3所示。下文图3所示的结果是获得样品培养基中50％的红血细胞溶血所需的各种脂质体中的ET-18-OCH3浓度(H50)。数据表明对于ET-18-OCH3/胆甾醇脂质体来说其H50值为661微摩尔(μM)，就是说为了使50％存在的红血细胞溶解需要在介质中有661微摩尔的醚类脂浓度。ET-18-OCH3/DOPE脂质体展现出91μM的H50，即比ET-18-OCH3脂质体大7倍以上的溶血作用；ET-18-OCH3/DOPC和ET-18-OCH3/POPC脂质体分别具有38和26μM的H50值。因此与甘油类脂/非互补形类脂脂质体混合物比较，在脂质体中甘油类脂和互补形类脂的混合物显著降低了甘油类脂的溶血能力并依此增强了其治疗有效性。
甘油类脂和互补形类脂被混合在类脂基载体的层状类脂组分中。最好，所述载体为一种脂质体，它是一种具有单类脂双层(单室脂质体，“ULV”)或多类脂双层(多室脂质体，“MLV”)的自成型结构。本发明的脂质体优选为具有约25-200nm平均粒径的多室脂质体或单室脂质体。
脂质体可通过各种方法制备(参见例如Deamer和Uster(1983)的一篇综述文章)。这些方法包括(没有限制)Bangham的制备多室脂质体的方法(MLVs)；Lenk的、Fountain的和Cullis的制备具实际相等的层间溶质分布的制备MLVs的方法(“SPLVs”；参见例如美国专利4522803、4588578、5030453、5169637和4975282)；和Papahadjopoulos等人的制备寡层脂质体(“REVs”)的反向蒸发法(美国专利4235871)。ULVs可通过诸如超声(参见Papahadjopoulos等(1967))或挤压(美国专利5008050和5059421)从MLVs制备。本发明的脂质体可通过任何一种这些文献方法制备，这些文献的内容通过引用并入本文。
可采用各种方法诸如超声、匀化、French Press和研磨法从较大的脂质体制备较小的脂质体。挤压法(参见美国专利5008050)可用于制备降低粒径的脂质体，即通过在加压下使脂质体通过给定所选尺寸的过滤器滤孔产生具有预定平均粒径的脂质体。切向流动过滤(参见WO89/008846)也可用于调节脂质体的粒径，即产生整体具更少不均匀性、更均匀的规定粒径分布的脂质体。脂质体粒径可通过多种易实施的方法如准电子光散射法和使用仪器如Nicomp粒度仪测定。上面引用的文献内容通过引用并入本文。
此外，本发明的脂质体可脱水、贮存并然后再生而保留其内容物的基本部分。脂质体脱水一般需要在脂质体双层的内部和外部使用亲水干燥保护剂诸如一种双糖象蔗糖和麦芽糖(参见美国专利4880635，其内容通过引用并入本文)。一般相信这种亲水化合物防止了在脂质体中类脂的重排，从而使其粒径和内容物在干燥处理和通过随后的脱水时得以保持。适合质量的这种干燥保护剂是它们为强的氢键受体并且拥有保存脂质体双层组分的分子内空间的立体化学特征。或者，如果在脱水前脂质体制剂不冷冻可将干燥保护剂省去，足够的水保存在随后脱水的制剂中。
本发明的脂质体可含有一种或多种另外的生物活性剂，即除了生物活性的甘油类脂外的一种或多种生物活性剂。“生物活性剂”是可给予动物的任何化合物或组合物。它们包括用于成象或其它诊断形式的制剂和在动物体上具有生物活性的制剂。生物活性剂包括(但不限于)抗病毒剂、抗菌剂、抗真菌剂、抗寄生虫药、抗代谢物、antiglaucomic、抗炎或抗肿瘤化合物、碳水化合物、氨基酸、肽类、蛋白质、免疫球蛋白、免疫调节剂、染料、毒素、酶、激素、神经递质、糖蛋白、放射性标记物、不透射线化合物、荧光化合物、细胞受体蛋白质、细胞受体配体、散瞳化合物、血管扩张剂、支气管扩张剂、局部麻醉剂、生长促进剂、再生剂等。
