专利名称：来自ebv的ctl表位的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗或防止EBV感染的方法。本发明还涉及Epstein-Barr病毒(EBV)结构抗原及潜在(latent)抗原内的细胞毒性T细胞(CTL)表位，以及包含这些表位的亚单位疫苗和核酸疫苗。
背景技术：
现在非常确定的是由持续的病毒感染产生的长期保护需要病毒特异性的记忆T细胞的发生，它们识别与I型或II型MHC分子有关的病毒抗原。由于用病毒全蛋白免疫不能激发有效的CTL应答，人们对基于特定的表位序列设计疫苗产生了兴趣，对于致瘤病毒尤其是这样，因为在重组载体中导入单个病毒的基因具有起始致瘤过程的潜能。目前考虑两种主要的方法来设计有效疫苗以控制与Epstein-Barr病毒(EBV)有关的疾病(详见参考文献(7))，包括引发对EBV结构抗原或潜在抗原的免疫反应。
近几年，疫苗发展的大部分努力集中在gp350亚基制备物的应用上(重组并亲和纯化)，而且已经能阻止病毒对口咽部靶细胞的粘附(31)。一般方法是用gp350免疫白顶狨，测定动物体内它们限制EBV-阳性的淋巴瘤过量生长的能力。事实上，高纯度的gp350，当和佐剂(胞壁酰二肽或ISCOMS)一起皮下施用时，诱导了高水平的血清中和抗体并阻止了白顶狨体内肿瘤形成(32)。许多重组载体包括痘苗-gp350和腺病毒5-gp350，也成功地用于这些动物以阻止肿瘤过量生长(33)。gp350在白顶狨体内提供抗淋巴瘤的保护的精细机制尚不明了，接种动物体内中和抗体效价的发展并不总与保护水平相关，表明gp350特异性的T细胞介导的免疫应答可能也具有效应物的作用(34)。此外，Yao及其同事(35)指出很低水平的中和抗-gp350的抗体在健康的EBV免疫供体的唾液中出现，提示这类抗体不可能是健康的血清阳性个体内长期免疫的基础。推测gp350特异性的、T细胞介导的免疫应答在保护中具有效应物的作用，然而，迄今为止没有鉴别在EBV结构抗原内的CTL表位。
发生在器官移植病人中的移植后淋巴组织增生症(PTLD)是一个愈来愈重要的临床问题。PTLD的组织学分析显示出十分复杂的克隆多样性，从多形B淋巴细胞增生至恶性单克隆淋巴瘤。病理学上这个范围包含了共同的术语PTLD，而淋巴瘤通常是指淋巴母细胞淋巴瘤(IL)。这种情况显然与所有以前感染过的个体(约80％的成人和20％的7岁儿童)(45，46，47，48)终身携带的、Epstein-Barr病毒(EBV)感染的B细胞的增殖有关。EBV感染的B细胞通常在体内和体外被病毒特异的、细胞毒性T细胞(CTLs)限制生长(见下文)，这些CTL识别EBV潜在蛋白内的表位(48)。免疫抑制阻碍了这些特异性的CTL，导致了EBV感染的B细胞的扩增以及与PTLD有关的临床问题的出现。已经知道，PTLD风险最大的个体是从血清阳性的供体接受移植的EBV血清阴性的受体(Crawford和Thomas，1993)，对EBV血清阴性的受体在移植前进行免疫将大大降低PTLD的风险。
免疫系统在抵抗病毒相关的癌症中的作用也是最近深入研究的主题。根据研究提出的假说是许多瘤表达可能使它们被免疫系统，包括T辅助细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，识别并破坏的病毒抗原。现在有大量证据表明大多数Epstein-Barr病毒(EBV)相关的恶性肿瘤通过限制病毒基因的表达逃避这种潜在的、病毒特异性的CTL应答(7，20，21)。就恶性肿瘤如鼻咽癌(NPC)和霍奇森病(HD)而言，EBV核抗原1(EBNA1)和潜在的膜蛋白1(LMP1)是唯一持续表达的抗原，因而是任何将来为控制这些肿瘤而设计的疫苗的潜在靶抗原(3，28)。由于非常明确了用病毒全蛋白免疫不能激发有效的CTL应答，人们将兴趣集中到基于特定的表位序列发展肽疫苗上。
发明概述本发明人得到的结果表明EBV结构及潜在蛋白内的CTL表位在提供抗病毒免疫抵抗EBV感染方面可能有效。特别是，本发明人用肽稳定测定法分析了潜在抗原LMP1的序列，发现该抗原包含潜在的CTL表位。根据这些肽的体外活化作用，HLA A2阳性供体的CTL多克隆和克隆都对表达LMP1抗原的靶细胞表现出很强的反应，而且，表达不同HLA A2超型的淋巴母细胞系(LCL)均被这些CTLs有效识别，这是一个对旨在保护不同种族人群的抗病毒疫苗的设计有重要意义的结果。
本发明人还发现急性感染的单核细胞增多症(IM)病人的CTLs对EBV结构抗原gp85和gp350表现出很强反应。此外，EBV结构抗原gp85和gp350内特异性CTL表位被首次鉴定出来。重要的是，用这些gp350和gp85的CTL表位预先免疫HLA A2/Kb转基因鼠诱导了很强的表位特异性的CTL应答，并提供保护抵抗表达gp85或gp350的痘苗病毒的侵袭。这些结果首次提供了EBV结构蛋白内存在CTL表位的证据，表明它们可用于建立强大的抗-病毒免疫抵抗EBV感染。
相应地，本发明第一个方面提供了一种细胞毒性Epstein-Barr病毒(EBV)T细胞表位，该表位来自EBV结构抗原。
在本发明第一方面的优选实施方案中，EBV结构抗原是gp85或gp350。
本发明第二个方面提供了一种细胞毒性Epstein-Barr病毒的T细胞表位，这个表位选自由YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)，YFLEILWGL(SEQ ID NO32)，YLLEILWRL(SEQ ID NO33)，YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)，LLLALLFWL(SEQ ID NO2)，LLVDLLWLL(SEQ ID NO3)，LLLIALWNL(SEQ ID NO4)，WLLLFLAIL(SEQ ID NO5)，TLLVDLLWL(SEQ ID NO7)，LLWLLLFLA(SEQ ID NO8)，ILLIIALYL(SEQ ID NO9)，VLFIFGCLL(SEQID NO10)，RLGATIWQL(SEQ ID NO11)，ILYFIAFAL(SEQ IDNO15)，SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)，LMIIPLINV(SEQ ID NO20)，TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)，LIPETVPYI(SEQ ID NO26)，VLQWASLAV(SEQ ID NO27)，QLTPHTKAV(SEQ ID NO29)组成的组。
本发明第三个方面提供了包含根据本发明第一方面的细胞毒性Epstein-Barr病毒(EBV)T细胞表位的亚单位疫苗。
在优选的实施方案中，亚单位疫苗包含至少一个选自由YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)，YFLEILWGL(SEQ ID NO32)，YLLEILWRL(SEQ ID NO33)，YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)，LLLALLFWL(SEQ ID NO2)，LLVDLLWLL(SEQ ID NO3)，LLLIALWNL(SEQ ID NO4)，WLLLFLAIL(SEQ ID NO5)，TLLVDLLWL(SEQ ID NO7)，LLWLLLFLA(SEQ ID NO8)，ILLIIALYL(SEQ ID NO9)，VLFIFGCLL(SEQ ID NO10)，RLGATIWQL(SEQ ID NO11)，ILYFIAFAL(SEQ ID NO15)，SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)，LMIIPLINV(SEQ ID NO20)，TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)，LIPETVPYI(SEQ ID NO26)，VLQWASLAV(SEQ ID NO27)，QLTPHTKAV(SEQ ID NO29)组成的组的T细胞表位。
在本发明的优选方面，表位选自由YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)，YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)，YFLEILWGL(SEQ ID NO32)，YLLEILWRL(SEQ ID NO33)，SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)，LMIIPLINV(SEQ ID NO20)，TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)，和VLQWASLAV(SEQ ID NO27)组成的组。
在更加优选实施方案中，亚单位疫苗包含一或多个额外的细胞毒性EBV T细胞表位。额外的细胞毒性EBV T细胞表位可以从WO97/45444的描述中选择，其全部内容引入本文作参考。
在本发明更加优选的形式中，疫苗包含“油包水”配制品。更加优选的是除至少一个细胞毒性T细胞表位外，疫苗还包含至少一个引起个体免疫记忆应答的抗原。
所述的至少一个抗原最好选自由破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳杆菌抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、纯化的蛋白衍生物(PPD)、gp350蛋白(Thorley-Lawson，D.A和Poodry，C.A.(1982)，鉴定及分离负责在体内产生中和抗体的Epstein-Barr病毒的主要成分(gp350-gp220)。病毒学杂志.43，730-736)、辅助表位及其组合组成的组，优选破伤风类毒素。
“油包水”配制品最好是Montaide ISA720。关于这种配制品的更多信息可在WO95/24926中查询，其公开的全部内容引入本文作交叉参考。
亚单位疫苗也可用ISCOMs来配制。关于ISCOMs的更多信息可在澳大利亚专利Nos.558258，590904，632067，589915中查询，本文的参考文献包括了其公开的全文。
本发明第四个方面提供了编码根据本发明第一方面的细胞毒性Epstein-Barr病毒(EBV)T细胞表位的分离的核酸序列。
