专利名称：以树眼镜蛇毒素的支架为基础的双功能或多功能分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及以树眼镜蛇毒素(Dendroaspin)为基础的嵌合分子，该分子具有抗凝血、抗血小板以及其他活性。本发明还涉及编码这些嵌合树眼镜蛇毒素分子的核酸、包含这些核酸的克隆和表达载体以及该表达载体转化的用来提供重组的多功能嵌合树眼镜蛇毒素的宿主细胞。本发明进一步涉及包括嵌合树眼镜蛇毒素分子的药用组合物及其用于预防和治疗与血栓形成或血小板聚集有关的疾病的用途。本发明进一步还涉及树眼镜蛇毒素的支架用于设计和产生嵌合树眼镜蛇毒素的衍生物的用途，这些衍生物能够抑制血小板的结合整联蛋白活性，另外还具有抗凝血或抗血栓等其他功能。
血液凝集的作用在于为止血塞的凝固和稳定提供一种不溶性的纤维基质。交联的纤维凝块的形成源于一系列血浆蛋白参与的一系列生物化学反应。
急性血管疾病，如心肌梗死、中风、肺栓塞、深静脉血栓和末梢动脉闭塞等都是由于血凝块部分或全部闭塞血管引起的。
血管中形成的血液凝块称为血栓，它的形成依赖于血小板的凝聚。当血管损伤时(也可以是由外科手术引起的)，凝块或血栓的形成过程主要依靠血液血小板与受伤血管内皮表面之间或与血小板与血小板之间的相互作用来完成。
现在，能够预防血凝块形成的药物种类很多，如阿司匹林、番生丁和filopidine。这些产品通常抑制血小板活化和凝聚，或者延迟血液凝集进程，但是它们有很强的副作用，即延长出血时间。而且，仅仅通过自身形成或外源提供的新的血小板就能逆转这些产品的药效。
血小板的凝聚依靠纤维蛋白原和其他血清蛋白与血小板原生质膜上的糖蛋白受体IIb/IIIa复合物的结合。GPIIb/IIIa是被称做整联蛋白的细胞粘附受体大家族中的一员，在这个家族的许多成员中都发现了三肽识别序列Arg-Gly-Asp(RGD)。
肝素和低分子量肝素已经被广泛地用于治疗静脉血栓栓塞等病症，这些病症中凝血酶活性是血栓形成和膨胀的原因。尽管肝素是有效的，但同时也产生许多副作用，如出血和血小板减少症。因此，需要一种特异性更强、毒性更小的抗凝剂。
现在已经得到许多直接凝血酶抑制剂，水蛭素、水蛭原(hirugen)和hirulog(后两者是合成的水蛭素衍生物)，PPACK(一个合成三肽)以及argatroban(一种精氨酸衍生物)是其中的实例。关于这些抑制剂作用的综述见Lefkovits J和Topol E J(1994)，Circulation 901522-1536。尽管理论上说，由于直接凝血酶抑制剂具有单一靶特异性，无直接的血小板影响以及半衰期短，所以它们引起的出血的危险性要比其他抗血栓形成药小，但是出血仍然是最值得关注的副作用。
已经开发了一系列其他的凝血酶抑制剂(见上述Lefkovits J和Topol E J中的表1)，但是已经证明它们的临床毒性太大。
由于动脉粥样硬化引起的动脉局部狭窄的情况，通常通过气囊血管成形(balloon angioplasty)技术外科矫正。这种方法具有侵害性，会导致动脉壁组织损伤，而这种损伤会导致血栓形成。动脉壁中的纤连蛋白等胞外蛋白与动脉血接触。血小板通过整联蛋白受体结合到纤连蛋白的RGD基序上，继而导致血小板聚集和启动形成血凝块的级联反应。需要一种药物，它能够在损伤位点特异性抑制血小板聚集，还能在这些位点处抑制血凝块的形成。这种药物应该无毒，无副作用，例如不会带来引起出血的危险。
整联蛋白是一个细胞表面受体家族，它介导细胞间彼此粘附或细胞粘附到胞外基质上(Kieffer N & Philips D R(1990)Annu Rev CellBiol 6329-357；Hynes R O(1992)Cell 6911-25；Mcever R P(1992)Curr Opin Cell Biol 4840-849；Smyth S S et al(1993)Blood 812827-2843；Giancotti F G和Mainiero F(1994)Biochem Biophys Acta 119847-64)。它们由非共价相连的α和β两种跨膜亚基构成。共有16种不同的α亚基和8种不同的β亚基，它们之间异二聚化，生成20种不同种类的受体(Cark E A & Brugge J S(1995)Science 268233-239)。在这些整联蛋白中，血小板膜整联蛋白αIIbβ3是最有代表性的成员之一。细胞活化时，αIIbβ3整联蛋白主要通过Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列(上述Pierschbacher M D Ruoslahti E(1984)；PlowE F Et Al(1987)Blood 70110-115；Pytela R Et Al(1986)Science 2311559-1562)可以结合数个糖蛋白，上述的三肽序列出现在下列蛋白中纤维蛋白原(Nachman R L和Nachman L L K(1992)J Clin Invest69263-269)、纤连蛋白(Gardner J M和Hynes R O(1985)Cell 42439-448)，von Willebrand因子(Ruggeri Z et al(1983)J Clin Inves721-12)、玻连蛋白(Pytela R M et al(1985)Proc Natl Acad Sci Usa 825766-5770)和凝血栓蛋白(Karczewski J et al(1989)J Bio Chem 26421322-21326)。这些糖蛋白配体和它们的整联蛋白受体之间相互作用的本质是复杂的，并且这些受体(Sims P J Et Al(1991)J Biol Chem2667345-7352)和配体(Ugarova T et al(1995)Thromb Haemostasis 74253-257)的构象都发生了变化。
近来，已经发现来自各种蛇毒的许多蛋白是血小板聚集和整联蛋白依赖性细胞粘附的强抑制剂。这些属于所谓“解联蛋白”家族的蛋白，其中的大部分具有高度序列同源性，分子量小(4-8 kDa)，富含半胱氨酸，并含有RGD序列(Gould R J et al(1990)Proc Soc Exp BiolMed 195168-171)或KGD序列(Scarborough R M et al(1991)J BiolChem 2669359-9362)。除了解联蛋白家族以外，已经从蛇类中眼镜蛇科的毒液(Mcdowell R S et al(1992)Biochemistry 314766-4722；Willams J A et al(1922)Biom Soc Trans 2173 S)和水蛭组织匀浆(knapp a et al(1992)J Biol Chem 26724230-24234)二者中都分离到了大量非解联蛋白的RGD蛋白，这些蛋白具有类似的抑制能力，富含二硫键和分子量小。所有这些蛋白对糖蛋白配体和整联蛋白之间相互作用的抑制能力比线形RGD肽链高1000倍；这是对支架蛋白所含RGD基序的最有利构象做出贡献的一个特征。