专利名称：IL－12与IFNα在治疗传染性疾病中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及联合使用白细胞介素-12(IL-12)与干扰素-α(IFNα)预防和治疗传染性疾病的领域。这种联合用药特别适用于预防和治疗慢性传染性疾病，例如病毒感染、细胞内细菌感染和寄生虫感染。
传染性疾病是成人发病和死亡的主要原因(Marglois(1993)《传染性疾病杂志》168,9-14)。例如，病毒性肝病有可能诱发肝硬化及大多数肝癌，使每年有150万人死于该病。目前据估计，全球有3亿人以上是慢性肝炎B感染的携带者，而且每年还要新增5千万人以上(Finter等(1991)《药物》42,749-765)。慢性肝炎C感染尽管不是很常见，它也可能继发肝硬化和肝细胞癌(3)，并且也许是西方国家肝病的主要致病因素(Scrip 2176(1996)p.20)。因此这些病毒感染的防治领域存在大量药物需求。
这些传染病的持续与T细胞产生耐受性并且没有清除病毒有关(Reis&Rouse(1993)《今日免疫学》14,333-335)。目前，使用Ⅰ型干扰素也就是IFNα的疗法，在促进病毒的清除方面已得到成功，实验中测得血清中病毒RNA消失，患者的血清已发生转化。不过，通常只在一部分患者体内观察到持续疗效，即25-30％表现有长期反应的肝炎B患者(Finter等，出处同上)。肝炎C患者产生的反应性是不定的，可取决于感染病毒的基因类型(Clarysse等(1995)《荷兰医学杂志》47,265-271)。Ⅰ型IFN疗法的副作用包括流感样症状、疲乏、体重下降和血小板数减少，限制常规用于临床的最大剂量，降低了反应率。因此，能补充Ⅰ型IFN的作用的一些疗法能够有效提高反应率和改进慢性肝炎病毒感染的免疫疗法的临床疗效。
白细胞介素12(IL-12)曾被称为天然杀伤细胞刺激因子(小林等(1989)《实验医学杂志》170,827-845)和细胞毒淋巴细胞成熟因子(Stern等(1990)《美国国家科学院院报》87,6808-6812)，在几种鼠肿瘤模型中具有潜在的抗肿瘤和抗转移活性(Brunda等(1993)《实验医学杂志》178,1223-1230；Nastala等(1994)《免疫学杂志》153,1697-1706)。尽管IL-12发挥其抗肿瘤作用的机理尚不完全为人所知，但IL-12已显示出具有诱导自然杀伤细胞和T细胞在体外的多种生物作用(Manetti等(1994)《实验医学杂志》179,1273-1283；Wu等(1993)《免疫学杂志》151,1938-1949；Tripp等(1993)《美国国家科学院院报》90,3725-3729；Seder等(1993)《美国国家科学院院报》90,10188-10192；Bloom等(1994)《免疫学杂志》152,4242-4254；Cesano等(1993)《免疫学杂志》151,2943-2957；Chan等(1992)《免疫学杂志》148,92-98)。IL-12激活细胞毒T淋巴细胞的作用在其抗肿瘤活性中被认为是至关重要的(Brunda等(1993)《实验医学杂志》178,1223-1230)。在严重性联合免疫缺陷(8CID)和裸鼠(两者均为T细胞缺损)中，以及在CD8+耗竭的胸腺机能正常的小鼠中，IL-12的抗肿瘤作用都有部分地保持(Brunda等(1993)《实验医学杂志》178,1223-1230；O′Toole等(1993)《免疫学杂志》150,294A)。这些结果证明，IL-12对鼠肿瘤具有潜在的体内抗肿瘤和抗转移作用，还证明了CD8+T细胞对间介抗皮下肿瘤也具有关键作用。