在优选实施方案中，分离的核酸序列编码至少一个细胞毒性T细胞表位，表位选自由YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)，YFLEILWGL(SEQ ID NO32)，YLLEILWRL(SEQ ID NO33)，YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)，LLLALLFWL(SEQ ID NO2)，LLVDLLWLL(SEQ ID NO3)，LLLIALWNL(SEQ ID NO4)，WLLLFLAIL(SEQ ID NO5)，TLLVDLLWL(SEQ ID NO7)，LLWLLLFLA(SEQ ID NO8)，ILLIIALYL(SEQ ID NO9)，VLFIFGCLL(SEQID NO10)，RLGATIWQL(SEQ ID NO11)，ILYFIAFAL(SEQ IDNO15)，SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)，LMIIPLINV(SEQ ID NO20)，TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)，LIPETVPYI(SEQ ID NO26)，VLQWASLAV(SEQ ID NO27)，QLTPHTKAV(SEQ ID NO29)组成的组。
正如将被本领域的熟练人员理解的，核酸序列可以作为裸露的核酸或者用合适的病毒或细菌载体输送。合适的细菌载体包括沙门氏菌，合适的病毒载体包括，如逆转录病毒载体、腺病毒载体和痘苗载体。合适的痘苗载体的例子是改造的安卡拉痘苗载体。
适于输送核酸序列的载体已经在现有技术中描述过。例如，为了研究蛋白质的结构和功能以及出于蛋白制造的目的，阿尔发病毒载体已被广泛用于基础研究。各种载体的发展使输送外源序列如裸露的RNA或DNA，又如用辅助载体策略制作的自杀型病毒颗粒成为可能。初步的报导也提示这些载体对期望得到短暂的、高水平蛋白表达的体内应用可能有用，例如重组疫苗。最初的研究已经表明阿尔发病毒疫苗能够诱导强烈的具有良好的免疫记忆性和保护效果的体液免疫和细胞免疫。参见Tubulekas L.，Fleeton M.，和Lijistrom P.(1997)阿尔发病毒表达载体及其作为重组疫苗的用途短期回顾，基因190(1)191-195。
为了接种抵抗异源病原体，产生了重组的痘病毒。其中，下述病毒是值得关注的例子。(i)改造哥本哈根株痘苗病毒以表达狂犬病毒糖蛋白。当在诱饵中使用时，该重组体接种欧洲红狐和美国浣熊，阻挡了自然界狂犬病毒感染的传播。(ii)基于禽痘的、表达新城病病毒和血凝素糖蛋白的重组体，当在出生第一天服用时，即使在抗新城病病毒或痘载体的母体免疫存在情况下，仍表现出对商业烤子鸡的终身保护。(iii)在禽类中复制受到限制的重组金丝雀痘病毒，提供了保护抗狂犬病毒对猫和狗的侵袭、抗犬瘟病毒、猫白血病病毒及马流感病毒病。在人体，基于金丝雀痘病毒的表达狂犬病毒抗原、日本脑炎病毒抗原和HIV抗原的重组体显得安全并具有免疫原性。(iv)一个高度减毒的痘苗衍生物NYVAC已被改造用以表达来自动物和人病原体的抗原。表达狂犬病毒糖蛋白、日本脑炎病毒多蛋白和镰状疟原虫7个抗原的基于NYVAC的重组体在早期的人体疫苗研究中显得安全并有免疫原性。参见Paoletti E.(1996)痘病毒载体接种的应用新信息，Proc Natl Acad Sci U SA，93(21)11349-11353。
寄生虫的抗原复杂性问题和缺乏对宿主应答了解的问题共同阻碍了控制体内寄生虫、尤其是影响粘膜间隙的寄生虫的有效疫苗的发展。然而，关于粘膜免疫调控信息的积累使重新评价接种方案以提供合适的粘膜效应物应答成为可能。T细胞影响的关键作用、尤其是对细胞因子信号分布的作用，在体外研究中已得到明确证实，而本实验室的数据提供了它们在体内效果的证据。我们提出了T细胞在决定肠内应答结果中的作用，并就此提出了局部Th2细胞因子产生的作用。为支持这一推测，用原位杂交技术在正常和寄生感染的动物体内测定了细胞因子mRNA的分布。而且，我们指出在缺乏Th2细胞因子的情况下(用基因敲除动物)粘膜应答普遍无效，我们还指出这种无效可以被载体定向的基因治疗所克服。这些结果表明通过将传统的免疫手段与调节局部细胞因子产生的策略相结合，存在着新的粘膜免疫可能性。然而，伴随着细胞因子调控技术和用合适的佐剂/载体改构体输送的发展，新策略的成功将依赖于挑选出高免疫原性的亚单位抗原。下文回顾了系统用药或口服给药后，能够伴护不稳定的抗原及遗传物质到合适的粘膜刺激位点的输送技术。参见Sutter G.等(1994)来自宿主范围有限的、高度减毒的MVA株痘苗病毒刺激了小鼠体内对流感病毒的保护性免疫，病毒121032-1040；和Husband A.J.，Bao S.，McClyre S.J.，Emery D.L.，Ramsay A.J.(1996)粘膜疫苗的抗原输送策略，国际寄生虫学杂志8-9825-834。
带有aroC和aroD缺失突变的减毒伤寒沙门氏菌疫苗株CVD908，表现出良好的耐受性和高度的免疫原性，激发了大量血清抗体、粘膜IgA和细胞介导的免疫应答。由htrA(编码具有CVD908血清蛋白酶活性的热激蛋白)引入一个缺失而制备的进一步衍生物导致了CVD908-htrA的产生。在I期临床试验阶段，CVD908-htrA作为口服活疫苗的候选者显得十分诱人。CVD980和CVD908-htrA都可以作为活载体疫苗用来向免疫系统输送外来抗原。提高CVD908和CVD908-htrA所携带的外来抗原表达水平和免疫原性的条件正在研究之中。沙门氏菌载体的综述，见levine M.M.，Galen J.，Barry E.，Noriega F.，Chatfield S.，Sztein M.，Dougan G.和Tacket C.(1996)减毒的沙门氏菌作为口服活疫苗抗伤寒热及其作为活载体，生物技术杂志44(1-3)193-196。
分离的核酸序列可以是核酸疫苗的形式。关于核酸疫苗的更多信息见WO96/03144和Suhrbire A(1997)，多表位DNA疫苗，免疫细胞生物学75(4)402-408。其公开的全部内容引入本文作参考。
本发明的第五个方面提供了一个分离的多肽，多肽包含至少一个根据本发明第一和第二方面的表位。
本发明的疫苗可以用作预防或治疗用途。
本发明的CTL表位可以用本领域熟练人员公知的技术合成。例如，CTL表位可以用液相或固体支持物按照Atherton和Sheppard在出版物《疫苗合成》的第九章“多肽合成”中描述的那样合成，该书由Nichlson编辑，Blackwell科学出版社出版。优选地，使用的固相支持物可以是聚苯乙烯凝胶珠，其中聚苯乙烯可以与少量二乙烯基苯(如1％)交联，其可被亲脂性溶剂如二氯甲烷，或更具极性的溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)进一步溶胀。聚苯乙烯可以用氯甲基或阴离子甲基基团官能化。此外，使用了交联且官能化的聚二甲基丙烯酰胺凝胶，它可以被DMF或其他双极性非质子传递溶剂高度溶解和溶胀。可以使用其它以聚乙二醇为基础的支持物，聚乙二醇通常被接枝或以其它方式附着在惰性聚苯乙烯珠表面。在优选形式中，可以使用选自PAL-PEG，PAK-PEG，KA，KR或TGR的商业化的支持物或树脂。
在固相合成中，可以选用可逆的阻断基团，它们具有掩蔽氨基、羧基或侧链官能团上不需要的反应性以及破坏氨基酸和肽的双极性特征使其失活的双重功能。这样的官能团可以选自RCO-OCMe3-CO-NHR结构的叔丁酯，它们已知为叔丁氧基羧基或ROC衍生物。还可以使用相应的具有RCO-OCH2-C6H5结构的苄基酯和具有C6H5CH2O-CO-NHR结构的氨基甲酸乙酯，它们已知是苄氧基羰基或Z-衍生物。还可以使用芴基甲醇衍生物特别是芴基—甲氧基羰基或Fmoc基团。每一类保护基团在相互存在的情况下能够独立裂解，所以通常使用BOC-苄基和Fmoc-叔丁基保护策略。
还需要用缩合试剂来连接受保护的氨基酸或肽的氨基和羧基基团。这可以通过活化羧基基团使它自发地与游离的伯胺或仲胺反应来实现。活化的酯如来源于p-硝基酚或五氟苯基的酯可用于此目的。加入催化剂如1-羟基苯丙三唑可以加速反应进程。还可以用三嗪DHBT的酯(如上文提及的Nicholson参考文献215-216页所描述的)。通过用缩合试剂处理羧酸，一些酰化类型在原位形成(即Nα-保护的氨基酸或肽)并与氨基组分迅速反应(羧基或C-保护的氨基酸或肽)。二环己基碳二亚胺、BOP试剂(参见Nicholson参考文献第216页)、O’苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)及其类似的四氟硼酸酯常被用作缩合试剂。
可以用BOC-氨基酸以任何适合的方式将第一个氨基酸连接到固体支持物上。其中的一种方法通过加热三乙基铵盐与树脂将BOC氨基酸连接到氯甲基树脂上。Fmoc-氨基酸可以由类似的方法偶联到p-烷氧基苄基醇树脂上。此外，可以用各种连接试剂或“把柄”将第一个氨基酸连接到树脂上。在这方面，与氨甲基聚苯乙烯相连的p-羟甲基苯乙酸可以用于该目的。
正如本领域的熟练人员易于理解的，LMP1、gp85和gp350表位以及本发明的疫苗可用于抗EBV的治疗和保护。而且，考虑到无免疫应答的个体可能更多的涉及EBV感染，本发明在治疗和保护免疫功能下降的个体方面可能有特殊的应用，如移植病人。重要的是，本发明发现表达不同HLA A2超型的EBV转化的淋巴母细胞样细胞系可以被LMP1-特异性的CTL克隆有效识别。这突出了以治疗和保护不同种族的人群为目标设计抗病毒疫苗的可能性。
相应地，本发明第六个方面提供了一种用于诱导个体CTLs的组合物的制备方法，该方法包括将根据本发明第一或第二方面的至少一个表位与至少一个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。
本发明第七个方面提供了一种降低个体EBV感染风险的方法，所述方法包括对个体施用有效剂量的(1)至少一个根据本发明第一或第二方面的CTL表位；(2)根据本发明第三方面的的亚单位疫苗；(3)根据本发明第四方面的核酸序列；(4)根据本发明第四方面的载体；或(5)根据本发明第五方面的多肽。
本发明第八个方面提供了一种治疗或抑制个体体内鼻咽癌或霍奇森病的方法，所述方法包括对个体施用有效量的、至少一个来自EBV结构抗原或潜在抗原的CTL表位。
“有效量”是指足够诱导或扩大CTL应答抵抗EBV抗原的表位量。
在本发明第八个方面的优选实施方案中，EBV结构抗原是gp85或gp350，潜在抗原是LMP1或LMP2。在更优选的实施方案中，CTL表位是本发明第二个方面所限定的表位。
本发明人还作出了令人惊奇的发现被CTL克隆识别的NPC细胞容易被CTL溶解。这一发现对设计疫苗来体内控制NPC肿瘤有重要意义。
本发明第九个方面提供了一种治疗或抑制需治疗的个体体内NPC或HD细胞生长的方法，所述方法包括对个体施用至少一个来自EBV结构抗原或潜在抗原的CTL表位。
在本发明第九方面的优选实施方案中，EBV的CTL表位来自gp85或gp350抗原。在更优选的实施方案中，EBV的CTL表位来自LMP1或LMP2抗原。更好地，CTL表位来自LMP1抗原。
本发明第十个方面提供了一种治疗或抑制第一个个体体内NPC或HD细胞生长的方法，所述方法包括将识别NPC或HD细胞的EBV-特异性的CTLs转移至第一个体。