数个抑制剂的NMR结构已有报道，其中包括蝮蛇毒素(Adler M et al(1991)Science253445-448；Adler M和Wanger G(1992)Biochemistry 311031-1039；Adler M et al(1993)Biochemistry 32282-289)、Flavoridin(Senn HKlaus W(1993)J Mol Biol 234907-925)、锯鳞血抑环肽(Saudek V et al(1991)Biochemistry 307369-7372；Saudek V et al(1991)Eur JBiochemstry 202323-328；Cooke R M et al(1991)Eur J Biochemstry202323-328；Cooke R M et al(1992)Protein Eng 5473-477)、Albolabrin(Jesaja M et al(1993)Eur J Biochem 218853-860)、Decorsin(Krezel A M et al(1994)Science 2641944-1947)和树眼镜蛇毒素(Jesaja M et al(1994)Eur J Biochem 226861-868；Sutcliffe M J et al(1994)Nature Struct Biol 1802-807)，迄今已阐明的唯一共同结构特征是一个暴露于溶剂的环的末端上的RGD基序的位置，该结构特征是决定它们抑制作用的一个头等重要的特征。
最近的研究已经印证了RGD三肽周围的氨基酸在调节蛇毒蛋白的结合配体特异性方面的作用。Scarborough R M et al(1993)J BiolChem 2681058-1065中测试了一些解联蛋白，观察到那些含有RGDW的解联蛋白能够非常有效地抑制纤维蛋白原和纯化的αIIbβ3之间的相互作用，但不能抑制玻连蛋白和纤连蛋白分别与αvβ3和α5β1之间的相互作用，而含有RGDNP序列的解联蛋白则正相反。其他氨基酸序列趋异的结构域可能也起作用(Scarborough et al(1993)出处同上)。
树眼镜蛇毒素是含有RGD序列的短链神经毒素类似物，它和解联蛋白蝮蛇毒素之间在全序列上的序列同源性很低，但它们RGD侧翼氨基酸的却是相似的，这两种蛋白都能强烈地抑制血小板粘附到纤维蛋白原上，但对血小板与固定了的纤连蛋白间的拮抗作用却很弱(Lu X et al(1994)Biochem J 304929-936)。相反，华丽蛇鞭毒素虽然和kistrin之间的序列同源性达65％，但RGD(ARGDNP)周围氨基酸却显著不同，与纤维蛋白原相反，华丽蛇鞭毒素优选抑制血小板粘附到纤连蛋白，并结合到复合物αIIbβ3的别构特征位点上。
Smith J W et al(1995)Journal of Biological Chemistry 27030486-30490设计的蛋白质“环移植”实验，构建了组织纤溶酶原激活物(t-PA)的一种变体，该蛋白可以与血小板整联蛋白αIIbβ3结合。用互补决定区(CDR)的残基取代t-PA的表皮生长因子(EGF)结构域中的表面环中的氨基酸形成具有抗粘附性整联蛋白受体αIIbβ3活性的单克隆抗体的一个CDR。得到的t-PA变体(环移植后的t-PA)以纳摩尔的亲和力与αIIbβ3相结合，并且对于合成和天然的底物都有完全的活性。总而言之，环移植的效果和适用性是无法预测和不确定的。
现在，本发明人已经发现树眼镜蛇毒素的支架使其能被修饰。当通过引入另外的功能性氨基酸序列修饰树眼镜蛇毒素(包括RGD基序)时，所得的分子作为抗凝剂特别有用，并且克服了现有抗凝剂相关的缺陷，上述功能性氨基酸序列的实例包括，参与凝血级联反应的反应因子的激动剂、拮抗剂或抑制剂的活性部分或基序。
本发明的第一个方面提供了一种杂合多肽，其中包括第一个氨基酸序列和一段另外的氨基酸序列，所述的第一个氨基酸序列包含RGD基序并能赋予树眼镜蛇毒素活性，所述的另外的氨基酸序列能赋予除树眼镜蛇毒素活性以外的其他活性。
本发明还提供了一种具有整联蛋白结合活性的杂合多肽，其中包括树眼镜蛇毒素的支架和一段另外的非树眼镜蛇毒素氨基酸序列，该序列优选具有不同的活性。
有利地，本发明的分子具有整联蛋白结合活性，当体内使用该分子时，该分子具有的整联蛋白结合活性导致该分子与血小板结合，从而抑制损伤位点的血小板聚集。而且，非野生型的树眼镜蛇毒素结构域提供次级的，任意的其他功能，例如，抗血栓形成功能，抑制细胞迁移和增殖以及调节信号传导。因此，本发明的分子在抗凝血的活性方面是双功能或多功能的，具体地说是对血栓形成和损伤位点处动/静脉壁增厚的抵抗作用。本发明的多肽具有抗白细胞募集(leukocyte recruitment)、免疫系统激活、组织纤维化和肿瘤发生的活性。
本发明的多肽可以包括至少两个所述的另外的氨基酸序列，优选这两个所述的另外的氨基酸序列是同一序列。
所述的另外的氨基酸序列可以包括两个或多个氨基酸序列部分，这些氨基酸序列部分通过至少一个树眼镜蛇毒素的氨基酸残基被隔开。这两个或多个序列部分可以互换位置，变换它们在所述另外的氨基酸序列天然形式中的氨基酸线性顺序。换句话说，尽管每个部分的实际序列不需变化，但是这两个或多个氨基酸序列部分的天然顺序被改变。
所述的另外的序列可以选自血小板衍生生长因子(PGDF)、糖蛋白(GP)IBα、水蛭素、凝血酶、凝血调节蛋白(特别是它的第5个类EGF结构域)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、转化生长因子β-1(TGFβ1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管紧张肽II(AngII)、因子VIII以及von Willebrand因子(vWF)。
这样就使本发明的分子可以具有多种功能，所以它们不单能抑制血小板聚集，而且对其他例如凝血级联反应中的其他成分(例如凝血酶活性)或者胞内信号传导级联反应中的其他成分(例如生长因子)也有活性。可以对本发明的修饰的树眼镜蛇毒素进行工程化从而使另外的氨基酸序列具有整联蛋白结合活性，因此提供了一种以树眼镜蛇毒素为基础的分子，该分子具有增强的整联蛋白结合活性。
本发明的多肽优选包括一种如图3所示的氨基酸序列。在加入所述的另外的氨基酸序列之前，本发明的树眼镜蛇毒素的支架包括同源性的分子，该分子与树眼镜蛇毒素之间的氨基酸序列同源性可以为约50％，优选约65％，更优选约75％，甚至更优选约85％。
把编码所述另外的氨基酸序列的核酸序列除外，编码本发明多肽的核酸序列与树眼镜蛇毒素核酸序列之间的核苷酸序列同源性可以为约50％，优选约65％，更优选约75％，甚至更优选约85％。
与树眼镜蛇毒素的59个氨基酸残基相比，本发明的多肽可以包括更多或更少数目的氨基酸残基。例如，本发明的分子可以包括45-159个氨基酸残基，优选约49-89，更优选约53-69，甚至更优选约57-61。
所述的另外的氨基酸序列优选被引入树眼镜蛇毒素的支架的(a)环I和/或环II；(b)环I和/或环III；(c)环II和/或环III；或者(d)树眼镜蛇毒素的支架的环I、环II和环III。环I包括第4-16位氨基酸残基，环II包括第23-36位氨基酸残基，环III包括第40-50位氨基酸残基。然而，被引入的氨基酸可以扩展到或取代环外结构域，即可以扩展到或取代1-3位、17-22位以及37-39位的氨基酸残基，从而用被插入的另外的氨基酸序列的残基增加或取代非环结构域的残基。
另外的氨基酸残基优选被引入环I或环II。这样，含有RGD的环III未发生变化，所以树眼镜蛇毒素的整联蛋白结合功能得以保留。
可以把一个另外的RGD基序导入到树眼镜蛇毒素的支架中，优选导入到环I和环II中，从而增强树眼镜蛇毒素活性。
用于插入其他序列的部位优选在树眼镜蛇毒素的支架中第4-16、18-21、23-36或52-59位氨基酸残基之间。