干扰素(IFN)是天然来源的蛋白质，它们具有抗病毒、抗增生和免疫调节活性。已知人体中存在有四类截然不同的干扰素(Pestka等(1987)《生物化学年评》56,727-777；Emanuel&Pestka(1993)《生物化学杂志》268,12565-12569)。IFNα族代表了外周血白细胞受刺激产生的主要一类IFN(Pestka等，出处同上；Havell等(1975)《美国国家科学院院报》72,2185-2187；Cavalieri等(1977)《美国国家科学院院报》74,3287-3291)，成淋巴细胞和成髓细胞的细胞系受刺激也产生IFNα(Familletii等(1981)《抗微生物制剂与化学疗法》20,5-9)。IFNα的抗病毒作用不是通过直接作用于病毒本身来实现，而是在抗病毒感染的保护作用的意义上由于其对靶向细胞的活性来实现其抗病毒作用。干扰素对癌肿瘤能够发挥作用，还能够对机体免疫系统产生影响，例如，激活巨噬细胞和NK细胞，强化细胞膜上大量免疫学上具有显著作用的成分的表达。有关干扰素-cDNA的制备及其直接表达(尤其是在大胸肝菌中)的详细论述，已成为许多公开出版物的主要内容。因此，例如重组干扰素的制备是已知的，例如可参见《自然》295(1982),503-508，《自然》284(1980),316-320,《自然》290(1981),20-26,《核酸研究》8(1980),4057-4074，以及欧洲专利第32134、43980和211148号。
IFNα已被证实对病毒感染的治疗是有效的，例如肝炎B与肝炎C病毒(HBV、HCV)传染，不过大量患者对该细胞活素并不产生应答。IL-12促进Thl成熟和提高CTL与NK活性的能力可能是其能够对抗小鼠病毒传染模型具有保护作用的关键(Orange等(1994)《免疫学杂志》152,1253-1264)。
本发明涉及联合使用IL-12和IFNα来预防和治疗传染性疾病的领域。令人惊奇的是，次优剂量IL-12与IFNα最适度下的剂量促成了体外与体内抗传染性疾病的有效保护作用，尤其是抗病毒与寄生虫感染和细胞内细菌感染。
按照本发明，联合使用IL-12与IFNα并与一种药学上可接受的载体一起，对传染性疾病的治疗和预防是有效的，尤其是对慢性传染性疾病，更优选为病毒感染，例如疱疹(HSV)、HIV、肝炎B、肝炎C等；细胞内细菌感染，例如肺结核、沙门氏菌病、李司忒氏菌病等；和寄生虫感染，例如疟疾、利什曼原虫病、血吸虫病。这些组合物的特征在于IL-12与IFNα相互具有协同作用。它们易于通过不同途径给药，包括胃肠外途径，而且给药量是安全的和足以治疗或预防这些传染性疾病。上述药物组合物可含有用于治疗传染性疾病的其它化合物。本发明也提供了上述这些化合物在制备治疗和预防上述传染性疾病的药物中的用途。
附图的简要说明
图1鼠T辅助淋巴细胞体外分化为成熟Th1或Th2细胞。CD4+T淋巴细胞从鼠脾脏提取。这些细胞用固定的抗CD3抗体激活。用IL-12、IL-4和/或IFNα培养5天后，用ELISA法分析上清液的IFNγ和IL-10。
图2用IL-12和/或IFNα分化的辅助T淋巴细胞产生IFNγ。纯化的CD4+脾细胞用抗CD3激活。将该细胞在含有IL-12和/或IFNα的培养基中培养5天。
图3用IL-12和/或IFNα分化的辅助T淋巴细胞产生IL-10。纯化的CD4+脾细胞用抗CD3激活。将细胞在含有IL-12和/或IFNα的培养基中培养5天。用ELISA法测定IL-10。
图4IL-12与IFNα共同给药抗全身HSV感染在用IL-12、IFNα或运两种细胞活素的联合治疗后，将BALB/c小鼠(每组15只)用HSV-2感染，如一些方法中所述。测量每天的死亡率，直至第20天腹膜内注射(p.i.)，并与感染的、未治疗的对照动物比较。
图5IFNγ损耗对IL-12+IFNα的抗HSV感染保护的作用在相对于HSV-2感染时间的第-3、-1、0、2和4天用抗干扰素γ抗体给药(XMG1、2,100μgip.)。用IL-12与IFNα治疗动物，详见实施例。
图6用HSV-2抗原刺激脾细胞培养物产生IFNγ在感染后培养10天，从未被UV激活的、HSV-2刺激的脾细胞产生IFN-γ。
图7IL-12+IFNα共同给药抗全身mCMV感染的保护作用在用IL-12、IFNα或这两种细胞活素的联合治疗后(如一些方法中所述)，将BALB/c小鼠(每组15只)用mCMV感染。每天测量死亡率，直至第14天p.i.。