在优选实施方案中，EBV-特异性的CTLs通过暴露于EBV CTL表位，体外刺激CTLs的方法从NPC病人得到。此外，EBV-特异性的CTLs可以从第二个体得到，其中第二个体被EBV感染但没有NPC。
在本发明第十方面更优选的实施方案中，EBV-特异性的CTLs是LMP1和/或LMP2特异性的CTLs。
本发明第十一个方面提供了一种降低个体患传染性单核细胞增多症或移植后淋巴组织增生症风险的方法，所述方法包括对个体施用有效量的(1)根据本发明第一或第二方面的至少一个CTL表位；(2)根据本发明第三方面的亚单位疫苗；(3)根据本发明第四方面的核酸序列；(4)根据本发明第四方面的载体；或(5)根据本发明第五方面的多肽。
说明书全文中使用的术语“包含”是指包括所述的成分或特征、或者所述成分或特征的组合，包括或不包括其它的成分或特征、或者其它成分或特征的组合。
为了更清楚地理解本发明的实质，现在参照下列实施例和附图进行描述。
附图简述
图1用LMP1内潜在的HLA A2结合肽进行T2细胞上MHC稳定检测。先将200μl各种肽(200μg/ml)与T2细胞在26℃温浴14-16小时，随后在37℃温浴2-3小时。用BB7.2抗体、FACS法分析HLA A2在这些细胞上的表达。点划线表示没有任何肽时T2细胞上HLA A2的背景平均荧光强度。明显稳定T2细胞上HLA A2分子的LMP1肽用箭头标示出。
图2HLA A2-阳性供体SB的多克隆CTLs对LMP1肽的识别。供体SB的PMBC与受照射的、用合成肽(在Y轴上标出)致敏的T2细胞共同培养7天。第十天，在标准的51铬释放分析中相对于肽致敏的(1μg/ml)自体PHA胚细胞，这些细胞被用作多克隆效应物。分析中效应物∶靶的比率为20∶1。这里显示了三次实验中有代表性实验的数据。实验结果用特异性溶解的百分比表示。
图3用供体SB EBV特异性的CTL克隆(SB7)对自体LCLs和被Vacc.EBNA1，2，3，4，5，6，LMP1，LMP2A及Vacc.TK-感染的自体CD40 B细胞进行特异性溶解(系列A)。靶细胞被痘苗构建体感染12-14小时(M.O.I＝10∶1)并进行标准的51铬释放分析。Vacc.TK-作为对照重组痘苗。为进一步证实SB7克隆的LMP1特异性，LMP1-和HLA A2-阳性的BL细胞系(BJAB.MTLM6或Mutucl.59)和LMP1-阴性、HLAA2-阳性的BL细胞系(BJAB.gptl和Mutucl.216)在标准的51铬释放分析中被用作靶(系列B)。分析中效应物与靶的比率均为4∶1。实验结果用特异性溶解的百分比表示。
图4显示了LMP1表位YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)(A)和YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)(B)在HLAA2阳性供体中的CTLp频率。用限制稀释检测法，在供体SB的外周血淋巴细胞中测定了肽YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)(A)和YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)(B)CTLp的频率，供体的PBMC按照“材料与方法”部分的描述用肽致敏的PBMC刺激。应答物频率的交互倒数(f1)被标示出，阴影部分代表95％的置信范围。
图5SB7的CTL克隆识别表达HLA A2不同超型的LCLs。分析中使用的所有LCLs经B95.8 EBV分离株转化。每个LCL的HLAA2亚型用第十二界组织相容性专题研讨会的规定区分。分析中效应物与靶的比率均为4∶1。实验结果用特异性溶解的百分比表示。这里显示了四次实验中有代表性实验的数据。
图6变体LMP1肽的HLA A2结合效应(系列A)及CTL识别效应(系列B)。T2细胞上HLA A2结合分析是，先将200μl每种肽(200μg/ml)与T2细胞在26℃温浴14-16小时，随后在37℃温浴2-3小时。用BB7.2抗体、FACS法分析HLAA2在细胞上的表达(系列A)。点划线表示没有任何肽时，T2细胞上HLA A2的背景平均荧光强度。CTL对变体以及标准的HLA A2-限制的LMP1表位的识别，是将供体SB的PHA胚细胞用连续稀释的每种肽致敏，然后以4∶1的效应物∶靶比暴露于SB7 CTL克隆(系列B)。实验结果用特异性溶解的百分比表示。这里显示了三次实验中有代表性实验的数据。不同肽中氨基酸的变化用粗体字母标示。
图7EBV特异性的HLA A11-限制的CTL克隆CM9(a&c)和CM29(b&d)对NPC细胞和LCLs的识别。Vacc.EBNA4、Vacc.TK-感染的或肽致敏的C15 NPC细胞(a&b)以不同的效应物对靶比率暴露于CTL克隆，CTL的溶解水平与一个2型LCLs(CM/Ag876 LCL)相比较。作为阳性对照的靶细胞用肽IVTDFSVIK(a&c)或者肽AVFDRKSDAK(b&d)预致敏。实验结果用特异性溶解的百分比表示。
图8用gp85(系列A)和gp350(系列B)内潜在的HLA A2结合肽进行T2细胞上MHC稳定检测。先将200μl每种肽(200μg/ml)与T2细胞在26℃温浴14-16小时，随后在37℃温浴2-3小时。用BB7.2抗体、FACS法分析HLA A2在这些细胞上的表达。点划线表示没有任何肽时T2细胞上HLA A2的背景平均荧光强度。明显稳定T2细胞上HLA A2分子的gp85和gp350肽用箭头标示。
图9IM供体外周血淋巴细胞中gp85和gp350特异性的回体细胞毒性T细胞活性。系列A、B和C显示了以两个不同的效应物∶靶(E/T)比率，回体CTL溶解肽致敏的(1μg/ml)PHA胚细胞。来自IM病人SB、LP和MG的实验数据分别显示在系列A、B和C中。用病人LP的外周血淋巴细胞，系列D显示了在体外CTL溶解被编码gp85(Vacc.gp85)或gp350(Vacc.gp350)的重组痘苗感染的靶细胞，Vacc.TK-和Vacc.EBNA2在分析中用作对照。
图10HLAA2-阳性IM康复(IM后36个月)个体的多克隆CTLs对gp85和gp350肽的识别。PMBC与受照射的用合成肽(在Y轴上标示)致敏的T2细胞共同培养7天。第十八天，在标准的51铬释放分析中相对于肽致敏的(1μg/ml)自体PHA胚细胞，这些细胞被作为多克隆效应物。分析中效应物∶靶的比率为20∶1。图中标示出本次实验每种肽刺激的CTL效应物。这里显示了三次实验中有代表性实验的数据。实验结果用特异性溶解的百分比表示。
图11用gp85和gp350的CTL表位免疫HLA A2/Kb小鼠诱导了很强的CTL应答。用单独的CTL表位在破伤风类毒素的协助下对实验动物进行两次皮下免疫(间隔14天)。肽免疫四周后，检测动物gp350-和gp85特异性的CTL应答。系列A、B和C显示了用VLQWASLAV(SEQ ID NO.27)(gp350)，TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)(gp85)和SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)(gp85)分别免疫的两只小鼠脾细胞内的CTL活性，肽表位致敏的靶细胞的CTL溶解用实心符号表示，未致敏靶细胞的溶解用空心符号表示。系列D显示了用肽VLQWASLAV(SEQ ID NO27)(■，□)、TLFIGSHVV(SEQID NO24)(▲，△)和SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)(●，○)免疫的小鼠汇集的腹股沟淋巴结处的CTL活性。用标准的51铬释放分析法在实验的第六天测定CTL活性。
图12用gp85或gp350的CTL表位预先免疫HLA A2/Kb小鼠提供了保护抵抗重组痘苗病毒的侵袭。用Vacc.gp85和Vacc.gp350由腹膜内侵袭未免疫或用CTL表位免疫的雌性A2/Kb转基因鼠试验组。侵袭四天后，处死小鼠并用空斑分析法测定两个卵巢内汇合的CV1细胞的痘苗效价。X轴标明了用于免疫的肽，Y轴标明了未免疫小鼠和肽免疫小鼠的平均值+/-SE痘苗病毒效价。图中每个系列都显示了用于侵袭动物的重组痘苗病毒。
发明详述实施例1材料和方法细胞系的建立和维持用B95.8(1型)或Ag876(2型)病毒分离株通过异源病毒转化外周B细胞的方法由血清阳性的供体建立了LCLs。而且，本研究还使用了用B95.8分离株转化、表达不同HLA A2超型的LCLs(第十二界组织相容性专题研讨会细胞系列；EACC)。肽转运蛋白(TAP)阴性的B×T杂种细胞系174×CEM.T2(用T2表示)(22)被用于肽稳定分析。所有的细胞系依照常规在含有2mM谷氨酸盐、100IU/ml盘尼西林、100μg/ml链霉素加10％胎牛血清(FCS)(生长培养基)的RPMI 1640中培养。用CD40系统(用CD40 B细胞表示)如前所述建立EBV阴性的正常B细胞胚细胞的长期培养(12)。
本研究使用了伯基特淋巴瘤(BL)细胞系BJAB.gptl、BJAB.MTLM6、MUTUcl.59和MUTUcl.216。它们来自地方性或非地方性BL的患者，前面叙述过BJAB.MTLM6、MUTUcl.59表达LMP1，而BJAB.gtplB和MUTUcl.216是LMP1阴性的(5，27)。这些BL细胞系按照常规培养在生长培养基中。
为了产生植物血细胞凝集素(PHA)胚细胞，用PHA(Commonwealth血清实验室，Melboume)刺激外周血单核细胞(PMBC)，三天后，加入含有MLA 144上清液和rIL-2的生长培养基(2)。两周更换一次IL-2和MLA上清液(不再加入PHA)培养至六周，繁殖PHA胚细胞。
病毒分离株为了分离驻留的EBV，通过PBMC在0.1μg/ml环孢菌素存在的情况下自然生长，从12个无关、健康的EBV-血清阳性供体的细胞板上建立了自发的LCLs。此外，从活组织解剖材料直接测定8个不同NPC样本(来自东南亚)的病毒分离株的序列，以基因组BAMH1WYH和E区DNA序列的差异为基础将这些分离株分类为1型EBV(23，24)。
CTL表位的PCR及DNA测序选择LMP1表位的DNA编码区侧翼的特异性寡核苷酸引物进行PCR扩增。PCR产物用QIA快速旋转柱纯化(Qiagen公司，Chatsworth，CA)，用PRISM简易反应双脱氧终止循环测序试剂盒(Applied Biosystems公司，Foster市，CA)从两端测序。
肽的合成用Merrifield固相法(16)合成的肽购自Chiron Mimotopes(Melbourne，澳大利亚)。溶解在二甲亚砜中并用无血清RPMI 1640培养基稀释，用于标准的CTL分析。
MHC稳定检测为了鉴别LMP1内潜在的HLA A2结合肽，使用了其它地方(http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html)记载的计算机程序(18)。用T2细胞按照前面的描述，将预测的肽用于MHC稳定检测(1)。简而言之，T2细胞(2×105)与每种肽(200μg/ml)在26℃温浴14-16小时，随后在37℃温浴2-3小时。温浴后，用HLAA2特异性的单克隆抗体(MA2.1；ATCC)、FACS法检测HLA A2的表达。