通过将生物活性剂溶解于类脂或用于制备脂质体的水相中可将一种或多种生物活性剂负载到脂质体中。或者，通过首先形成脂质体、例如通过跨越最外面的脂质体双层的pH梯度建立一电化学势并然后将可离子化剂加到脂质体外面的水介质中来将可离子化的生物活性剂负载到脂质体中(参见Bally等美国专利5077056和WO86/01102，其内容通过引用并入本文)。最好，所述另外的生物活性剂为一种抗炎药或抗肿瘤剂。
此中也提供包含含本发明载体的组合物，如含药学上可接受载体的组合物。这种载体一般可接受用于与动物的治疗或诊断剂的给药相联系的用途。药学上可接受的载体按照本领域普通技术人员用于测定和计算范围内的多种因素制备，所述因素包括(但不限于)具体所给的药剂以及其浓度、稳定性和所需要的生物利用率；用所述组合物治疗或诊断的疾病；受治疗者，其年龄、大小和一般情况；和组合物的欲给药途径如经鼻、经口、经眼、经局部、经皮、经阴道、经皮下、乳房内、腹膜内、经静脉或经肌内(参见例如Nairn(1985))。用于非肠道生物活性剂给药的一般药学上可接受的载体包括例如D5W(一种含5％(重量/体积)葡萄糖水溶液)和生理盐水。药学上可接受的载体可包含另外的组分例如那些增强活性组分稳定性的物质如保存剂和抗氧化剂。
本发明的组合物可通过一般为本领域接受的标准途径对哺乳动物用药。给药的途径如经静脉、经动脉、经皮下或经肌内或经腹膜内给药根据本发明所述的用于决定和计算的正常技术范围内的多个因素选择。所述因素包括(没有限制)受治疗者的年龄、体重和一般健康情况；想要达到的药物的生物利用率；待治疗疾病的具体形式；所用载体；和所给治疗剂的剂量。
正如上文所述，本发明的甘油类脂可能是治疗上有效的抗癌剂。只要层状形式的与互补形类脂混合的甘油类脂可使甘油类脂的似洗涤剂样的活性直接对着肿瘤而使正常细胞如红血细胞免受负面影响即可。因此，本发明的组合物可通过包括一有效量的甘油类脂的组合物的给药降低肿瘤的大小来用于哺乳动物如人类的治疗中。
甘油类脂的“有效量”是有效降低已经给予甘油类脂药的哺乳动物中的肿瘤大小的类脂量。有效量一般按照多种因素如被治疗者的年龄、大小和一般情况、所治疗的癌症和欲采用的给药途径选择并通过各种方式例如为提供了本发明方法的普通技术人员所熟知和易实施的剂量范围试验决定。一般来说，所述甘油类脂的有效量是每公斤受治疗者体重约1到1000毫克。
可通过用本发明的组合物降低肿瘤的体积来治疗的癌症包括(但不限于)白血病、淋巴瘤、肉瘤和癌以及脑癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌和卵巢癌。按照本发明的实践治疗的动物可给予一种或多种另外的生物活性剂，即除了甘油类脂外的一种或多种生物活性剂。这种另外的生物活性剂可与所述甘油类脂/互补形类脂分别给药，也可作为包含于这些类脂中的相同组合物的一部分给药。
本发明可从下面的实施例更好地理解。但是，本领域技术人员将容易理解这些实施例只用于后面权利要求书定义的本发明的说明。
实施例实施例1每分子平均分子面积(“MMAM”)测量含所述醚类脂ET-18-OCH3制剂的每分子平均分子面积使用来自KSV Instruments(Trumbull，Connecticut)的配有一双隔层结构和一Wilhelmy天平的Langmuir-Blodgett微池测定。ET-18-OCH3制剂用溶解于9∶1己烷∶乙醇的溶剂系统中的类脂粉末制备。制备单类脂溶液和混合物，使其通过磷酸盐精确定量(Chen等，1956)和胆甾醇测定(Rudel和Morris，1973)的总类脂浓度为约1.5mM。通过将样品滴加到池中心的水面(10mM HEPES，150mM NaCl缓冲液，pH7.2)上形成单层。添加样品直到表面压力刚开始上升到零以上，这时记录添加样品的精确体积。等待三分钟待溶剂蒸发和单层稳定后，以15cm2/min的速率减少所述单层的表面积并记录表面压力。溶液水平维持在低于池顶部边缘以下1mm以防止泄漏；由于其亲水性质维持与隔层(由Delrin组成)的接触。