每个被插入的另外的氨基酸序列或另外的氨基酸序列的一部分都优选长为3-40个氨基酸残基的氨基酸序列，更优选3-16个残基，甚至更优选3-14个残基。被插入的另外的氨基酸序列可以从树眼镜蛇毒素的支架的第1-57位中的任何一个氨基酸残基开始。被插入的另外的氨基酸序列可以在树眼镜蛇毒素的支架的第3-59位中的任何一个氨基酸残基终止。
当把两个另外的氨基酸序列插入到树眼镜蛇毒素的支架中时，二者之间的线性距离优选1-35个氨基酸残基，更优选1-14个氨基酸残基。当把多于两个的另外的氨基酸序列插入到树眼镜蛇毒素的支架中时，优选每两个另外的氨基酸序列之间都隔有至少一个天然的树眼镜蛇毒素氨基酸残基。
通过插入、缺失或取代一个或多个氨基酸残基，对含RGD的环进行修饰，在树眼镜蛇毒素的环III中，能被修饰的氨基酸的数目优选为最多8个，最少1个。
RGD环优选具有如表1所示的氨基酸序列。对RGD环进行修饰的优势在于可以提高整联蛋白结合活性，或使其针对特定糖蛋白配体的特异性更强。另外，如果把一个或多个“外源”的另外的氨基酸序列移植到树眼镜蛇毒素的支架中就会对RGD基序产生空间影响，那么对RGD位点周围的环III的修饰，就可以克服任何的空间位阻，从而恢复，也可能增强了RGD功能。
通过插入、缺失或取代一个或多个氨基酸残基，可以对环I和环II进行修饰。尽管优选在树眼镜蛇毒素的支架中的一个或多个位点插入14-36个的残基，但是在树眼镜蛇毒素的支架中插入任何合适的氨基酸数目都会带来期望的双功能或多功能活性。
如果一个移植到树眼镜蛇毒素的支架中的“外源”的另外的氨基酸序列对另一个被移植的结构域或含RGD的环产生空间位阻效应，那么就需要对这些环进行修饰。用Insight II软件制作的电脑辅助分子模型能够被用来预测本发明的“环移植”树眼镜蛇毒素的结构。当各环之间的空间位阻导致功能丧失的情况下，通过适当的方法对树眼镜蛇毒素分子的合适的部分进行修饰，能够“消除”(“design out”)这些效应。有时这种修饰可以是插入许多合适的氨基酸残基扩展一个或多个环结构。
优选的修饰包括，为扩展树眼镜蛇毒素的支架中的某个或多个环而把聚甘氨酸插入其中。能够被使用的其他修饰包括，一个氨基酸残基或多个氨基酸残基的重复单元。为扩展树眼镜蛇毒素环，电脑模型研究能被用来设计所需要的环修饰。
在根据本发明设计一种双功能或多功能分子时，通过取代或缺失单个所选的氨基酸残基可以实现对活性、稳定性或其他所需的生物或生化特性的“微调”。在一个所选位点插入一个或多个残基的修饰也属于本发明的这种“微调”的范围之内。能够在这种分子的一个特定位点处改变氨基酸序列的定点突变技术是本领域技术人员所熟知的。
本发明的第二个方面提供了一种编码一种以上规定的多肽的核酸分子。
可以把这种核酸分子任意地连接到一个启动子，并且任意地连接到一段编码异源蛋白或多肽的核酸序列上，从而编码一个融合产物。上述启动子优选是β-D-异丙基-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，异源蛋白或多肽可以是谷胱甘肽S—转移酶(GST)。
本发明的这个方面也可以包括一种质粒，该质粒包括上述规定的核酸。该质粒优选是pGEX-3X。
本发明的第三个方面是提供一种用上述规定的质粒转化后的宿主细胞，所述宿主细胞优选是Ecoli。
因此，本发明还提供了一种含有上述转化后的宿主细胞的细胞培养物。
本发明的第四个方面是提供一种生产上述规定的多肽的方法，该方法包括，培养上述用来表达所述多肽的宿主细胞，从培养物中抽提该多肽，并将其纯化。
第五个方面，本发明提供了一种生产一种多功能抗凝剂的方法，其中包括如下步骤a)构建一个表达载体，其中编码树眼镜蛇毒素的支架的核酸序列与一个启动子可操纵地相连，同时为了与一个异源蛋白共表达而任意地与其编码基因相连接。
b)通过插入、缺失或者取代一个或多个核苷酸残基，对编码树眼镜蛇毒素的支架的载体的核酸序列中除RGD基序之外的至少一个部分进行修饰，从而使表达的树眼镜蛇毒素的支架中包括一段另外的氨基酸序列，该序列能带来除树眼镜蛇毒素活性之外的其他活性。
c)用上述载体转化宿主细胞，使宿主细胞表达修饰的树眼镜蛇毒素核酸序列。
该方法优选进一步包括以下步骤d)从宿主细胞中抽提出修饰的树眼镜蛇毒素。
e)从细胞培养物的抽提物中纯化出修饰的树眼镜蛇毒素，任意地包括这个步骤，即把树眼镜蛇毒素从共表达的异源蛋白中切割出来。
所述异源蛋白优选是GST，所述的纯化优选利用GST纯化部件中的谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B柱进行亲和层析，接着用Xa因子介导的切割把修饰的树眼镜蛇毒素和GST切割开来。
因此，本发明提供一种通过上述规定的生产多功能抗凝剂的方法得到的上述规定的多肽。
本发明的第六个方面提供一种含有治疗剂量的上述规定多肽的药用组合物，任意地还包括一种药理上可接受的赋形剂或载体。本发明的具有多种不同功能的多种多肽可以被组合在一起成为一种药理上可接受的形式，以便提供一种满足期望的治疗。本发明的多种不同功能的多肽可以被组合在一起成为一种药理上可接受的形式，以便提供一种满足期望的治疗。
尽管可以采用其他的给药方式，例如皮下注射或肌内注射，但是本发明的多肽优选制成静脉内注射或静脉内输注的制剂形式，期望应该提供一种进入个体循环系统的缓释制剂。上述多肽制剂形式还可以采用植入缓释装置，例如用于生长激素给药的缓释装置。
一种制剂可以包括与本发明多肽结合的渗出血(extravasatedblood)形式，其中多肽的浓度为1 nM-60μM。该血可以以备用形式储存，从而为必须避免凝血的情况提供一种及时、便捷的供输注的血源供应，上述情况包括外科手术过程中或外科手术后的情况等。
本发明的第七个方面提供一种用于作为一种药物的多肽。
本发明的第八个方面提供一种上述规定的多肽用来制备一种用于治疗与血栓形成有关的疾病的药物的用途。更具体的说是血栓症、心肌梗死、视网膜新血管形成(retinal neovascularization-)、内皮损伤、异常调控凋亡(dysregulated apoptosis)、异常细胞迁移(abnomal cellmigration)、白细胞募集、免疫系统激活、组织纤维化和肿瘤发生。
本发明还提供了一种用来治疗与血栓有关的疾病的方法，更具体地说是治疗血栓症、心肌梗死、视网膜新血管形成、内皮损伤、异常调控凋亡、异常细胞迁移、白细胞募集、免疫系统激活、组织纤维化和肿瘤发生等病症的方法。该方法包括施用治疗有效量的上述规定的多肽。
现在，结合以下的实施例和附图，对本发明的优选实施方案进行描述
图1给出的是树眼镜蛇毒素分子的基本三维结构。N代表-NH末端，C代表-COOH末端。氨基酸残基被编号。
图2A给出的是树眼镜蛇毒素的核酸序列和相应的氨基酸序列。单个的合成寡核苷酸用数字1-10标示。
图2B是质粒pGEX-DEG的部分限制性酶切图谱。
图3A包括修饰的树眼镜蛇毒素序列对比，插入氨基酸序列列于树眼镜蛇毒素的氨基酸序列之下。
图3B与图3A类似，是各种修饰的树眼镜蛇毒素氨基酸序列(单字母代码)的进一步序列对比。
图3C与图3A类似，给出了本发明的修饰的分子。
图3D是一个给出了本发明修饰后分子的各种活性的列表。
图4给出的是用于克隆和表达修饰的树眼镜蛇毒素融合蛋白的表达质粒pGEM-3X。
图5A给出的是用12.5％的SDS-PAGE凝胶电泳对用含有修饰的树眼镜蛇毒素基因的重组质粒pGEX-DEG转化菌的全细胞裂解物进行比较的电泳图片，其中泳道1显示的是诱导了的转化菌，泳道2显示的是未经诱导的转化菌。