LMP1特异性多克隆及克隆CTLs的产生为了产生多克隆CTLs，HLA A2阳性供体的PBMC与受照射的(8,000 rads)用合成肽致敏的T2细胞共同培养7天。第7天，用肽致敏的T2细胞再次刺激这些淋巴细胞。在生长培养基中培养10天后，在标准的51铬释放分析中相对于肽致敏的自体PHA胚细胞，这些细胞被作为多克隆效应物。
为了产生LMP1特异性的CTL克隆，PBMC(106/ml)与肽致敏的自体淋巴细胞(应答物对刺激物的比率为4∶1)在2ml培养孔(Linbro)、生长培养基中培育3天。由接种到0.35％琼脂糖而产生的CTL克隆，建立并维持在含有高纯度、大肠杆菌表达的重组人IL-2的生长培养基中(16)，用自体的LCLs每周刺激两次。在被重组痘苗感染的自体CD40 B细胞的板上扫描CTL克隆，以确定抗原特异性(见下文)。
痘苗病毒重组体编码EBV潜在抗原的重组痘苗结构和仅插入pSC 11载体制得的、胸苷激酶阴性的痘苗病毒结构(Vacc.TK-)已经在前面描述过(6，11)。CD40 B细胞被重组痘苗病毒以10∶1的感染率(MOI)在37℃感染1小时，如前所述(6，11)。感染过夜后，用生长培养基洗涤细胞并进行CTL分析或免疫印迹实验以评定重组EBV抗原的表达(12)。
细胞毒性分析靶细胞被重组痘苗病毒感染或者被合成的肽表位(野生型或变体)预致敏，然后与51铬温浴90分钟。温浴后，用生长培养基洗涤细胞，在标准的5小时51铬释放分析中将其用作靶(16)。在某些实验中，加入对MHCI型(W6/32)或II型(L243)上非多形性抗原决定簇有特异性的单克隆抗体(MoAb)以确定CTL克隆的MHC限制。
限制稀释检测(LDA)来自HLA A2-阳性供体的PBMC从6.25×103至5×104个细胞每孔以级数(两倍稀释)分布在圆底微量滴度板上。加入约5×104K-照射的(2,000 rads)肽致敏的(1μg/ml)自体PMBC至终体积100μl。每次实验每一浓度使用二十四个重复培养物，培养物在第4天和第7天用50μl加有20U rIL-2和30％(体积/体积)MLA-144培养物上清的培养基培育。第10天，每个CTL微培养物分裂成两个重复培养物，在标准的5小时51铬释放分析中相对于用LMP1肽预包被或未包被的自体PHA胚细胞，它们被用作效应物。当肽致敏的靶细胞孔特异性铬放射的百分数超过未处理对照孔的平均放射值3 SDs时，这样的孔被评价为阳性。用最大可能性估计法进行LDA(4)。所有实验的数据都符合“单击”动力学的假设(P＞0.4)，还给出了具有95％置信范围的预测值。
结果LMP1内HLA A2结合肽的鉴定为了鉴别LMP1内潜在的HLA A2限制的表位，以对HLA-肽复合物半解离时间的估测值为基础，用预测HLA-结合肽的计算机程序分析氨基酸的序列，(http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bimd/index.html)(18)。共选择了11个估测的半解离时间值＞400的肽(表1)，然后用HLA A2-阳性的T2细胞测定这些肽的HLA A2结合效率，有代表性的实验数据见图1，分析表明有六个肽明显增加了HLA A2在T2细胞上的表达，意味着这些肽与这个等位基因结合。
LMP1肽特异性的多克隆CTLs的产生以上数据明显提示LMP1包含能够结合HLA A2分子的序列，因此是病毒特异性的CTLs的潜在靶。为证实这一假设，用来自LMP1的每条结合HLA A2的肽致敏的T2细胞刺激两个HLA A2-阳性的EBV免疫供体(SB和AS)的PBMC。第10天，相对肽致敏的自体PHA胚细胞检测这些效应物细胞，供体SB多克隆CTLs的代表性数据见图2。两个肽YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)和YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)表现出显著的多克隆CTLs活化作用；然而，当与用YLQQNWWTL刺激的细胞相比时，用YLLEMLWRL刺激的CTLs一直表现出明显更强的CTL活性。从另一个HLA A2阳性的供体(AS)也得到了类似数据(数据未显示)。
表1鉴定LMP1内潜在的HLAA2结合肽*序 残基 肽序列 得分(估计HLA A2号 等位基因的半解离时间值)1 125-133 YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)25714.762 32-40 LLLALLFWL(SEQ ID NO2)9858.693 167-175 LLVDLLWLL(SEQ ID NO3)2568.454 92-100LLLIALWNL(SEQ ID NO4)2317.875 173-181 WLLLFLAIL(SEQ ID NO5)1302.886 159-167 YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)1252.907 166-174 TLLVDLLWL(SEQ ID NO7)999.868 171-179 LLWLLLFLA(SEQ ID NO8)935.119 152-160 ILLIIALYL(SEQ ID NO9)739.0310110-118 VLFIFGCLL (SEQ ID NO10) 510.6011132-140 RLGATIWQL(SEQ ID NO11) 441.60*为了鉴定LMP1内潜在的HLAA2结合肽，使用了别处记载的计算机程序(18)。
该程序可以由万维网网址http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bimd/index.html直接得到。
LMP1 CTL表位的描述为进一步描述用多克隆CTLs鉴定的CTL表位的特征，开始用肽致敏的自体PBMC刺激、接着用受照射的自体LCLs持续再刺激，产生了病毒特异性的CTL克隆。扫描增殖的克隆以进行肽识别，采用了检测CTL特异性的快速视觉分析法(2)，克隆SB7明显识别了YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)肽。用这种方法没有分离到对YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)有特异性的CTL克隆。为进一步确证SB7克隆的抗原特异性，自体的CD40刺激的B细胞被编码单个EBV抗原的重组痘苗病毒感染，随后暴露于这些CTLs。图3A的数据清楚地表明只有被表达LMP1的痘苗结构感染的靶细胞被识别。而且，只有LMP1-和HLA A2-阳性的BL细胞系(BJAB.MTLM6或Mutu cl.59)被该克隆有效溶解，而对该抗原阴性的BL细胞(BJAB.gtpl或Mutu cl.216)不被识别(图3B)。这些结果证实了YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)是一个被病毒感染的细胞内部加工的LMP1的CTL表位。
在下一轮实验中，我们用限制稀释分析法分析了在HLA A2阳性的健康EBV免疫供者的PMBC中该表位的CTL前体(CTLp)的频率。通过用自体的肽致敏的PBMCs刺激供者SB和AS的PBMC体外激活了YLLEMLWRL特异性的CTLp。用肽YLLEMLWRL(SEQ IDNO1)预包被的或未处理的自体PHA胚细胞在铬放射分析中被作为靶细胞。图4中有代表性的数据表明在HLA A2-阳性的供者AS(1223,535+/-107,437)和SB(1252,650+/-122,875)内检测到很低的对YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)肽有特异性的记忆CTL的频率。
为了检测EBV转化的、表达不同HLA A2超型的LCLs能否被克隆SB7识别，在标准的CTL分析中，扫描了表达十个不同的HLA A2等位基因超型(HLA A*0201-HLA A*0210)的LCLs细胞板。图5的数据清楚地表明除HLA A*0205之外，表达所有主要的HLA A2超型的LCLs被CTL克隆SB7有效识别。HLAI型特异性的抗体W6/32明显抑制了溶解。令人惊奇的是，HLA A2-阳性和TAP-阴性的T2细胞也被该克隆识别，暗示YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)是由不依赖于TAP的途径被内部加工的(图5)。
分离自NPC病人和健康供体的病毒内HLA A2-限制的LMP1表位的序列分折东南亚种族人群中的常见超型HLA A*0201、HLA A*0203和HLAA*0207对LMP1肽的有效提呈提出了这种可能性该表位作为一个潜在的靶肽对表达LMP1的NPC可能很重要。用LMP1特异性的引物进行分离自八个NPC样本的病毒的CTL表位跨越区的序列分析。健康的EBV免疫供体自然产生的LCLs在分析中用作对照。令人感兴趣的是所有分离自NPC样本的EBV在该表位内表现出同样的取代作用(表2)。
相反地，分离自健康的EBV免疫供体的十二个病毒中，四个编码了与B95.8分离株相同的序列，六个在该表位表现出不同于在NPC样本中发现的变化模式。在某些分离株中，第2位的亮氨酸、第5位的甲硫氨酸和第8位的精氨酸可以分别用苯丙氨酸、异亮氨酸和甘氨酸替代(表2)，而在另一些分离株中只有第5位的甲硫氨酸可以用异亮氨酸替代。重要的是，将T2细胞与这些不同的肽YFLEILWGL(SEQ ID NO32)及YLLEILWRL(SEQ ID NO33)温浴，明显增加了MHC在这些细胞上的表达(图6A)，表明与HLA A2有效结合。肽YLLEILWRL(SEQ ID NO33)被SB7克隆有效识别，而在肽YFLEILWGL(SEQ ID NO32)存在的情况下没有发现CTL活性(图6B)。后面的结果并不排除这种可能性YFLEILWGL(SEQ IDNO32)是一个被编码该序列的EBV株感染的表位。不被克隆SB7识别很可能是由于不合适的T细胞受体与MHC-肽复合物之间相互作用，而不是由于缺乏MHC结合。因而表达不同T细胞受体的T细胞能够有效识别这个HLA结合肽是可能的(8)。令人感兴趣的是，分离自其它两个健康EBV免疫供体(包括一个东南亚的)的病毒在该表位序列上表现出的变化与在NPC样本中发现的相同(表2)。
表2分离自NPC及健康的血清阳性个体的EBV分离株的HLA A2-限制的LMP1肽(YLLEMLWRL)的序列
a用于PCR扩增的寡核苷酸引物是(YLLICTTCGGTGCTTACTTGGTA；YLL2TCATCGTGGTGGTGTTCA 3′)bHLA A2结合的数据摘自图6。
++++表示高度结合； -表示不结合