本发明提供了IL-12与IFNα在制备治疗传染性疾病、尤其是慢性传染性疾病的药物中的用途。这些传染性疾病是由病毒、细菌、寄生虫和其他微生物的转移所引起的。按照本发明，IL-12与IFNα联合的一个特定用途是制备用于预防和治疗病毒性疾病的药物，尤其是慢性病毒感染，例如肝炎、疱疹、乳头状瘤、或人免疫缺陷病毒感染。本发明进一步的实施方式包括上述化合物在预防和治疗细菌传染性疾病中的用途，优选为细胞内细菌传染性疾病，例如肺结核、沙门氏菌病或李斯特氏菌病。本发明也涉及上述化合物在治疗寄生虫感染中的用途。寄生虫传染性疾病包括疟疾、利什曼原虫病或血吸虫病等传染性疾病。
此外，本发明也涉及用于治疗上述疾病的相应的药物组合物。该药物组合物的特征在于它们含有IL-12、IFNα和一种药学上可接受的载体。这些组合物可另外含有一种或多种用于预防和治疗传染性疾病的化合物。
本发明的结果表明，次优剂量的IL-12与IFNα能够协同产生抗传染性疾病的保护作用，该作用至少在部分程度上是以IFNγ介导。令人惊奇的是，体外实验数据显示，从IL-12/IFNα治疗动物的脾细胞产生IFNγ增加。因此，Th1对传染性疾病的反应升高，强化了IL-12/IFNα联合疗法的有益效果。
已经建立起体外Th1/Th2分化系统，来分析IFNα和IL-12的作用。图1说明了T辅助淋巴细胞体外分化成成熟Th1或Th2细胞的主要特征。图2所示实验证实了IFNα与次优剂量的IL-12在诱导IFNγ上的协同作用，将其作为Th1细胞活性的量度。该作用与IFNα抑制IL-10产生(一种Th2淋巴活素)有关(图3)。
使用2型单纯疱疹病毒(HSV-2)和鼠细胞肥大病毒(mCMV)建立起来的疱疹病毒感染模型进一步支持了这些数据。HSV-2的全身感染i.p感染后，HSV-2分布于多个部位，特别是外周及中枢神经系统。随后在CNS中复制，引起致命性大脑炎。IL-12与IFNα均显示了对HSV-2全身感染的致命作用具有剂量依赖的保护作用。实施例2中，每只小鼠使用50ngIL-12皮下注射(s.c.)或20ngIFNαi.p.，作为细胞活素的次优剂量，仍使HSV诱发的死亡率分别为100％和80％(图4)，当次级治疗剂量的IL-2与IFNα共同给药时，观察到第20天p.i.的存活率有显著提高(p＜0.01)，同时死亡率降低至22％±9(表1)，而对照组为94％±4。对取自未被UV激活的、HSV-2刺激的脾细胞培养物的上清液中IFNγ的量进行比较结果是接受共同给药治疗的动物高于接受单用两种细胞活素之一治疗的动物(图6)。用IFNγ中和抗体XMG1.2先对动物的IFNγ进行耗尽作用，可部分逆转共同疗法中所观察到的存活率明显升高。与IFNγ没有耗尽的共同给药疗法(图5)相比，存活率降低了30％(p＜0.06)。这表明，IFNγ仅是共同给药疗法产生保护作用的部分原因。表1:HSV-2(333)全身感染的小鼠存活率
三次实验的平均±s.e.m.HSV-2的带状疱疹样感染IL-12与IFNα共同给药提高了较严重的带状疱疹样HSV-2感染模型的存活率。HSV-2接种在皮肤表面，导致感觉神经元感染、病毒退行性轴突运输至感觉神经节并在此部位复制。然后病毒从感染的神经节出现在受轴突支配的皮肤部位，产生特征性带状疱疹病变。动物也表现有渐进性CNS感染并发展为致命性大脑炎。与未经治疗的病毒感染小鼠或单用单一疗法治疗的小鼠相比，使用IL-12与IFNα共同给药的疗法(表2)使该感染的存活率显著升高了40％(p＜0.01)。共同给药疗法也降低了带状疱疹病变发展的严重性，尽管该作用是很不确定的(3次试验中有2次显著降低)。mCMV的全身感染鼠CMV感染导致机体许多大量组织产生病理改变，不过病毒复制的主要部位是唾液腺的腺泡细胞。发生死亡的原因被认为是器官组织的损伤和与之有关的免疫介导的病理上因素。在该致命的mCMV感染中，IL-12与IFNα联合给药所获得的存活率高于单用单一疗法治疗的组。在第-2和-1天以每只小鼠5-50ngi.p.的剂量只用IL-12，对致命的mCMV感染有100％的保护作用，但在感染后给药并不能改变疾病的病理效果。为了产生出一种IL-12的次优剂量方案，将感染的时间相对于IL-12治疗的时间延迟2、4或6天。