从按上述获得的数据绘制压力对面积曲线(参见图1和2)，并且通过将曲线最陡部分外推到在零表面压力处的值确定MMAM值。在该研究中对任何类脂测得的最高崩溃压力(≤47 mN/m)比用二饱和的PC分子获得的值(＞62 mN/m)低很多，表明崩溃压力不是技术限制的人造的结果。所有试验均在23℃下进行。获得了EL-18与所述类脂胆甾醇、POPC、DOPC或DOPE的混合物的面积对表面压力分布。胆甾醇和DOPE两者具有倒锥形；以前用核磁共振和X-射线的研究已经表明CHOL和DOPE与锥形类脂溶血-磷脂酰胆碱混合时形成层状结构(参见R and等，1975；Madden和Cullis，1982；Wu等，1991)。因为表面积的降低，表面压力随类脂填充入有机体结构取向的单层而增高，每个均成为该类脂的特征；在高表面压力下，所述单层崩溃。通过将所述曲线最陡部分外推到在零表面压力处的值确定MMAM(A0)值；其结果如下ET-18-OCH372.82；CHOL44.82；DOPE82.32；POPC82.02；DOPC82.02。
在每种类脂的不同摩尔百分比率下，ET-18-OCH3与CHOL、DOPE、POPC和DOPC的混合物的MMAM值从图2所示的表面积对压力曲线获得。对于各种ET-18-OCH3/类脂混合物来说，MMAM值的百分降低率顺序为胆甾醇＞＞DOPE＞POPC＞DOPC。由DOPE提供所述类脂混合物的MMAM降低为至多少于20％。但是(参见图3A)，1∶1的ET-18-OCH3/CHOL混合物具有低于期待值(在图中由虚线表示)约252的实际MMAM。已知胆甾醇和DOPE两者均具有倒锥形，令人惊奇的是和DOPE相比，由胆甾醇的类脂混合物提供了MMAM值更大的降低。
实施例2脂质体制备所有磷脂从Avanti Polar Lipids(Alabaster，Alabama)购置。胆甾醇从Sigma Chemical Co.(St.Louis，Missouri)购置；所有使用的类脂和试剂均是最高纯度。脂质体的制备首先通过将适用类脂在溶剂中混合并使用真空旋转蒸发仪将类脂干燥成薄膜以及将形成的膜用缓冲溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4)水合。在没有进一步处理情况下将得到的分散体用于核磁共振分析。对于溶血作用研究，类脂分散体被重复地挤压通过规定孔径的聚碳酸酯Nucleopore膜(Nuclepore Corp.，Pleasanton，California)。将脂质体首先通过0.2μm孔径的膜10次，然后通过0.1μm孔径的膜10次。对于ET-18-OCH3/胆甾醇来说，在通过0.2μm孔径过滤器和最后通过0.1μm孔径过滤器前先使混合物通过0.4μm孔径过滤器10次。脂质体粒径使用来自Pacific Scientific(Menlo Park，CA)的一台NicompModel 270/370亚微细颗粒粒度仪(Submicron ParticleSizer)通过准弹性光散射测定。