图5B显示的是用10％的SDS-PAGE凝胶电泳对全细胞裂解物进行比较的结果，其中泳道1是诱导的pGEX-DEG转化菌的全细胞裂解物，泳道2是该裂解物的亲和纯化抽提物。
图5C给出的GST-修饰的树眼镜蛇毒素融合蛋白经亲和纯化和Xa因子消化处理所得到的产物在20％的SDS-PAGE凝胶上电泳分析的结果，泳道1是树眼镜蛇毒素，泳道2是GST-Den，泳道3是经Xa因子消化后的GST-Den。
图6A是重组树眼镜蛇毒素在Vydac C18柱上用乙腈梯度洗脱的反相HPLC洗脱图谱(箭头指出的是重组树眼镜蛇毒素的44分钟的保留时间)。
图6B是图6A中44分钟的波峰级分在类似条件下洗脱得到的反相HPLC洗脱图谱。
图7显示的是用环I的抗体R38和R65、环I和环III二者的抗体R51对含PDGF的树眼镜蛇毒素免疫沉淀结果。观察到了一个对应于GST-突变体树眼镜蛇毒素的大小为32kDa的蛋白质。泳道1是用R38探测GST-PDGF的结果，泳道2使用的是R65，泳道3使用的是R51。
图8的柱形图显示的是用PDGF-树眼镜蛇毒素对PDGF诱导的人成纤维细胞增殖进行抑制的实验结果。“肽1”对应于PDGF环I的线性氨基酸序列。
树眼镜蛇毒素是一种来自眼镜蛇科蛇类的毒液中的短链神经毒素同系物，但它无神经毒性。与神经毒素不同，树眼镜蛇毒素含有一个Arg-Gly-Asp(RGD)基序，它对血小板聚集和血小板粘附的抑制能力与来自蝰蛇科蛇类的毒液中的解联蛋白相当。用NMR光谱分析已经测定了溶液中的树眼镜蛇毒素结构(Sutcliffe M J et al(1994)NatureStruct Biol 1802-807)。该结构中含有一个与短链神经毒素相似的核心，但是它还有一个新的环结构和一个暴露于溶剂的RGD-基序。因此，树眼镜蛇毒素是一种具有结构分明的折叠的整联蛋白拮抗剂，该折叠与解联蛋白的折叠不同，它是以神经毒素的支架为基础的。
树眼镜蛇毒素是由一个核心区域和一个由此向外伸展出的3个环形结构构成，这3个环被表示为环I、环II和环III(第4-16位残基、第23-36位残基和第40-50位残基)(图1)。核心结构域包括4个二硫键，这些键空间上彼此紧靠，把上述各环结合在一起。图2所示的为树眼镜蛇毒素的氨基酸序列。
在以下实施例中，所用的材料包括限制性内切酶、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶、IPTG(异丙基-β-D-硫代-半乳糖苷)和感受态细胞DH5α是从LifeTechnologies Ltd(UK)或Promega Ltd(Southampton，UK)购得。Vent(外-)DNA聚合酶由New England Biolab Ltd(Hitchin，UK)提供。寡聚核苷酸由King’S College School of Medicine & Dentistry(London，UK)或Cruachem Ltd(Glasgow，UK)合成并用15％丙烯酰胺/8M尿素凝胶变性PAGE电泳进一步做进一步纯化。脱氧核苷三磷酸(dNTP’s)、双脱氧核苷三磷酸(ddNTP’s)和质粒pGEM-3X是从PharmaciaBiotech Ltd(Herts，UK)购得，其中质粒pGEM-3X是一个把克隆基因与谷胱甘肽S-转移酶(GST)和谷胱甘肽-琼脂糖凝胶CL-4B融合表达的载体。“Geneclean”试剂盒和Plasmid maxi试剂盒分别从Biol101(La Jolla CA，USA)和Qiagen Ltd(Surrey，UK)购得。测序酶2.0从Cambrige Bioscience(Cambrige，UK)获得，[35S]dATP[αS]和125I(15.3mCi/mg碘)分别由NEN Dupont(Hert，UK)和Amersham InternationalPlc(Amersham，Bucks，England)提供。
实施例1-构建编码树眼镜蛇毒素变体的表达载体把野生型树眼镜蛇毒素基因成功地插入质粒pGEX-3X(图2)，按照Lu et al，(1996)J Biol Chem 271289-295所述的方法进行表达。从编码树眼镜蛇毒素的野生型基因起始，用重组DNA技术构建树眼镜蛇毒素基因的变体。对于较长的插入突变体而言，只是把编码非-树眼镜蛇毒素或异源氨基酸的寡核苷酸直接插入到经合适的限制性酶切割后的野生型树眼镜蛇毒素基因，并将其连接。为了作出较小的变化，例如对少数几个氨基酸残基做包括插入、替代和缺失在内的修饰，则使用Clonetech Laboratories的转换基因(TransformerTM)定点诱变试剂盒，并按照说明书方法进行操作。
图2A显示的是合成的树眼镜蛇毒素(Den)基因的核苷酸序列。该基因是根据已知氨基酸序列(Williams J A et al(1992)Biochem SocTrans 2173S)并按照每个氨基酸在E coli中高表达的密码子设计而成(Fiers W(1982)Gene 18199-209)。10个合成的寡核苷酸标示在括号中并用数字1-10单个标示在编码链的上方或非编码链的下方。终止密码子用星号标记。使用三字母氨基酸代码，Den的总共59个氨基酸仅用数字1标记N-端残基精氨酸和数字50标记C-端氨基酸亮氨酸。
图2B是pGEX-DEG的部分限制性酶切图谱。仅显示了树眼镜蛇毒素(Den)基因和它的相关上游区。
图3A显示的是各种修饰的树眼镜蛇毒素分子的氨基酸序列，以下将对其进行更详细地描述。各种情况下，用于修饰的插入氨基酸被列在树眼镜蛇毒素氨基酸序列的下方。
实施例2-含有血小板衍生生长因子(PDGF)结构域的修饰的树眼镜蛇毒素血小板衍生生长因子(PDGF)是一个30kDa的多肽，是一种主要的血清促细胞分裂原以及间充质细胞趋化因子。最初从人的血小板中纯化得到，接着发现其他类型的细胞也产生PDGF，例如平滑肌细胞、胎盘郎罕氏细胞、成纤维细胞和结缔组织。PDGF能够促进细胞迁移和增殖，细胞的迁移和增殖是胚胎发生、伤口愈合等天然过程中的重要因素。PDGF还同多种病理状态有关，例如动脉硬化、纤维化和风湿性关节炎(Heldin C H和Westermark B(1990)Cell Regul1555-566以及Engstrom U et al(1991)J Biol Chem 26716581-16587)。PDGF是由称为链A和链B的两条相似的链组成的二聚体。
如图3A和图3C所示，把来自PDGF的链B的氨基酸序列插入到树眼镜蛇毒素的环II中，保留树眼镜蛇毒素环III中RGD序列的粘附特性。然后通过分析平滑肌细胞和成纤维细胞增殖，测试修饰的树眼镜蛇毒素中的PDGF活性和整联蛋白拮抗剂活性之间的竞争性抑制。图3D概括图3C中实施例得到的结果。修饰的树眼镜蛇毒素分子能抑制ADP诱导的血小板聚集和PDGF诱导的成纤维细胞的增殖。
组装和克隆含有PDGF环I的树眼镜蛇毒素基因含有PDGF环I的树眼镜蛇毒素基因是由以下片段组装而成用BamH I、EcoR I、Hinf I和Hpa II消化野生型基因后得到的4个片段(77mer、76mer、42mer和44mer)以及一对互补性磷酸化的诱变寡核苷酸(81mer和80mer)。把含有上述6个片段的混合物85℃加热5min，接着缓慢地冷却到室温(RT)复性。50μl总体积的反应物16℃连接15小时，上述反应物中含每种片段各1nM、Tris-HCl(pH 7.6)50mM、MgCl210mM、DTT 1mM、ATP 1mM以及5％PEG 8000和5个单位的T4连接酶。连接后，取连接混合物1μl作模板，一对5’端突出的寡核苷酸作引物，加入2个单位的Vent聚合酶进行PCR扩增。2％的琼脂糖凝胶电泳验证了所得到的单一产物的大小是符合预期目标的。然后，把该杂合基因克隆到载体pGEX-3X中，生成含有用PDGF修饰的树眼镜蛇毒素基因的重组质粒pGEX-3X。