NPC细胞抗原加工功能的分析为了检测NPC细胞能否能够将内源表达的抗原提呈到病毒特异性的CTLs，肿瘤细胞或者被编码EBNA4(Vacc.EBNA4)的重组痘苗感染，或者被合成的肽表位预致敏，图7显示重组痘苗感染的NPC细胞(C15)与被Vacc.EBNA4感染HLA相符的2型LCLs相比较的实验结果。暴露于EBNA4特异性的CTLs后，被Vacc.EBNA4感染的或者肽致敏的NPC细胞被CM9和CM29 CTL克隆有效识别。CTL溶解的水平与在LCLs中观察到的相比。结果清楚地表明NPC细胞通过依赖于TAP的机制能将足够量的肽输送至ER，还能将MHC-肽复合物从ER有效地输送至细胞表面。
NPC细胞内正常的抗原加工功能对设计用来控制体内肿瘤的疫苗有重要意义。较早的研究表明NPC内潜伏基因的表达通常限于EBN1和跨膜蛋白LMP1及LMP2(29)。
由于EBNA1不被EBV特异性的CTLs识别，人们愈来愈重视设计策略来控制已知包含在LMP1内的表位周围的NPC，(6，17)。就本研究提供的数据而言，有理由推测LMP1表位将被NPC细胞有效加工。控制体内NPC细胞的有效方法应该是扩大病人体内LMP特异性的CTL应答。这可以由两种不同途径达到。第一，用包含LMP1和/或LMP2 CTL表位的合成肽免疫NPC病人。再者，用类似于成功治疗骨髓移植病人EBV相关的多克隆淋巴瘤的方法(30)，来自HLA相符合健康病毒携带者的LMP1及LMP2特异性的CTLs可以被接纳性地转入NPC病人。
讨论各实验室早期的工作表明EBV相关的恶性肿瘤的病毒表型很可能是降低肿瘤对病毒特异性的CTL监视易感性的重要因素，因为在体内恶性肿瘤细胞中表达的病毒抗原限于EBNA1，或者EBNA1和LMP1(9，20。21)。现在已经确证EBVN1不包括I型限制的CTL表位(6，17)，相当多的注意力集中到鉴别LMP1内潜在的表位上。本研究就是为了解决这一问题而精心设计的。鉴别LMP1内表位的限制因素之一是CTL对该抗原的应答通常构成全部病毒特异性应答的一小部分这一事实(6，17)。为解决此问题，我们采用一种改良的方法鉴别LMP1内潜在的HLA A2限制的表位。该法的重要步骤是使用了Parker及其同事设计的(18)、用来预测人病原体内各种蛋白潜在的HLA结合肽的计算机程序。B95.8 EBV分离株的LMP1序列分析揭示了许多潜在的HLA A2结合肽，其中大部分在功能上显示出稳定了T2细胞上的HLA A2分子。用这些肽刺激PBMCs导致了很强的对肽YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)特异的多克隆CTL应答的激活，而对另一个肽YLLEMLWRL(SEQ ID NO6)则观察到较弱的应答。通过分离对其有特异性的CTL克隆(SB7)证实了YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)序列是一个LMP1表位。用重组痘苗实验以及有效溶解表达HLA A2阳性的BL细胞的LMP1，进一步证实了SB7克隆的LMP1特异性。
本文描述的CTL应答有意义的原因不仅是它引起抵抗在许多EBV相关的恶性肿瘤中特定表达的病毒抗原，而且是因为HLA A2等位基因事实上在所有人种中非常普遍(13)。更重要的是，表达所有主要的HLA A2超型、EBV转化的LCLs被LMP1特异性的CTL克隆有效识别，一个对以保护不同种族的人群为目标的、抗病毒疫苗的设计有重要启示的结果。值得提及的是，对健康的血清阳性个体LMP1表位的CTL应答构成了病毒特异性的CTL应答的一小部分，还发现了该表位极低水平的CTL前体。然而，用有关的肽接种或者接纳性的转入在体外激活的LMP1特异性的CTLs，扩大这一反应组分也是可能的。这种方法在控制HD和NPC方面可能有用。
东南亚人中的常见超型HLAA*0201、HLAA*0203、HLAA*0207阳性的LCLs对肽YLLEMLWRL(SEQ ID NO1)的有效提呈提出了该表位作为表达LMP1的NPC潜在靶的可能性。
实施例2
材料和方法传染性单核细胞增多症(IM)患者依据异染性抗体阳性临床鉴定出的IM患者，在患病开始的5-10天被采血。在两个病例中，在第二阶段症状结束后的24-36个月，用微细胞毒性血清分型和基因分型对这些病人的HLA A2等位基因进行HLA分型。三个患者(SB、LP和MG)被鉴定为HLAA2阳性，随后用HLA A2特异性的单克隆抗体(ATCC)通过FACS分析证实了这个结论。
细胞系的建立和维持用1型(B95.5)或2型(Ag876)EBV分离株通过外源病毒转化外周B细胞，EBV-转化的淋巴母细胞样细胞系(LCLs)从IM和健康的EBV血清阳性供体的细胞板上建立起来(16)，并按照常规维持在含有2mM谷氨酸盐，100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素加10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640(生长培养基)中。此外，肽转运者(TAP)阴性的B×T杂种细胞系174×CEM.T2(用T2表示)(22)被用于肽稳定检测。
为了产生植物血凝素(PHA)胚细胞，用PHA(Commonwealth血清实验室，Melbourne)刺激外周血单核细胞(PMBC)，三天后，加入含有MLA 144上清液和rIL-2的生长培养基(36)。两周更换一次IL-2和MLA上清液(不再加入PHA)培养至六周，繁殖PHA胚细胞。
CTL效应物的建立和制备用于体外细胞毒性分析的敏锐的IM PBMC效应物悬浮于加有重组IL2的生长培养基中，直接用于细胞毒性分析(见下文)。为了产生多克隆的CTLs，HLA A2阳性供体的PBMCs与受照射的(8,000rads)用合成肽预致敏的T2细胞共同培养7天(37)。第7天和第14天，培养物被肽致敏的T2细胞再次刺激。在生长培养基中培养18天后，在标准的51铬释放分析中相对于肽致敏的自体PHA胚细胞，这些细胞被作为多克隆效应物。
肽的合成用Merrifield固相法合成的肽购自Chiron Mimotopes(Melbourne，澳大利亚)，溶解在二甲基亚砜中，用无血清的RPMI 1640培养基稀释用于标准的CTL分析。MHC稳定检测按照实施例1描述的方法鉴别gp85和gp350内的HLA A2结合肽。随后用T2细胞对预测的多肽进行标准的MHC稳定检测。简要地说，T2细胞(2×105)与200μl每种肽(200μg/ml)在26℃温浴14-16小时，随后在37℃温浴2-3小时。温浴后，用HLA A2特异性的单克隆抗体(MA2.1；ATCC)、FACS法测定HLA A2-的表达。
痘苗病毒重组体编码EBV结构抗原gp350(Vacc.gp350)和gp85(Vacc.gp85)的重组痘苗结构和通过仅插入pSC11载体制得的、胸苷激酶阴性的痘苗病毒结构(Vacc.TK-)已经在前面描述过(38)。靶细胞被重组痘苗病毒以10∶1的感染率(MOI)在37℃感染1小时，如前所述(6，12)。感染过夜后，用生长培养基洗涤细胞并进行CTL分析或免疫印迹实验以评价重组EBV抗原的表达(11)。
细胞毒性分析靶细胞或者用重组痘苗病毒感染，或者用合成的肽表位预致敏，然后与51铬温浴90分钟。温浴后，细胞用生长培养基洗涤并被用作标准的51铬放射分析中的靶(16)。
用gp350和gp85的CTL表位免疫HLA A2/Kb转基因小鼠本研究使用的HLA A2/Kb转基因小鼠在其它地方描述过(39)。这些小鼠表达由人A*0201等位基因α1和2区和鼠H-2KbI型分子α3区组成的嵌合I型分子。按照Vitello及其同事描述的方法进行肽免疫(40)。简要地说，用50μg/鼠在IFA中乳化的CTL表位与5μg作为辅助的破伤风类毒素对实验动物进行两次皮下免疫(以14天的间隔)。肽免疫四周后，评价动物gp350和gp85特异性的CTL应答，为了评价这些CTL应答，脾细胞(3×106细胞/ml)与同源、受照射(2000 rad)、肽包被的LPS胚细胞(3×105细胞/ml)以及3μg/ml人B2微球蛋白共同培养。CTL的活性在第6天用标准的51铬放射分析测定。
痘苗保护分析为了进行保护实验，用上面描述的CTL表位免疫8周龄雌性A2/Kb转基因小鼠实验组。第28天，用Vacc.gp85和Vacc.gp350由腹膜内(1×107pfu/100μl PBS内)侵袭小鼠，侵袭四天后，处死动物，用密集CV1细胞的空斑分析测定两个卵巢内的痘苗效价。
结果gp85和gp350内HLA A2结合肽的鉴定为了鉴别gp85和gp350内潜在的HLA A2限制的表位，以对HLA-肽复合物半解离时间的估测为基础，用预测HLA结合肽的计算机程序分析氨基酸序列(http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bimd/index.html)(18)。一共选择了20个肽(13个来自gp85，7个来自gp350)，gp85肽估计的解离半值＞100，gp350肽＞50(表3)。然后用HLA A2-阳性的T2细胞检测这些肽的HLA A2结合效率，一系列实验中有代表性的实验数据见图8。分析表明其中的七个肽明显增加了HLA A2在T2细胞上的表达，提示这些肽可能是潜在的HLA A2限制的表位。
表3gp85和gp350内潜在的HLA A2结合肽的鉴定*得分(估计HLA A2序号 残基 肽序列等位基因的半解离时间)gp85肽1 177-185 FLMGTYKRV(SEQ ID NO12)1775.6632 317-325 WLAKSFFEL(SEQ ID NO13)1082.9033 672-680 GLYEERAHV(SEQ ID NO14)912.5224 685-693 ILYFLAFAL(SEQ ID NO15)674.0265 2-10QLLCVFCLV(SEQ ID NO16)488.9516 225-233 SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)382.5367 681-689 VLAIILYFI(SEQ ID NO18)224.5378 684-692 IILYFIAFA(SEQ ID NO19)196.4079 542-550 LMIIPLINV(SEQ ID NO20)181.73810 1-9 MQLLCVFCL(SEQ ID NO21)181.73811 7-15FCLVLLWEV(SEQ ID NO22)133.29812 658-666 YLLLTTNGT(SEQ ID NO23)126.88313 420-428 TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)105.510gP350肽1 871-879 VLTLLLLLV(SEQ ID NO25)271.9482 152-160 LIPETVPYI(SEQ ID NO26)126.4813 863-871 VLQWASLAV(SEQ ID NO27)118.2384 875-883 LLLLVMADC(SEQ ID NO28)71.8725 67-75 QLTPHTKAV(SEQ ID NO29)69.5526 861-869 MLVLQWASL(SEQ ID NO30)61.7377 873-881 TLLLLLVMA(SEQ ID NO31)42.278*为了鉴定gp85和gp350内潜在的HLA A2结合肽，使用了别处记载的计算机程序(18)。