IFNα给药在治疗学上获得抗mCMV诱发死亡率的20-30％保护作用，但没有明显的剂量相关的效果。初步实验表明，每只小鼠400ng IFNαi.p.是次优剂量。该剂量的IFNα与IL-12共同给药的疗法能获得高出受到病毒感染的对照组或单用单一疗法组的存活率(表3)。这些结果在51Cr-释放化验中反映了用来自以相同IL-12方案治疗的动物的脾细胞测量的NK活性。NK活性在IL-12治疗后2天为最大，随后以时间依赖的方式降低(数据没有表示出来)。这说明，在该模型中所观察到的以IL-12为媒介的存活中，NK活性起到一定作用。表2:HSV-2(333)带状疱疹样感染的小鼠存活率
*两次实验的平均±s.e.m.表3鼠CMV感染的小鼠存活率组剂量 死亡率*窗口第5天 第10天
两次实验的平均±s.e.m.
总之，结果说明，次优剂量的IL-12与IFNα共同促成了体外与体内抗传染性疾病的有效保护作用。这些研究表明，由于接受共同给药疗法的脾细胞在体外刺激后产生高浓度的INFγ，存活率升高可能与Th1诱导增加有关。
IFNγ的重要作用也已表现在对细胞内细菌(李司忒氏菌属单核细胞质基因)的防御上。在感染前进行抗IFNγ治疗可提高易感性，而重组IFNγ可提高抗药性。IFNγ的一个主要功能是激活巨噬细胞的microzidal活性，例如产生活性的氧化中间体。此外，已有若干发现证实IFNγ对消除被感染的宿主细胞内寄生虫(L.major)具有重要作用。鼠巨噬细胞对寄生虫的破坏作用是IFNγ诱导这些细胞产生氧化氮的结果。
尤其是正如实验性疱疹病毒感染模型所示，IL-12与IFNα联合在病毒性疾病的控制上提供了优于单一疗法的明显而新的优点。
联合治疗方案在抗其它致命病毒(这里HSV-2)全身感染上提供了显著的保护作用，所用剂量水平在单独给药时仅或多或少是有效的。组合疗法也是显著降低了致命HSV-2带状疱疹样感染的死亡率，并且重要的是已表现为降低该感染模型病变的严重程度。后一个观察结果表明，联合疗法将对限制病毒性疾病的临床表现有效。IL-12与IFNα联合也显著提高了其他致命mCMV感染的存活率，而在以前，我们在单独给药治疗时对此是无能为力的。
在一些实施例中，IL-12在预防学意义上给药，也就是说，在小鼠暴露给病毒抗原之前给药。因此，IL-12对联合疗法的戏剧性作用的贡献很可能是通过非特异性机制、特别是通过诱导IFNγ来起作用的。数据证实，由共同给药疗法提供的大部分保护作用都归因于IFNγ的诱导作用。IL-12/IFNα联合对存活的体内协同作用可以与体外脾细胞对IFNγ产生的抗原特异性诱导作用相关。
IL-12与IFNγ均是对宿主免疫应答施加影响的自然界存在的分子，这两种细胞活素都具有控制病毒性疾病的能力。据目前所知，IL-12与IFNα的作用方式是非常不一样的，不过近来有证据显示，有可能存在一种途径，IFNα藉此改变IL-12的表达水平。诱导这两种细胞活素(或之一)的结果是产生一种不利于病毒继续感染的免疫环境。
IL-12通过影响免疫状况发挥其抗病毒作用。具体来说，IL-12诱导IFNγ，提高NK细胞对病毒感染细胞的溶胞作用，并诱导Th1型应答。Th1表现型细胞反应发展的结果是CD8+T细胞对病毒感染细胞的细胞毒性增加了，以及一类免疫球蛋白转变为IgG2a，同时抑制IgE合成。于是IL-12优化了有效清除病毒所需的环境。
与IL-12相比，IFNα被认为不是主要通过免疫调节来发挥作用的，而是诱发感染细胞的一般性抗病毒状态(Gresser等(1976)《实验医学杂志》144,1316-1323)。抗病毒状态涉及诱发针对病毒复制周期中一定范围阶段的细胞机制。IFNα激活了细胞核内干扰素刺激反应成分(ISRE)，导致大量蛋白质的产生。这些蛋白质包括具有特异性抗病毒功能的Mx蛋白质(Weitz等(1986)《干扰素研究杂志》9,679-689)，一种被双链RNA激活为磷酸化真核生物起始因子2的蛋白激酶，依次阻滞转译和病毒组合(Hovanessian(1989)《干扰素研究杂志》9,641-647)，和2′,5-低聚腺苷酸合成酶涉及新生成病毒成分的降解作用(Pestka等，出处同上)。