转化和质粒DNA的提取用含有PDGF修饰的树眼镜蛇毒素基因的重组质粒pGEX-3X(约5ng)转化50μl的E coli DH5α株。用其中只装有感受态细胞的、装有未连接质粒DNA的以及装有野生型质粒DNA的3个小管建立实验对照。用SOC培养基(含有细菌培养用胰化蛋白胨20g/l、细菌培养用酵母提取物5g/l、NaCl 0.5g/l、KCl 2.5mM、MgCl220μM以及20nM的葡萄糖)培养细菌。转化后接着把转化菌在不含氨苄青霉素的培养基中复壮1小时。转化完成后，铺平板培养(plate out)获得充足量的上述每种细菌培养物。用含氨苄青霉素的SOC培养基培养细菌。pGEX-3X的氨苄选择性标记赋予每个转化菌氨苄抗性，使得转化菌得以生长，而所有未转化菌也就相应地被淘汰。过夜培养后，对照用的培养基平板无细菌生长。
从上述培养基平板上挑取单个的克隆，每个这样的克隆都意味着一个修饰的树眼镜蛇毒素基因。把这些克隆在含氨苄的培养基中培养数个小时。上述培养物各取少量，并转移到新的含氨苄培养基中。向起初所用的培养基中加入灭菌的甘油可以使其能够在-70℃下保存作为原种储存物。剩余的大量培养基过夜培养。按照说明书方法(QIAGEN)用微量制备法(快速提取用)或大量制备法(DNA测序用)从转化后的细菌培养物中分离DNA。用质粒微量提取法从每种培养物中再一次提取质粒DNA；这些质粒中的大部分都含有经过修饰的树眼镜蛇毒素基因。对含有树眼镜蛇毒素基因片段的质粒结构域进行测序，以验证修饰是否发生以及是否正确。用Sanger et al(1997)Proc Natl Acad Sci 745463-5467的双脱氧链终止法对所插入的片段进行全序列DNA测序。
蛋白质表达按照标准方法，具体地说是按照Sambrook et al(1989)分子克隆实验指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY中描述的方法，用修饰的质粒pGEX-3X转化E coil DH5α。转化后的培养物用于蛋白质的表达。用过夜的种培养物(1％，V/V)接种培养基，然后把该培养物加入到LB/amp培养基(100μg)中，37℃下振荡培养，直至培养基的A600为0.7。然后，加入IPTG至其终浓度为0.1继续诱导培养。温度降至30℃的条件下让细胞培养物再继续生长4小时，然后离心收获细菌。
融合蛋白质的纯化用下述方法纯化重组的树眼镜蛇毒素用磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)悬浮细胞沉淀，置于冰上超声波裂解，该PBS中含有1％的triton X-100和蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)(1mM)，来自大豆的胰蛋白酶抑制素(1μg/ml)，EDTA 1mM。超声波裂解后的产物在4℃下47,800×g离心10min，沉淀细胞碎片和不溶物。利用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶CL-4B层析柱，通过亲和层析把重组GST-树眼镜蛇毒素和GST-修饰的-树眼镜蛇毒素从上清中纯化出来，该亲和层析过程先在含有150mM的PBS吸附吸附，接着用含有10mM还原性谷胱甘肽的Tris-Hcl(pH8.0)洗脱。在聚丙烯酰胺凝胶上，洗脱的得到的与谷胱甘肽吸附的物质在大小为32kDa处迁移形成一条主带(图5A和图5B)。
在含NaCl 150mM、CaCl21mM的溶液中，包括32kDa融合蛋白的适当级分在4℃下用Xa因子(1∶100，W/W，Xa因子融合蛋白)消化24h。SDS-PAGE电泳显示，用Xa因子处理纯化的GST-蛋白质，释放出两个蛋白条带，其中的重组蛋白迁移至7-kDa，与树眼镜蛇毒素大小相当，游离的GST则显示为28-kDa的强带。把消化后的混合物加到Vydac C18反相HPLC分析柱(TP104)上，用线性梯度为0-26％的含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度洗脱(1.78％每分钟)进行梯度，接着再用26-36％的含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度洗脱(0.25％每分钟)洗脱。图6A和6B显示的就是反相HPLC实验的洗脱图谱。
Western印迹SDS-PAGE(12％)电泳分离融合蛋白质(10μg)，并经过半干印迹转移到硝酸纤维素膜上，其中使用的电流密度是0.8mA/cm2。把硝酸纤维素膜置于含5％奶粉的TBS/Tween缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，0.1％Tween)中，室温(RT)下封闭2h，然后用一抗作为探针与硝酸纤维素膜杂交过夜，接着用连接到辣根过氧化酶上的抗-兔或抗-鼠的二抗杂交2h。然后，用氨乙基咔唑(aminoethylcarbazole)显示印迹结果(图7)。
抗体R51的制备用异双功能交联剂硫代琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己基-1-羧化物(硫代-SMCC)和γ-马来酰亚胺丁酸盐琥珀酰亚胺(GMBS)，分别通过兔血清白蛋白(RSA)和巯基，把多肽1(PDGF的线性氨基酸序列)偶联到牛甲状腺球蛋白(Tg)上。使用厂商建议的方法。把偶联物按1mg/ml的浓度用PBS稀释，-20℃存储备用。
用Tg-肽1免疫新西兰白兔(每只兔皮下注射含100μg Tg-肽1的溶液1ml，其中PBS∶弗氏完全佐剂为1∶1)。6周和12周后，用同等剂量加强免疫，但其中的佐剂为弗氏不完全佐剂。最后一次加强免疫10天后，取终血(final bleeds)。分装抗血清，-20℃存储备用。
抗体R38和R65的制备按照生产者描述的方法，用亲和层析(Hi-TRAP，蛋白-G，Pharmacia，Upsala，Sweden)从上述抗血清中纯化出IgG(R38和R65)。用SDS-PAGE电泳检测纯度。把IgG的PBS溶液过滤除菌，分装，-20℃存储备用。
实施例3-RGD功能(树眼镜蛇毒素 活性)的鉴定血小板聚集按照Lu X et al(1994)Biochem J 304929-936中描述的方法通过光透射的增加来测量血小板的凝聚，并通过血小板的凝聚来鉴定RGD功能。简单地说，从健康个体抽取柠檬酸盐人血，200g离心15min从中制备富含血小板的血浆(PRP)。1200g离心15min从PRP中制备血小板。用粘附/凝聚缓冲液(145mM NaCl、5mM KCl、1 mMMgCl2、2 mMCaCl2、10葡萄糖、3.5mg/ml BSA和10mMHEPES，pH7.35)漂洗和重悬血小板，并将浓度调整到3×108/ml。在纤维蛋白原的浓度为1.67mg/ml时，用10μM ADP诱导血小板聚集，用一个连接到图表记录器上的Payton Dual-Aggregometer测量凝聚结果。