该程序可以由万维网网址http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bimd/index.html直接得到。
回体的IM效应物识别gp85和gp350的肽表位接着用IM病人的效应物检测了这七个HLA A2-结合肽的CTL识别，包括四个gp85和三个gp350的肽。而且，我们还采用了一个EBV潜在膜蛋白(LMP1)HLA A2-限制的CTL表位作阳性对照(38)。三个HLA A2-阳性的IM病人SB、LP、和MG的PBMCs悬浮于加有IL2的生长培养基中，在标准的51铬释放分析中相对于用gp85、gp350或LMP1肽致敏、HLA相配的PHA胚细胞它们被用作效应物。两个不同实验有代表性的数据见图9(A-C)。全部三个IM病人的效应物明显识别已提及的LMP1肽(YLQQNWWTL(SEQ IDNO6))，与我们较早的发现这个肽被EBV特异性的CTLs识别相一致。更重要的是，这些IM病人还表现出强烈地识别用挑选的gp85或gp350肽致敏的靶细胞。令人感兴趣的是，每个个体对这些肽表现出独特的反应模式。IM病人SB对肽SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)(gp85)和VLQWASLAV(SEQ ID NO27)(gp350)表现出强烈反应(图9A)，而LP和MG的效应物识别预加载肽LMIIPLINY(SEQID NO20)(gp85)和VLQWASLAV(SEQ ID NO27)(gp350)的靶细胞(图9(B-C))，此外，病人LP的回体效应物还识别用Vacc.gp350和Vacc.gp85感染的靶细胞(图9D)。
gp85和gp350肽表位反应性CTLs的体外扩增上述数据清楚地表明gp85和gp350包含能够结合HLA A2分子并被IM病人回体效应物有效识别的CTL抗原决定簇。为了鉴定gp85或gp350反应性的CTLs在IM康复后能否检测到，两个供体SB和LP的PBMCs在IM后24-36月分别收集并被T2细胞刺激，T2细胞用每个表现出很强HLA A2结合的gp85和gp350的肽致敏。第18天，相对于肽致敏的自体RHA胚细胞检测这些CTL效应物。供体SB多克隆CTLs的代表性数据见图10，供体SB的CTL效应物仅仅对肽SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)和VLQWASLAV(SEQ ID NO27)表现出很强的反应性，但它们也识别其他两个gp85的肽LMIIPLINV(SEQ ID NO20)和TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)。供体LP也表现出相似的CTL溶解模式。因此，肽TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)是A2-阳性个体的记忆应答中EBV-特异性CTL识别的靶，但是这一应答在急性感染期间用回体效应物无法检测到。另一个需要强调的重点是我们用自体LCLs作刺激物，激活gp85或gp350特异性CTLs的尝试并不成功。这个结果并不令人惊奇，因为已经确知在隐性感染的B细胞中gp85或gp350抗原的表达极低。这些供体的LCL刺激的多克隆T细胞系对潜在抗原反应强烈(资料未显示)。该结果与我们的较早研究相一致，即健康病毒携带者的CTL应答通常由对潜在抗原的反应所决定(6)。用自体LCLs刺激后不能检测到gp85或gp350特异性的CTLs的另一种解释是这些应答仅构成健康的病毒携带者全部病毒特异性CTL应答中的一小部分。事实上，IM后供体SB和LP的gp350或gp85肽表位特异性的CTL前体的限制稀释检测表明前体频率＞1/50,000，而识别潜在抗原CTL表位的CTLs前体频率在1/4,000-1/15,000之间(资料未显示)。
用gp85和gp350肽表位免疫HLA A2/Kb小鼠诱导了特异性的CTL应答确定gp85和gp350包含CTL表位后，我们将研究扩展到探索用这些肽表位在体内诱导特异性CTL应答的可能性上。我们用HLAA2/Kb转基因小鼠作为实验模型以解决这一问题。小鼠表达由人A*0201等位基因α1和2区和小鼠H-2Kb I型分子α3区组成的嵌合I型分子。用在IFA中乳化的gp85或gp350的CTL表位与作为辅助的破伤风类毒素对这些动物进行皮下免疫。gp85的肽SLVIVTTFV(SEQID NO17)和TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)以及gp350的肽VLQWASLAV(SEQ ID NO27)被用于免疫。免疫两周后，用脾细胞或汇集的腹股沟淋巴结细胞作效应物检测每只小鼠特异性的CTL应答。图11(A-C)的数据表明gp85(SLVIVTTFV(SEQ IDNO17)和TLFIGSHVV(SEQ ID NO24))以及gp350(VLQWASLAV(SEQ ID NO27))的肽表位在脾细胞中诱导了很强的CTL应答。令人感兴趣的是，脾细胞内用肽TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)激活的CTLs一直表现出强烈的溶解靶作用，而肽SLVIVTTFV(SEQ IDNO17)和VLQWASLAV(SEQ ID NO27)免疫小鼠的脾细胞表现出可变的体外CTL溶解作用。我们还注意到腹股沟淋巴结汇集的淋巴细胞中很强的特异性的CTL活性(图11D)。
用gp85或gp350 CTL表位预先免疫HLA A2/Kb小鼠提供了保护抵抗重组痘苗病毒的侵袭用gp85或gp350 CTL表位肽免疫四周后，用107pfu编码gp85或gp350的重组痘苗病毒侵袭HLA A2/Kb小鼠。侵袭四天后，处死动物，用汇合CV1细胞上的空斑分析法在两个卵巢内检测痘苗效价。其中一个实验的数据见图12。用gp85和gp350表位免疫的动物，卵巢内的病毒很少甚至检测不到。而在未免疫小鼠中检测到高效价的痘苗病毒。保护效果与HLA A2/Kb转基因小鼠初次肽接种四周后、在收集的脾细胞和淋巴结细胞中检测到的、表位特异性CTL应答的强烈诱导相关。
讨论设计有效疫苗抗EBV的兴趣正逐渐增长，设计的疫苗不仅应限制健康个体内隐性感染B细胞的过量生长，而且应阻止许多EBV-相关的恶性肿瘤如伯基特淋巴瘤(BL)、鼻咽癌(NPC)和霍奇森病(HD)的发生。在西方社会，这类疫苗的首要目标是保护免遭IM。在这方面，病毒负载(大剂量口腔传输病毒和/或超越重要极限的病毒转化的B细胞的过量扩增)可能是患病风险的重要决定因素(7)。因而，能够阻止最初的EBV感染或者在初次感染期间能够大量降低EBV负载的疫苗对于转变临床症状应该是合适的。类似的疫苗还能够降低接受免疫抑制治疗的移植病人患淋巴组织增生病的直接风险。另一方面，EBV-相关的恶性肿瘤如BL、NPC和HD发生在病人初次感染若干年后，对远期效应的保护需要一种理想地提供消灭病毒免疫并阻止携带状态建立的疫苗。
EBV的结构抗原，主要是gp350，长期以来被视为EBV疫苗的潜在候选者。gp350是潜在疫苗候选者的提示最初建立在该糖蛋白是中和病毒抗体反应的主要靶这一结论的基础上(41)，设计用来诱导高效中和抗体的许多重组gp350的改造体，或作为亚单位抗原提呈或从重组病毒载体表达，在白顶狨体内表现出明显的保护作用抑制EBV一诱导的B细胞淋巴瘤(31)。然而，尽管近期的结果提示gp350特异性的CTLs在保护中的作用(34)，接种动物中和抗体的发生并不都显得与EBV感染的保护效果特定相关。如果后面的假设是正确的，鉴别EBV结构蛋白内潜在的CTL决定簇就十分重要，因为已经确证用病毒全蛋白免疫不能激发有效的CTL应答。此外，一个以CTL表位为基础的疫苗提供了包括不仅gp350还有其他结构抗原如gp85抗原决定簇的选择。为解决这个问题，我们使用了一种新方法成功地鉴定出gp350和gp85内HLA A2结合肽。在第一轮试验中，我们鉴定出gp350和gp85内的HLA A2结合肽，接下来的试验集中在带有HLA A2等位基因的IM病人上。用原来的回体效应物，我们观察到对三个不同的gp350和gp85肽的强烈反应。令人感兴趣的是，每个IM病人对每个肽表现出不同的反应模式。用病人SB的回体效应物观察到对肽SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)(gp85)和VLQWASLAV(SEQ ID NO27)(gp350)的强烈反应，而LP和MG的效应物识别预载LMIIPLINV(SEQ ID NO20)(gp85)和VLQWASLAV(SEQID NO27)(gp350)的靶细胞。更重要的是，病人LP的回体效应物还识别感染Vacc.gp350和Vacc.gp85的靶细胞。令人感兴趣的是，针对结构抗原表位的体外CTL溶解水平通常高于在同样的分析中观察到的对HLA A2-限制的潜在抗原CTL表位的溶解水平。这些结果与最近Steven及其同事的结论(42)一致，即与潜在抗原相比IM病人溶解抗原的CTL反应性明显较高。
在下一轮试验中，我们探索了在IM症状结束后的个体检测结构抗原特异性的CTL应答的可能性。跟踪分析在急性IM后24-36月进行，我们最初通过用自体的LCL刺激、从IM后的供体分离gp350-或gp85特异性CTLs的尝试并不成功。接着我们用负载肽的T2细胞作刺激物以产生gp350-或gp85特异性的CTLs，我们最近发表了该方法可被成功地用于产生低频率的EBV特异性的CTL前体(38)。刺激供体SB和LP的PBMC产生了对gp85和gp350 CTL表位强烈的CTL应答。供体SB和LP不仅对肽SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)、LMIIPLINV(SEQ ID NO20)和VLQWASLAV(SEQ ID NO27)显示出反应，还识别另一个gp85的肽TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)，值得注意的是两个供体对急性IM期间的TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)均未显示出体外的CTL反应。由这些分析得出的重要结论之一是急性IM康复后结构抗原的CTL前体明显减少，对潜在抗原的CTL反应占据了应答的优势。事实上，IM后供体SB和LP gp350或gp85肽表位特异性的CTL前体的限制稀释分析显示出＞1/50,000的频率，而潜在抗原内CTL表位的前体频率在1/4,000-1/15,000之间。