IFNα与IL-12的联合疗法通过双重方式使患者受益。首先，IL-12在引导免疫应答中的重要作用可破坏对传染性抗原的耐受性；其次，IL-12对细胞毒T细胞反应的作用将有助于确保该反应足以促进传染剂的整体清除效果。这种控制传染性疾病的细胞活素联合的方法对重要的医药需求领域具有潜在影响。
总之，结果说明，次优剂量的IL-12与IFNα共同促成了体外与体内抗传染性疾病的有效保护作用。这些研究表明，由于在体外刺激后，给以共同给药疗法的脾细胞产生高浓度的IFNγ，存活增加可能与Th1诱导的提高有关。
白细胞介素-12可按本领域已知的方法制备，例如以下文献欧洲专利申请433827号，国际专利申请WO9005147与WO9205256，小林等《实验医学杂志》170,827-845(1989)；Stern等(1990)《美国国家科学院院报》87,6808-6812。白细胞介素-12可按已知的常规的化学合成法、重组法制备，或可从天然原料提纯。
包含在本发明组合物中的IFNα可以是来源于任何天然物质(例如白细胞、成纤维细胞、淋巴细胞)或由其衍生的物质(例如细胞系)，或者是那些用重组DNA技术制得的物质。关于IFNα的克隆和引导其表达(尤其在大肠杆菌中)已成为许多公开出版物的主要内容。重组IFN的制备是已知的，例如Gray等(1982)《自然》295,503-508,Goeddel等(1980)《自然》284,316-320和(1981)《自然》290,20-26，欧洲专利174143号。有多种类型的IFNα，如IFNαⅠ、IFNα2；还有它们的亚型包括但不限于IFNα2A,IFNα2B、IFNα2C和IFNαⅡ(也被称为IFNαⅡ或ω-IFN)。
适用于药物组合物的术语“IL-12”与“IFNα”也包括类似于那些纯化和/或重组蛋白质的多肽，但是这种修饰是天然产生的或故意设计的，例如含有倒置、缺失、嵌入和变型的分子(如IFNα和/或IL-12的pegylated形式)以及任何可从上述分子得到的杂合的或共有的IL-12或IFNα分子。
为了实施本发明的联合疗法，IL-12联合IFNα对患者给药，也就是说，在患者接受IL-12的相同或不同时间阶段将IFNα给药。
有关本发明的IL-12与IFNα的药学上可接受的制剂可用本领域普通技术人员已知的制剂方法制备。这些制剂可以通过标准途径给药。一般来说，这些制剂可以胃肠外给药(例如静脉内、皮下或肌肉内)，局部、透皮、口服或直肠途径也包括在内。此外，这些制剂中可加入可持续释放IL-12和/或IFNα的生物可降解的聚合物，该聚合物被植入在需要进行药物释放的部位附近。生物可降解的聚合物及其用途例如Brem等(1991)《神经外科学杂志》74,441-446所述。IL-12与IFNα的剂量将取决于所治疗的疾病、特定的化合物及其他临床因素，如人或动物的体重与身体条件和IL-12的给药途径。本发明既可应用于人类，也可应用于兽医用途，这是可以理解的。对人胃肠外给药来说，IL-12大约1000ng至10ng/kg体重、优选约为300ng至30ng/kg，一周1至3次，这样剂量一般是足够的。对IFNα来说，大约50μg至0.1μg/kg体重、优选约为15μg至1μg，一周1至3次，该剂量一般是足够的。不过一般认为上面给出的上限和下限供说明之用，是可以突破的。
制剂包括那些适用于胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、气管内和硬脑膜外)给药的制剂。制剂可以方便地以单位剂型方式存在，并可按常规制药工艺制备。这些工艺包括将IL-12和/或IFNα与药物载体或赋型剂混合的步骤。一般来说，通过将IL-12及IFNα与液体载体均匀地立即混合来制得这种制剂。适用于胃肠外给药的制剂包括含水与不含水的无菌注射溶液，其中可含有抗氧化剂、缓中剂、抑菌剂以及使制剂与需接受给药的血液等渗的溶质；和含水与不含水的无菌悬液，其中可包含悬浮剂和增稠剂。这些制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封安瓿和小瓶，并可贮藏在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如注射用水。