血小板粘附为了鉴定RGD功能，再按照上述Lu X et al(1994)中描述的方法测量血小板粘附。简单地说，用以合适浓度(2-10μg/ml，100μl体积)重溶在PBS(pH 7.4)中的纤维蛋白原或纤连蛋白包被96孔板，4℃过夜。用合适浓度的拮抗剂处理血小板3min，然后取该混合物90μl加入到用500μM的ADP 10μl预包被过的微量板，得到终浓度为50μM，使用显色缓冲液(乙酸钠，10mM对硝基苯磷酸，0.1％ Triton X-100，pH5.5)130μl/孔，通过测量内源性酸性磷酸酶确定粘附的血小板的数目，用自动板阅读仪(automatedplate reader)在410/630nm条件下读取数值。
配体的碘化以及配体结合实验按照厂商建议的方法用Enzymobead Radioiodination Reagent(Biorad Laboratories)把树眼镜蛇毒素的所有变体全部碘化。在与上述Lu X et al(1994)基本相同的平衡条件下，让125I-标记的解联蛋白、树眼镜蛇毒素和修饰的树眼镜蛇毒素结合到洗涤后的血小板上。温育的混合物中含有洗涤后的血小板(3×l08/ml)300μl、激动剂(1.75mM ADP终浓度为50μM)10μl、125I-标记的蛋白样品l0μl、重悬缓冲液5-20μl，补足至混合物的终体积为350μl。抗体抑制实验中，在与ADP接触前用抗体预处理血小板悬液30min，然后加入125I-标记的蛋白样品，混合物在室温下再温育60min。把混合物装载到25％(W/V)蔗糖、1％BSA垫层上终止温育，在12,000g离心10min。对血小板沉淀和上清都进行计数，确定结合态和游离态血小板的水平。用50倍预冷蛋白样品或解联蛋白或10mM EDTA，确定背景结合水平。
移植环的鉴定依靠所移植环的亲本蛋白，来鉴定所移植环的功能。
实施例4-分析树眼镜蛇毒素中PDGF环I的作用竞争ELISAs(CELISA)把相应量的Den-PGDF和PGDF作为竞争剂同时加入到适当稀释后的兔抗-PGDF抗血清中，温育2h。每种兔抗血清的使用浓度都在标准直接ELISA曲线的直线部分所对应的浓度范围之内，405nm处的OD值为1.2-1.5，与加入底物共育30min后，对合适的RSA-多肽偶联物进行分析。
细胞培养和[3H]-胸腺嘧啶掺入实验人包皮成纤维细胞(使用第7-10代细胞)维持在含有10％FBS的完全DMEM中。在75cm3的组织培养瓶中培养细胞至接近铺满单层时，用胰酶消化，记数细胞，然后以10000个细胞/孔的密度接种在24孔(Costar)或48孔(Falcon)的平底组织培养板上，直至细胞长到大约65％铺满(2天)。用含有0.2％或0.4％FBS的完全DMEM代替以前的培养液，培养48-72小时使细胞休眠。整个细胞培养过程都是在37℃，空气中含8％CO2的潮湿环境中进行。
在起点时间(time zero)，用分别包含有不同浓度Den-PDGF和肽P1(PDGF结构域的线性序列)的完全DMEM替换细胞培养液，导致生长因子诱导的细胞增殖被抑制。用于诱导的PDGF浓度范围为10-20ng/ml。
20-22h后，加入[3H]胸腺嘧啶(0.3mCi/100μl/孔)并培养至27.5-28h。吸出培养液，用冷的PBS洗涤细胞两次，加10％TCA 500ul固定细胞，并在4℃温育30min。接下来用70％乙醇0.5ml洗涤细胞一次，并将其储存于-20℃。在每孔中加入0.1N NaOH 500ul并在室温下作用30min裂解细胞。从每孔中各取样品400μl用液闪记数来定量细胞掺入的[3H]胸腺嘧啶。细胞增殖的抑制百分率按以下公式算出
M*表示修饰的树眼镜蛇毒素图8显示了实验的结果，在6.5-65μM范围内，PDGF-树眼镜蛇毒素对PDGF诱导的细胞增殖的抑制率达10-34％(用作对照的野生型树眼镜蛇毒素没有发现抑制作用)。
实施例5-含有一段来自凝血调节蛋白第5个类EGF结构域的序列的修饰的树眼镜蛇毒素凝血调节蛋白为凝血酶的受体。凝血酶是一种类似胰酶的丝氨酸蛋白酶，在淤血和血栓形成中起中心作用。在凝血级联反应中，凝血酶是最终的关键酶，它以蛋白酶剪切的形式切割纤维蛋白原，释放出血纤肽A和B并产生血纤蛋白单体，该单体可以聚合形成止血栓。除了切割纤维蛋白原外，凝血酶通过产生凝血酶激活中的辅助因子Va和VIIIa对自身的产生有正反馈作用。因子XIII也可以被凝血酶激活，交连并起到稳定血纤蛋白聚合体的作用。自然的抗凝血机制是通过以下途径来限制这些过程的丝氨酸蛋白酶抑制剂和抗凝血酶III介导的抑制作用以及凝血酶/凝血调节蛋白复合物对蛋白C的激活。凝血调节蛋白是位于内皮细胞表面的受体，它在将凝血酶转变成有效的蛋白C激活剂的过程中，通过降低其催化血栓形成的能力结合并改变凝血酶的分子特异性。被激活的蛋白C能够破坏Va和VIIIa，终止凝血级联反应。因此，原凝血机制和抗凝血机制之间的平衡可以维持正常的生理状态，允许凝血酶在局部产生，同时可以防止它变成系统的，具有潜在危险的过程。此外，凝血酶也可以激活血小板和内皮细胞。血小板一旦被凝血酶激活，便发生形态上的改变，聚集并释放储藏的颗粒状内容物(例如，血小板因子-4，ADP，5-羟色胺)。凝血酶也可以增加血栓烷A2和血小板激活因子的合成和分泌。凝血酶和内皮细胞的相互作用可以导致各种因子(如组织纤溶酶原激活因子，PDGF，内皮素)的分泌，并加速结合凝血调节蛋白的蛋白C的活化，该凝血调节蛋白可启动蛋白C抗凝血途径。
作为实例，将来自凝血调节蛋白的第5个类EGF的结构域序列移植入树眼镜蛇毒素。根据其对纤维蛋白原凝血的抑制来测定这一新的蛋白同凝血酶的亲和力。
根据实施例1中的程序构建合适的表达载体，不同之处是将一凝血调节蛋白的结构域插入到树眼镜蛇毒素，如图3A所示，序列插入到树眼镜蛇毒素的环II区。
按照实施例1的方法，对TM修饰的树眼镜蛇毒素进行表达、分离和纯化，并按照实施例2的方法对该修饰的蛋白进行RGD功能的测定。
人凝血调节蛋白的分子量大约为100KDa，包含有一个和C型凝聚素同源的N端结构域，6个串联重复的类表皮生长因子(EGF)的结构域，一个富含Ser/Thr的结构域，一个跨膜结构域和一个短的细胞质尾。在如图3C所示的一个具体的实施例中，我们将来自凝血调节蛋白的第5个类EGF结构域插入到树眼镜蛇毒素中，并对树眼镜蛇毒素中的合适部分做另外的修饰，以次来防止导致其生物学功能丧失的空间位阻的发生。
如图3D所示，修饰的树眼镜蛇毒素分子具有ADP诱导的以及凝血酶诱导的血小板凝集活性，并延长了凝血酶的凝血时间。
实施例6-树眼镜蛇毒素中的凝血调节蛋白结构域的作用分析凝血酶诱导的纤维蛋白原凝血时间凝血酶诱导的纤维蛋白原凝血时间用Amelung KC-10仪器按照下面的方法进行。取含有150mMNaCl和5mM CaCl2的pH7.5的50mM的凝血酶(3.3μg/ml)的Tris-HCl溶液50μl，与10μl的各种浓度的修饰的树眼镜蛇毒素(Den-TM)和野生型树眼镜蛇毒素(作为比较的对照)混合。在37℃温育2min后，加入溶解在相同缓冲液中的纤维蛋白原100μl(160μg/ml)。
蛋白C激活为了检测Den-TM是否对蛋白C激活有影响，按照Tsiang(1990)等在Biochemistry 2910602-10612中描述的方法，进行了一个两阶段的分析。第一阶段，将凝血酶和蛋白C以合适的终浓度加入到一个110μl的反应体系中，该体系有或没有野生型或突变型的树眼镜蛇毒素以及2mM CaCl2或1mM Na2EDTA。反应混合物在37℃温育30min，然后加入抗凝血酶III和肝素终止反应。活性蛋白C的产生根据其水解底物S-2366来检测。