在IM病人中检测到对结构抗原很强的体外CTL应答对将来的疫苗设计有重要启示。正如上面提及的，迄今为止，基于EBV结构抗原的疫苗设计的大部分重点是产生强的中和抗体应答。然而，这些中和抗体应答没有与白顶狨体内抗EBV诱导的多克隆淋巴瘤的保护水平相关。但也可能是这种保护由结构抗原特异性的CTL应答介导。为解决该问题，我们采用一种实验动物模型系统以检测是否表达人HLAA2抗原的、用gp350或gp85 CTL表位免疫的转基因小鼠能够(a)产生结构抗原特异性的CTL应答并且(b)减少表达gp350或gp85抗原的重组痘苗病毒的感染。免疫后这些小鼠不仅显示出诱导了强烈的CTL应答，而且对病毒感染获得了很强的抵抗力。应该提及的是尽管实验没有得到任何以gp350和/或gp85 CTL表位为基础的疫苗在人体效率的确切结论，但它清楚地表明EBV结构抗原的CTL表位可被用作免疫原在体内诱导有效的CTL应答。而且，该方法还克服了用gp350或gp85全蛋白免疫的局限性，它们在激发人体的CTL应答方面可能无效。很明显，任何以表位为基础在人体接种的策励可能的障碍之一是HLA多态性，因为表位的选择是等位基因特异性的。然而，通过适当地混入合成的肽表位或者构建相关的肽序列线性连接在一起的载体来表达多肽，可以克服这个障碍。事实上，我们实验室较早的研究已经表明如果重组痘苗载体上这样的EBV多表位序列在细胞内表达，所有的组成表位都为CTL的识别有效提呈(43)，表明该方法作为疫苗策略的可能性。最近，一个鼠科动物模型的工作也表明结合在一个多表位结构的几个CTL表位中的每一个都能激发体内的CTL应答，并能保护动物免遭后来的侵袭(44)。长远地看，将EBV结构抗原的CTL表位与潜在的抗原表位相结合、产生一个融合两种不同抗原重要免疫原性决定簇的杂合蛋白从而设计有效疫苗是可能的。
在没有背离详细述及的本发明实质和范围的前提下，可对如具体的实施方案所显示的本发明作许多衍生和/或改变，这将被本领域的熟练人员所理解。因此，本文提供的实施方案应被视为描述性的而不是限制性的。
序列表<110>昆士兰医学研究所<120>来自EBV的CTL表位<130>91123<150>PO7841<151>1997-07-10<160>31<170>PatentIn Ver. 2.0SEQ ID NO1<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>1Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu1 5SEQ ID NO2<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>2Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe Trp Leu1 5SEQ ID NO3<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>3Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu Leu1 5SEQ ID NO4<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>4Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Asn Leu1 5SEQ ID NO5<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>5Trp Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ile Leu1 5SEQ ID NO6<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>6Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu1 5SEQ ID NO7<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>7Thr Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu1 5SEQ ID NO8<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>8Leu Leu Trp Leu Leu Leu Phe Leu Ala1 5SEQ ID NO9<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>9Ile Leu Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu1 5SEQ ID NO10<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>10Val Leu Phe Ile Phe Gly Cys Leu Leu1 5SEQ ID NO11<211>9<212>PRT<213> Epstein Barr Virus<400>11Arg Leu Gly Ala Thr Ile Trp Gln Leu1 5SEQ ID NO12<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>12Phe Leu Met Gly Thr Tyr Lys Arg Val1 5SEQ ID NO13<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>13Trp Leu Ala Lys Ser Phe Phe Glu Leu1 5SEQ ID NO14<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>14Gly Leu Tyr Glu Glu Arg Ala His Val1 5SEQ ID NO15<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>15Ile Leu Tyr Phe Ile Ala Phe Ala Leu1 5SEQ ID NO16<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>16Gln Leu Leu Cys Val Phe Cys Leu Val1 5SEQ ID NO17<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>17Ser Leu Val Ile Val Thr Thr Phe Val1 5SEQ ID NO18<211>9<212>RRT<213>Epstein Barr Virus<400>18Val Leu Ala Ile Ile Leu Tyr Phe Ile1 5SEQ ID NO19<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr virus<400>19Ile Ile Leu Tyr Phe Ile Ala Phe Ala1 5SEQ ID NO20<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>20Leu Mat Ile Ile Pro Leu Ile Ash Val1 5SEQ ID NO21<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>21Met Gln Leu Leu Cys Val Phe Cys Leu1 5SEQ ID NO22<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>22Phe Cys Leu Val Leu Leu Trp Glu Val1 5SEQ ID NO23<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>23Tyr Leu Leu Leu Thr Thr Asn Gly Thr1 5SEQ ID NO24<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>24Thr Leu Phe Ile Gly Ser His Val Val1 5SEQ ID NO25<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>25Val Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Val1 5SEQ ID NO26<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>26Leu Ile Pro Glu Thr Val Pro Tyr Ile1 5SEQ ID NO27<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>27Val Leu Gln Trp Ala Ser Leu Ala Val1 5SEQ ID NO28<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>28Leu Leu Leu Leu Val Met Ala Asp Cys1 5SEQ ID NO29<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>29Gln Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Val1 5SEQ ID NO30<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>30Met Leu Val Leu Gln Trp Ala Ser Leu1 5SEQ ID NO31<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>31Thr Leu Leu Leu Leu Leu Val Met Ala1 5SEQ ID NO32<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>32Tyr Phe Leu Glu Ile Leu Trp Gly Leu1 5SEQ ID NO33<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>33Tyr Leu Leu Glu Ile Leu Trp Arg Leu1 5
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权利要求