优选的单位剂量制剂是含有给药成分的每日剂量或单位、每日亚剂量的制剂(如上所述)或其适当的馏分。
对片剂、包衣片、锭剂或硬胶囊的制备来说，本发明化合物可与药学上惰性的、无机或有机赋型剂混合。适用于片剂、锭剂或硬胶囊的赋型剂实例包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石或硬脂酸或其盐。
适用于软胶囊的赋型剂例如包括植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。对溶液和糖浆的制备来说，可以使用的赋型剂例如包括水、多元醇、蔗糖、转化糖和葡萄糖。对可注射溶液来说，可以使用的赋型剂例如包括水、醇、多元醇、甘油和植物油。对栓剂和局部或皮下用药来说，可以使用的赋型剂例如包括天然或硬化油、蜡、脂肪和半固体或液体多元醇。药物组合物也可含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、矫味剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。它们也可含有其他有治疗作用的试剂。
下列实施例用来详细说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。
实施例例1体外Th1细胞的成熟如下进行关于Th1细胞的体外成熟实验a)鼠脾细胞来自8-10周龄雌性C57BL7/6小鼠的脾脏用来制备脾细胞在Hank培养基+1％FCS中的单细胞悬液。按照标准方法(Cambier等(1987)《斯勘的纳维亚免疫学杂志》27,59)用Geys溶液除去红细胞，并用Percoll梯度离心法将细胞预活化。b)CD4+纯化将每毫升107脾细胞在Hank培养基中培养，加入10μg/ml mAb抗IA/IE(克隆M5/114,Bhattacharya等(1981)《免疫学杂志》127,2488)和10μg/ml mAB抗CD8(克隆53-6.7,Ledbetter等(1979)《免疫学评论》47,63)。在冰上培养30分钟后洗涤(3X)，细胞以5×106个/ml再次悬浮。加入100μl磁力珠(绵羊抗大鼠)，在4℃下旋转30分钟后，用磁体除去靶细胞(结合在珠上的)。CD4+细胞的纯度超过90％。将这些细胞再次以106个/ml悬浮在完整的1MDM中。c)CD4+细胞的活化在48池细胞培养皿上涂mAb抗CD3(克隆2Cll,Leo等(1987)《PNAS》84,1374，涂敷浓度为5μg/ml)。洗涤培养皿(3X)，每池加入500μl纯净CD4+细胞悬液和细胞活素(IL-12、IL-4、IFN+A/D、天然IFN+)及其组合。在37℃与7.5％CO2下培养5天后，用商业上可得到的淋巴活素特异性ELISA法分析细胞培养物的IFNγ与IL-10。
例2病毒感染a)小鼠使用6至8周龄规定不含病原体的雌性BALB/c小鼠，由Harlan-Olac提供。b)病毒原料用含有2％FCS的DMEM培养基(Gibco第22320-022号)使HSV-2(菌株333)WT和mCMV Smith菌株(ATCC第VR-194号)分别在Vero(ATCC第CCL-81)单细胞层培养物和3T3L1(ECACC第86052701号)细胞中生长。当观察到有完整的细胞病变时，用搅拌法从烧瓶中除去汇合了单细胞层。这之后通过冻融与超声处理以释放病毒，然后以3000rpm离心15分钟使之澄清。用标准空斑化验法测定单细胞层的病毒滴定度。从细胞培养物中得到的mCMV原料在此阶段在小鼠体内是非毒性的，因此通过小鼠进行的病毒继代移种制得毒性原料。简单地说，将稀释的原料i.p.注射到小鼠体内，感染后10天除去唾液腺。然后匀化淤血的组织，以释放病毒，并以1400rpm离心10分钟使之澄清。然后再将含有传染性病毒的上清液通过小鼠进行继代移种，产生可能体内引起100％死亡率的病毒原料。