所述凝血酶诱导的血小板聚集按照上述实施例3中的方法，对野生型和突变型树眼镜蛇毒素进行凝血酶诱导洗涤过的血小板聚集的测定，不同之处是凝血酶作为激动剂。
凝血调节蛋白结合凝血调节蛋白结合实验的操作方法参见上述Tsiang等(1990)中的描述。
实施例7-包含有来自糖蛋白(GP)IB序列的修饰的树眼镜蛇毒素糖蛋白(GP)IBα对于在血小板上表达高亲和力的α-凝血酶结合位点是需要的(Marco等(1994)J Biol Chem 2696478-6484)。该功能对于淤血和血栓形成的启动具有重要的作用，并且可能在病理性血管阻塞中起重要作用。为了创造一个同时具有凝血酶和整联蛋白拮抗剂活性的分子，把来自GP IB的一段序列插入到树眼镜蛇毒素中构建得到修饰的树眼镜蛇毒素。
按照实施例1的方法构建一个合适的质粒表达载体，不同之处是，糖蛋白IBα结构域插入到树眼镜蛇毒素分子的环I区，如图3A和3C所示，移植结构域的氨基酸残基与树眼镜蛇毒素的全氨基酸序列连接在一起。
正如图3D中概括的那样，修饰的树眼镜蛇毒素分子能抑制凝血酶活性和血小板的凝聚。
包含有糖蛋白IB(GP IB)结构域的树眼镜蛇毒素基因的组装和克隆包含有糖蛋白IB(GP IB)结构域的树眼镜蛇毒素基因的组装来自在用BamHI、EcoRI、HinfI和HpaII消化和一对磷酸化的突变寡聚体(oligos)(83mer和82mer)扩增后，把来自野生型基因的片段(81mer，82mer，42mer和44mer)组装在一起。退火、连接、PCR和组装的实验方法同前述的Den-PDGF的相似。
按照实施例1的方法进行IBα修饰的树眼镜蛇毒素的表达、分离和纯化，而该分子RGD功能的测定则按照实施例3中描述的方法进行。
实施例8-分析树眼镜蛇毒素中的GP IB结构域的作用凝血酶同血小板结合的测定凝血酶同洗涤过的血小板的结合的测定在无钙的凝聚/粘附缓冲液中进行(参照实施例3中血小板聚集的测定)。洗涤过的血小板在用前先在37℃平衡10min，然后同125I-α-凝血酶在25℃作用10min。配体浓度结合功能的测定采用固定浓度(0.1nM)的125I-α-凝血酶与渐增浓度(1-200nM)的未标记的α-凝血素混合。向凝血酶混合物中加入血小板来启动结合。温育10min后，在一层20％蔗糖中12000g离心10min(Lu等(1994)上述)，将血小板和结合的凝血酶同未结合的凝血酶分离开。
包含有GP IB结构域的树眼镜蛇毒素对凝血酶与血小板结合的影响按下面的方法来评价将不同浓度的突变体同洗涤过的血小板混合，然后加入固定浓度的125I-α-凝血酶。结果分析参照以前所述的方法(Lu等(1994)上述)。
血小板聚集和分泌的测定用虫荧光素-荧光素酶实验测定血小板的致密颗粒(dense granules)中释放的ATP。洗涤过的血小板以2.5×108/ml重悬在0.4ml无钙的凝聚/粘附缓冲液中，0.4ml的等份(aliquots)测定采用lumiaggregometer(Chrono-Log Corp)。然后加入虫荧光素-荧光素酶试剂50μl，接着按终浓度为0.26nM加入α-凝血酶。由此产生的ATP释放用lumiaggregometer(Chrono-Log Corp)通过记录荧光的变化来测定。血小板聚集的测定按实施例3所述。为了检测包含有GP IB的突变树眼镜蛇毒素对ATP释放和血小板聚集的抑制作用，在加入虫荧光素-荧光素酶和凝血酶之前先用突变蛋白同血小板在37℃温育5min。
凝血酶的酰胺水解活性和纤维蛋白原的凝血凝血酶的酰胺水解活性和纤维蛋白原的凝血的测定参照下述的实施例10。
实施例9-含有水蛭素的一个结构域的修饰的树眼镜蛇毒素水蛭素是分离自吸血水蛭Hirudo medicinalis的一种凝血酶的强抑制剂，是一种仅含有65个氨基酸残基的单个多肽链的蛋白(Maraganore等(1989)J Biol Chem 2648692-8698)。我们构建了包含有来自水蛭素的氨基酸残基Asn52-Leu64或Phe45-Gln65的修饰的树眼镜蛇毒素。新的构建体包含有抗凝血酶结合和抗血小板粘附的结构域。
质粒表达载体的构建如实施例7所述，不同之处在于，为了在树眼镜蛇毒素的环II中的氨基酸残基PRP做一个小的变化，而再构建另外一个突变位点。这一小变化是用Clonetech Laboratories的TransformerTM定点诱变试剂盒完成的。实验方法的具体操作参照试剂盒说明进行，不同的是将水蛭素结构域移植到树眼镜蛇毒素的环I和环II中。修饰的分子如图3A和3C所示，从水蛭素来的氨基酸残基同原始的树眼镜蛇毒素残基线性连接在一起。图3D显示了图3C中的修饰的分子是如何推迟凝血时间以及抑制ADP或凝血酶诱导的血小板的凝聚。
Den-HR的表达、分离和纯化基本同实施例1所述中所描述的方法。该分子的RGD功能建立参照实施例3的方法。
实施例10-树眼镜蛇毒素中水蛭素结构域的作用分析α-凝血酶的酰胺水解活性测定使用产色底物S-2238(Chromogenix)和终浓度为0.06单位/ml的α-凝血酶来进行。凝血酶可以使底物释放p-硝基苯胺，反应的速率是在微量滴定板上用自动分光光度计(Autoreader III，Ortho Diagnostic Systems)在405nm波长下检测的。Den-HR对凝血酶切割产色底物的抑制效果是在终浓度为nM-mM的范围内测定的。凝血酶和Den-HR首先预混合，然后加入底物启动反应。为了评估纤维蛋白原的凝固活性，取溶有α-凝血酶(终浓度为1nM)的pH6.5的0.05M磷酸钠溶液(BSA，终浓度为1％)200μl，在室温温育5min，然后加入含有0.011M柠檬酸三钠作为抗凝剂的正常血浆。在37℃用自动凝血计测定观察到纤维蛋白原凝固的开始时间。突变体对α-凝血酶介导的纤维蛋白原凝固的影响的测定方法如下用在一定浓度范围内的突变体代替开始混合物中的HEPES缓冲液。
实施例11-修饰的树眼镜蛇毒素，其中含有一段并可以阻断凝血酶促血凝活性的基于凝血酶的多肽人凝血酶上的凝血调节蛋白结合位点位于凝血酶B链的一个区域内。如图3B所示，将该位点的序列引入树眼镜蛇毒素中形成双功能分子，可以阻断凝血酶的促血凝活性，并抑制ADP/凝血酶诱导的血小板聚集。对该突变体的功能特征研究的实验包括按照实施例6所述的方法测定凝血酶诱导的纤维蛋白原凝固时间以及按照实施例3和6所述的方法测定ADP/凝血酶诱导的血小板聚集。图3D总结了该双功能分子的性质，即能够推迟凝血酶凝固时间和抑制ADP或凝血酶诱导的血小板聚集。
在图3C所示的分子中，因为引入的外源序列导致了空间位阻效应，例如当将来自PDGF的序列引入树眼镜蛇毒素中时，虽产生了抗PDGF活性，但抗血小板活性却丧失了，所以这种情况下就需要对环进行修饰。将一个与树眼镜蛇毒素环III类似的RGD环引入树眼镜蛇毒素环I就消除了这种空间位阻效应。以树眼镜蛇毒素支架为基础构建的分子的序列及其功能分别总结于下面的表1和图1中。
实施例12-修饰的树眼镜蛇毒素的定点诱变上述修饰的树眼镜蛇毒素中的每一个都可以通过定点诱变方法对RGD环的周围或其他任何部分进行修饰。所用方法见上述Lu等(1996)中的描述。图3B显示了可能的RGD侧翼区修饰和树眼镜蛇毒素活性分析结果。一些修饰可增强活性，而另一些修饰则使活性消失。