首先，测定ET-18-OCH3/类脂系统水合手摇分散体的磷NMR信号以证实层状相的存在(参见图2)。在23℃和37℃下具有胆甾醇和DOPE的40％(摩尔)ET-18-OCH3的磷NMR谱图是典型的层状态类脂谱图(Gruner，1992)。对于DOPC和POPC与ET-18-OCH3的混合物，在较宽的层状图形的顶部有一另外的各向同性组分。对于小和大脂质体的混合物来说谱图相似(Hope等，1986)并且谱线宽度似乎太宽(半峰宽3.6-3.9ppm)而不会是ET-18-OCH3胶束(Kumar等，1988)。为了测定该组分是混合胶束结构还是小的多孔结构，收集离心时在溶液顶部不形成塞状物的部分(混合物漂浮)，并通过薄层层析(TLC)测定ET-18-OCH3与类脂的比率(如下面实施例5中所述)。所述比率基本上和本体样品相同，显示该结构为小脂质体不是富含ET-18-OCH3的胶束结构。
实施例3溶血作用按实施例2所述制备含40％(摩尔)ET-18-OCH3的脂质体。为了保证均匀的粒径分布，将所有脂质体挤压。对于具有稍大于其它样品(40nm)的最终粒径分布(77nm)的ET-18-OCH3/胆甾醇混合物来说，挤压较为困难(需要较高压力)；但是，没有发现在最终制备物中类脂的比率与挤压前不同。
按先前所述(Perkins等，1992)评价溶血作用。简要地说，将每个样品顺序用缓冲溶液稀释并且每个稀释溶液取0.3ml与0.3ml经洗涤的人的红血细胞[4％PBS溶液(v/v)]混合。对于对照来说，则将0.3ml红血细胞悬浮体与0.3ml缓冲溶液(阴性溶血作用对照)或0.3ml蒸馏水(阳性溶血作用对照)混合。将样品和标准品置于37℃培养箱中并搅拌20小时。将试管在低速(2000g)下离心10分钟沉淀出红血细胞。移出二百微升上清液并与1ml水混合。溶血作用通过使用岛津2101紫外-可见扫描分光光度计(Shimadzu Corp，Kyoto，Japan)在550nm处测定吸光度定量。100％溶血作用被定为最大量的从游离ET-18-OCH3获得的溶血作用。
图3显示了四种ET-18-OCH3脂质体制剂和游离ET-18-OCH3的溶血曲线图。溶血作用最小的是ET-18-OCH3/胆甾醇脂质体，其产生50％溶血的ET-18-OCH3浓度(H50)为661μM。这种制剂的溶血作用比ET-18-OCH3的H50为91μM的ET-18-OCH3/DOPE脂质体小7倍以上。ET-18-OCH3/DOPC和ET-18-OCH3/POPC制剂展现出类似的H50值(分别为38和26μM)；游离ET-18-OCH3的H50值为16μM。比较含40％(摩尔)或60％(摩尔)ET-18-OCH3的ET-18-OCH3与胆甾醇的小单室脂质体(“SUVs”)的溶血活性。60％(摩尔)ET-18-OCH3SUVs的溶血活性与游离ET-18-OCH3相当。这证明了我们的怀疑，即同溶血-PC(Kumar，1991；Kumar等，1988)一样，在1∶1化学计量以上ET-18-OCH3并不形成稳定的脂质体结构。
实施例4磷核磁共振(NMR)光谱在23℃或37℃的温度下，在Bruker AC300 NMR分光计上(BrukerInstrments，Billerica，Massachusetts)获得121.51MHz下的光谱。使用6微秒脉冲获得16K点，扫描宽度为50kHz。用50Hz线展宽处理3000获得值的平均值。脂质体样品通过水合混合类脂的干燥膜制得(见上)。使用从Alexis Corp.(San Diego，California)购买的ET-18-OCH3进行NMR分析。除了ET-18-OCH3/胆甾醇混合物含40mg/ml ET-18-OCH3(60-90mg/ml总类脂)外，所有样品含总共20mg/mlET-18-OCH3(约60mg/ml总类脂)。
在23℃和37℃下，40％(摩尔)浓度的ET-18-OCH3与胆甾醇和DOPE的混合物的磷NMR研究结果(参见图5)显示所述类脂为层形态。对于DOPC和POPC与ET-18-OCH3的混合物，在更宽的层状图形顶部有一另外的各向同性组分。