c)小鼠的HSV-2感染给动物单次i.p.注射104-105pfu/100μl，进行全身感染。每天监测动物的死亡率，直至感染后(p.i.)第20天为止。在动物左肋部用25G针在皮上划痕，涂以含有106pfu病毒的10μl飞沫，进行带状疱疹样感染。每天监测动物的带状疱疹样病变发展情况和死亡率，直至第14天p.i.为止。d)小鼠的mCMV感染在所有致命感染实验中，用5×103pfu唾液腺衍生的病毒制剂感染小鼠。每天监测感染的病征、记录死亡率，直至第15天p.i.为止。e)用IL-12与IFNα给药以5ml每kg体重i.p.注射或皮下(s.c.)注射PBS+1％w/v BSA中的50ng重组鼠IL-12(比活度为2.1×108U/mg)(Hoffmann-La Roche,Nutley,NJ)。治疗性给药开始于感染后6小时，以后每天一次，持续4天。预防性疗法由在感染前如结果中所述的时间的两次注射组成，每天一次。以5ml每kg体重i.p.注射PBS+1％w/v BSA中的重组人IFNα-A/D(比活度为5×107U/mg)(Hoffmann-La Roche,Nutley,NJ)，时间是感染前2小时，然后是4、24、48和72小时p.i.。剂量范围为每天20与400mg之间。f)体内IFNγ的耗竭大鼠抗小鼠IFNγ抗体，XMG1.2(Pastka等(1987)出处同上)。该IFNγ中和抗体在无菌注射用水中以5ml每kg体重i.p.给药。为了实现体内IFNγ耗竭，每只小鼠在相对于感染的第-3和-1天、感染后第0和2与5天给以总计为5次剂量的100μg IFNγ抗体。该方案体内使由IL-12治疗产生的血清IFNγ水平降低了大约95％。g)体外IFNγ产生在感染后第7至10天从每组得到脾的单细胞悬液，然后在103pfu未被UV激活的HSV-2的存在下，在37℃、5％CO2条件下，在完整的RPMI1640(Gibco培养基第52400-033号)中培养48小时。然后除去上清液，在-80℃下冷冻，然后用商业上可得到的试剂盒(Amersham培养基第RPN2717号)；通过ELISA法化验IFNγ水平。
权利要求
1．白细胞介素-12(IL-12)与干扰素-α(IFNα)的联合使用在制备治疗和预防感染的药物中的用途。
2．根据权利要求1的用途，其中的感染是一种慢性感染。
3．根据权利要求2的用途，其中的感染是一种慢性病毒性感染。
4．根据权利要求3的用途，其中的感染是肝炎、乳头状瘤、人免疫缺陷症或疱疹病毒感染。
5．根据权利要求1或2的用途，其中的感染是一种细菌感染。
6．根据权利要求5的用途，其中的感染是肺结核、沙门氏菌病或李斯特氏菌病。
7．根据权利要求1或2的用途，其中的感染是一种寄生虫感染。
8．根据权利要求7的用途，其中的感染是疟疾、利什曼病或血吸虫病。
9．用于治疗权利要求1至8中任一项所述的疾病的白细胞介素-12与干扰素-α。
10．与一种或多种治疗权利要求1至8中任一项所述的疾病的化合物联合使用的白细胞介素-12和干扰素-α。
11．一种药物组合物，含有白细胞介素-12、干扰素-α和一种药学上可接受的载体。
12．权利要求11的组合物，含有一种或多种治疗传染性疾病的附加的化合物。
13．一种预防权利要求1-8中任一项所定义的疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的IL-12与IFNα对哺乳动物给药。
14. IFNα与IL-12在预防和治疗权利要求1-8中任一项所定义的疾病中的用途。
15．如上所述的本发明。
全文摘要
本发明提供了可用于治疗和预防传染性疾病的联合的IL－12与IFN
文档编号A61P31/04GK1218410SQ97194603
公开日1999年6月2日 申请日期1997年5月7日 优先权日1996年5月13日
发明者戈特弗里德·阿尔伯, 杰奎琳·A·卡尔, 弗兰克·A·马特纳, 迈克尔·J·马尔奎因, 凯瑟琳·帕尔默, 琼·A·L·罗格森 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司