实施例13-修饰的树眼镜蛇毒素在豚鼠动脉血栓模型中的抗血栓括性按照Carteaux J P等在Circulation 911568-1574中详细描述的方法，利用豚鼠动脉血栓模型可以体内测试上述实施例中的4个修饰的树眼镜蛇毒素的抗血栓活性。每种修饰的树眼镜蛇毒素各取多种不同剂量分别静脉灌注动，所取剂量位于0.1mg/kg-1mg/kg范围之内。50-150IU/kg的肝素或安慰剂可以作为平行对照实验。
实施例14-兔动脉粥样硬化模型中动脉损伤后修饰的树眼镜蛇毒素对细胞增殖的活性利用Ragosla M等(1996)在Circulation 931194-1200中所述的兔体内模型系统，可以对Den-PDGF，Den-TM，Den-GP和Den-HR进行测试。诱导动脉粥样硬化后，向兔的静脉中灌注0.1mg-0.5mg/kg的上述修饰的树眼镜蛇毒素。第一组对照是向动物动脉内施用单一丸剂形式的肝素(150IU/kg)。第二组对照为用生理盐水代替修饰的树眼镜蛇毒素。先气囊血管形成术对实验和对照组进行处理，然后进行定量血管造影(quantitative angiography)，测定激活部分促凝血酶原激酶(thrombosplastin)时间(aPTT)，3H胸腺嘧啶掺入损伤动脉血管，最后进行管腔狭窄研究。
实施例15-用体外猪模型对修饰的树眼镜蛇毒素的溶栓活性进行测试该项实验可以采用Mruk J S等(1995)Circulation 93792-799中的模型体系。向患有阻塞性血栓的猪静脉内注射0.1mg-1mg/kg实施例12中提到的树眼镜蛇毒素。可给对照动物施用一定剂量的肝素和水蛭素(100IU/kg的丸剂，然后以20IU/kg灌注)。只使用生理盐水的动物也用作对照。
权利要求
1.一种杂合多肽，它包括第一个氨基酸序列和一段另外的氨基酸序列，所述的第一个氨基酸序列包含RGD基序并能赋予树眼镜蛇毒素活性，所述的另外的氨基酸序列能赋予除树眼镜蛇毒素活性以外的其他活性。
2.一种具有整联蛋白结合活性的杂合多肽，它包括一个树眼镜蛇毒素的支架和一个非树眼镜蛇毒素的另外的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的多肽，包括至少两个所述的另外的氨基酸序列，任选地所述的另外的氨基酸序列是相同的。
4.如权利要求1-3任一项所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列包括两个或多个被至少一个树眼镜蛇毒素的氨基酸残基隔开的氨基酸序列部分。
5.如权利要求1-4任一项所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列选自血小板衍生生长因子(PGDF)、糖蛋白IBα、水蛭素、凝血调节蛋白、血管内皮细胞生长因子、转化生长因子-β1、碱性成纤维细胞生长因子、血管紧张肽II、因子VIII以及von Willebrand因子。
6.如前述任一个权利要求所述的多肽，包括如图3A、3B或3C所示的氨基酸序列。
7.如前述任一个权利要求所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列被掺入树眼镜蛇毒素的支架的(a)环I和/或环II；(b)环I和/或环III；(c)环II和/或环III；或者(d)环I、环II和环III。
8.如权利要求7所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列被掺入环I或者环II中。
9.如前述任一个权利要求所述的多肽，其中含RGD的环通过插入、缺失或取代一个或多个氨基酸残基而被修饰，优选地树眼镜蛇毒素的环III中能被修饰的氨基酸的数目最多8个，最少1个。
10.如权利要求9所述的多肽，其中所述的RGD环具有如表1所示的氨基酸序列。
11.如前述任一个权利要求所述的多肽，其中所述的环I和/或环II经以下的手段修饰插入、缺失或取代一个或多个氨基酸残基，优选14-36个氨基酸残基。
12.如前述任一个权利要求所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列被插入到树眼镜蛇毒素支架的氨基酸残基间，该残基选自2-16、21-36、21-31、28-32、9-13、21-33位中的一个或多个或第50位残基之后的树眼镜蛇毒素支架末端。
13.一种编码如权利要求1-12中任一项所述的多肽的核酸分子。
14.如权利要求13所述的核酸，可操纵地连接到一个启动子上，并且可任选连接到一段编码异源蛋白或肽的核酸序列上，从而编码一个融合产物。
15.如权利要求14所述的核酸，其中所述的启动子是IPTG诱导的启动子，任选地所述的异源蛋白或肽是谷胱甘肽S-转移酶。
16.一种含有如权利要求13-15中任一项所述的核酸的质粒。
17.含有如权利要求13所述的核酸的质粒pGEX-3X。
18.一种用如权利要求16或17中所述的质粒转化的宿主细胞。
19.如权利要求18所述的宿主细胞，其是大肠杆菌。
20.一种包含如权利要求18或19中所述的宿主细胞的细胞培养物。
21.一种生产如权利要求1-12中任一项所定义的多肽的方法，包括培养如权利要求18或19所述的宿主细胞以表达所述的多肽，从培养物中抽提该多肽，并纯化。
22.一种生产一种多功能抗凝剂的方法，包括a)构建一个表达载体，它包括编码树眼镜蛇毒素支架的核酸序列，可操纵地与一个启动子相连，且任选与编码异源蛋白质的核酸相连以便与其共表达；b)通过插入、缺失或者取代一个或多个核苷酸残基，对编码树眼镜蛇毒素支架的载体的核酸序列中除结合血小板RGD基序之外的至少一个部分进行修饰，从而在表达时，树眼镜蛇毒素的支架中包括一个具有除树眼镜蛇毒素活性之外的活性的另外的氨基酸序列；c)用上述载体转化宿主细胞，使该宿主细胞表达修饰的树眼镜蛇毒素核酸序列。
23.如权利要求22所述的方法，其进一步包括以下步骤d)从宿主细胞培养物中抽提修饰的树眼镜蛇毒素，e)从细胞培养物抽提物中纯化修饰的树眼镜蛇毒素，可任选包括以下步骤从共表达的异源蛋白中切割出树眼镜蛇毒素。
24.权利要求23所述的方法，其中所述的异源蛋白是谷胱甘肽S-转移酶(GST)，纯化过程包括GST亲和层析，接着从GST中裂解出修饰的树眼镜蛇毒素。
25.如权利要求1-12中任一项所述的或者是利用权利要求21-25中任一项所述的方法得到的多肽。
26.一种药用组合物，其中包括一种治疗上有效量的如权利要求1-12或25中任一项所述的多肽。
27.如权利要求26所述的组合物，其进一步包括药物学上可接受的赋形剂或载体。
28.如权利要求1-12或5中任一项所述的多肽，用作药物。
29.如权利要求1-12或25中任一项所述的多肽用于制备治疗或预防血栓相关疾病的药物中的应用。
30.如权利要求29所述的应用，其中所述的疾病是以下疾病中的一种或多种血栓症、心肌梗死、视网膜新血管形成、内皮损伤、异常调控凋亡、异常细胞迁移、白细胞募集、免疫系统激活、组织纤维化和肿瘤发生。
全文摘要
通过重组DNA技术特别是“环移植”技术修饰一种多肽神经毒素类似物－树眼镜蛇毒素,从而提供一种修饰的多肽。所述的修饰的多肽构建成保持树眼镜蛇毒素活性例如对纤维蛋白酶原的血小板粘附作用,另外还具有一或多种非树眼镜蛇毒素天然活性的生物学或生物化学活性,例如血小板衍生生长因子(PDGF)活性或水蛭素活性。
文档编号A61P9/10GK1251133SQ9880349
公开日2000年4月19日 申请日期1998年3月20日 优先权日1997年3月20日
发明者陆新杰, 迈克尔·菲巴尔·斯库利, 维贾伊·维尔·卡卡尔, 卡尔万特·辛格·奥蒂 申请人:特里根有限公司