实施例5薄层层析(TLC)首先将含水样品以0.8∶2∶1的比率与甲醇和氯仿混合形成单一相。然后将等分试样加到硅胶板上并在氯仿/甲醇/水(65∶25∶4)中展开，然后用碘蒸汽显色。同时也展开每种类脂标准品。
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权利要求
1.一种具有一层类脂组分的类脂基载体(a)一种具有下式的甘油类脂(glycerolipid)和(b)一种互补形的类脂，其中R1是一个具有式Y1Y2的基团；Y1是-(CH2)n1(CH＝CH)n2(CH2)n3(CH＝CH)n4(CH2)n5(CH＝CH)n6(CH2)n7(CH＝CH)n8(CH2)n9；n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9的和是一个9到23的整数；n1是零或一个1到23的整数，n3是零或一个1到20的整数，n5是零或一个1到17的整数，n7是零或一个零到14的整数，n9是零或一个1到11的整数；n2、n4、n6和n8各分别为零或1；Y2是CH3或CO2H；Z是氧或硫；甘油类脂构成约30％(摩尔)到少于约50％(摩尔)的所述类脂组分；互补形类脂构成大于约50％(摩尔)到至多约70％(摩尔)的所述类脂组分；和所述类脂的MMAM实际比所述类脂的MMAM期待低至少约20％。
2.权利要求1的载体，其中R1是(CH2)17CH3。
3.权利要求1的载体，其中Z是O。
4.权利要求1的载体，其中所述甘油类脂是
5.权利要求1的载体，其中所述互补形类脂是一种中性甾醇、选自硫酸盐、磷酸盐和有机二羧酸盐衍生物的阴离子甾醇衍生物、二或三酰基甘油、心磷脂或二花生四烯酰磷脂酰乙醇胺。
6.权利要求5的载体，其中所述互补形类脂是一种中性甾醇胆甾醇。
7.权利要求5的载体，其中所述互补形类脂包括一种中性甾醇和一种阴离子甾醇衍生物。
8.权利要求7的载体，其中所述中性甾醇是胆甾醇和所述阴离子甾醇衍生物是胆甾醇硫酸盐(sulfate)。
9.权利要求8的载体，其中所述中性甾醇和阴离子甾醇衍生物以各自约5∶1的摩尔比率存在于所述类脂中。
10.权利要求1的载体，其中所述甘油类脂构成所述层状类脂组分的约40％(摩尔)，所述互补形类脂构成所述层状类脂组分的约60％(摩尔)。
11.权利要求1的载体，其中所述甘油类脂是
以及其中所述互补形类脂是胆甾醇、胆甾醇硫酸盐或胆甾醇和胆甾醇硫酸盐的5∶1(摩尔)混合物。
12.权利要求11的载体，其中所述甘油类脂构成所述类脂的约40％(摩尔)，所述互补形类脂构成所述类脂的约60％(摩尔)。
13.权利要求1的载体，为一种脂质体。
14.权利要求13的载体，其中所述脂质体是具有约50-250 nm平均粒径的单室脂质体。
15.权利要求14的载体，其中所述脂质体是一种多室脂质体。
16.一种包含权利要求1的载体的组合物。
17.权利要求16的组合物，包含一种药学上可接受的载体。
18.一种减小哺乳动物中肿瘤尺寸的方法，包括将一定量权利要求17的组合物对所述哺乳动物给药，所述组合物包含能有效降低生长量的甘油类脂。
19.权利要求18的方法，其中所述甘油类脂的有效量为每公斤所述哺乳动物体重约1毫克到约100毫克。
全文摘要
本发明提供类脂基载体,它具有由一种醚类脂和一种互补形类脂组成的层状类脂组分。这种新的类脂混合物可容许将醚类脂以比以前可能的更高浓度混入到载体中。含所述载体的药用组合物可用于治疗,例如用于癌症的治疗。
文档编号A61P35/00GK1240348SQ97180612
公开日2000年1月5日 申请日期1997年10月15日 优先权日1996年10月15日
发明者W·珀金斯, E·梅林, J·C·弗兰克林, A·S·雅诺夫 申请人:利普索姆公司