1.一种细胞毒性Epstein-Barr病毒(EBV)T细胞表位，所述表位来自一个EBV结构抗原。
2.如权利要求1所述的细胞毒性EBV T细胞表位，其中EBV结构抗原是gp85或gp350。
3.一种细胞毒性T细胞表位，所述表位选自由YLLEMWRL(SEQID NO1)，YFLEILWGL(SEQ ID NO32)，YLLEILWRL(SEQ IDNO33)，YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)，LLLALLFWL(SEQ IDNO2)，LLVDLLWLL(SEQ ID NO3)，LLLIALWNL(SEQ ID NO4)，WLLLFLAIL(SEQ ID NO5)，TLLVDLLWL(SEQ ID NO7)，LLWLLLFLA(SEQ ID NO8)，ILLIIALYL(SEQ ID NO9)，VLFIFGCLL(SEQ ID NO10)，RLGATIWQL(SEQ ID NO11)，ILYFIAFAL(SEQ ID NO15)，SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)，LMIIPLINV(SEQ ID NO20)，TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)，LIPETVPYI(SEQ ID NO26)，VLQWASLAV(SEQ ID NO27)，和QLTPHTKAV(SEQ ID NO29)组成的组。
4.包含如权利要求1或2所述的细胞毒性Epstein-Barr病毒(EBV)T细胞表位的亚单位疫苗。
5.包含至少一个选自如下一组的T细胞表位的亚单位疫苗，所述的组由YLLEMWRL(SEQ ID NO1)，YFLEILWGL(SEQ ID NO32)，YLLEILWRL(SEQ ID NO33)，YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)，LLLALLFWL(SEQ ID NO2)，LLVDLLWLL(SEQ ID NO3)，LLLIALWNL(SEQ ID NO4)，WLLLFLAIL(SEQ ID NO5)，TLLVDLLWL(SEQ ID NO7)，LLWLLLFLA(SEQ ID NO8)，ILLIIALYL(SEQ ID NO9)，VLFIFGCLL(SEQ ID NO10)，RLGATIWQL(SEQ ID NO11)，ILYFIAFAL(SEQ ID NO15)，SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)，LMIIPLINV(SEQ ID NO20)，TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)，LIPETVPYI(SEQ ID NO26)，VLQWASLAV(SEQ ID NO27)，和QLTPHTKAV(SEQ ID NO29)组成。
6.如权利要求5所述的亚单位疫苗，其中所述表位选自由YLLEMWRL(SEQ ID NO1)，YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)，YFLEILWGL(SEQ ID NO32)，YLLEILWRL(SEQ ID NO33)，SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)，LMIIPLINV(SEQ ID NO20)，TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)和VLQWASLAV(SEQ ID NO27)，组成的组。
7.如权利要求4-6任意一项所述的亚单位疫苗，其中所述疫苗除包含至少一个细胞毒性T细胞表位外，还包含至少一个引起个体记忆性应答的抗原。
8.如权利要求7所述的亚单位疫苗，其中所述的至少一个抗原选自由破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳杆菌抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、纯化的蛋白衍生物(PPD)、gp350蛋白，辅助表位及其组合组成的组。
9.如权利要求8所述的亚单位疫苗，其中所述的至少一个抗原是破伤风类毒素。
10.如权利要求4-9任意一项所述的亚单位疫苗，其中所述疫苗包含一种“油包水”配制品。
11.编码如权利要求1或2所述的细胞毒性Epstein-Barr病毒(EBV)T细胞表位的分离的核酸序列。
12.编码至少一个选自如下一组的细胞毒性T细胞表位的核酸序列，所述的组由YLLEMWRL(SEQ ID NO1)，YFLEILWGL(SEQID NO32)，YLLEILWRL(SEQ ID NO33)，YLQQNWWTL(SEQID NO6)，LLLALLFWL(SEQ ID NO2)，LLVDLLWLL(SEQ IDNO3)，LLLIALWNL(SEQ ID NO4)，WLLLFLAIL(SEQ ID NO5)，TLLVDLLWL(SEQ ID NO7)，LLWLLLFLA(SEQ ID NO8)，ILLIIALYL(SEQ ID NO9)，VLFIFGCLL(SEQ ID NO10)，RLGATIWQL(SEQ ID NO11)，ILYFIAFAL(SEQ ID NO15)，SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)，LMIIPLINV(SEQ ID NO20)，TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)，LIPETVPYI(SEQ ID NO26)，VLQWASLAV(SEQ ID NO27)，和QLTPHTKAV(SEQ ID NO29)组成的组。
13.如权利要求12所述的分离的核酸序列，其中所述表位选自由一种细胞毒性T细胞表位，所述表位选自由YLLEMWRL(SEQ IDNO1)，YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)，YFLEILWGL(SEQ ID NO32)，YLLEILWRL(SEQ ID NO33)，SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)，LMIIPLINV(SEQ ID NO20)，TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)，和VLQWASLAV(SEQ ID NO27)组成的组。
14.包含如权利要求11-13任一项所述的核酸序列的载体。
15.如权利要求14所述的载体，其中所述的载体是细菌，优选沙门氏菌。
16.如权利要求14所述的载体，其中所述载体是病毒，优选腺病毒、逆转录病毒或痘苗，最优选修饰的安卡拉痘苗。
17.分离的多肽，所述多肽包含至少一个如权利要求1-3任意一项所述的EBV CTL表位。
18.一种用于诱导个体CTLs的组合物的制备方法，所述方法包括将至少一个权利要求1-3任一项所述的表位与至少一种药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂混合。
19.一种降低个体EBV感染风险的方法，所述方法包括对个体施用有效量的(1)至少一个如权利要求1-3任意一项所述的CTL表位；(2)如权利要求4-10任意一项所述的亚单位疫苗；(3)如权利要求11-13任意一项所述的核酸序列；(4)如权利要求14-16任意一项所述的载体；或(5)如权利要求17所述的多肽。
20.一种治疗或防止个体患鼻咽癌或霍奇森病的方法，所述方法包括对个体施用有效量的、至少一个来自EBV结构抗原或潜在抗原的CTL表位。
21.如权利要求20所述的方法，其中EBV结构抗原是gp85或gp350。
22.如权利要求20所述的方法，其中EBV潜在抗原是LMP1或LMP2。
23.如权利要求20所述的方法，其中给予个体至少一个选自由YLLEMWRL(SEQ ID NO1)，YFLEILWGL(SEQ ID NO32)，YLLEILWRL(SEQ ID NO33)，YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)，LLLALLFWL(SEQ ID NO2)，LLVDLLWLL(SEQ ID NO3)，LLLIALWNL(SEQ ID NO4)，WLLLFLAIL(SEQ ID NO5)，TLLVDLLWL(SEQ ID NO7)，LLWLLLFLA(SEQ ID NO8)，ILLIIALYL(SEQ ID NO9)，VLFIFGCLL(SEQ ID NO10)，RLGATIWQL(SEQ ID NO11)，ILYFIAFAL(SEQ ID NO15)，SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)，LMIIPLINV(SEQ ID NO20)，TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)，LIPETVPYI(SEQ ID NO26)，VLQWASLAV(SEQ ID NO27)，和QLTPHTKAV(SEQ ID NO29)组成的组的CTL表位。
24.一种治疗或预防需治疗的个体体内NPC细胞生长的方法，所述方法包括对个体施用至少一个来自EBV结构抗原或潜在抗原的CTL表位。
25.如权利要求24所述的方法，其中EBV结构抗原是gp85或gp350。
26.如权利要求24所述的方法，其中EBV潜在抗原是LMP1或LMP2。
27.如权利要求27所述的方法，其中给予个体至少一个选自由YLLEMWRL(SEQ ID NO1)，YFLEILWGL(SEQ ID NO32)，YLLEILWRL(SEQ ID NO33)，YLQQNWWTL(SEQ ID NO6)，LLLALLFWL(SEQ ID NO2)，LLVDLLWLL(SEQ ID NO3)，LLLIALWNL(SEQ ID NO4)，WLLLFLAIL(SEQ ID NO5)，TLLVDLLWL(SEQ ID NO7)，LLWLLLFLA(SEQ ID NO8)，ILLIIALYL(SEQ ID NO9)，VLFIFGCLL(SEQ ID NO10)，RLGATIWQL(SEQ ID NO11)，ILYFIAFAL(SEQ ID NO15)，SLVIVTTFV(SEQ ID NO17)，LMIIPLINV(SEQ ID NO20)，TLFIGSHVV(SEQ ID NO24)，LIPETVPYI(SEQ ID NO26)，VLQWASLAV(SEQ ID NO27)，和QLTPHTKAV(SEQ ID NO29)组成的组的CTL表位。
28.一种治疗或预防第一个个体NPC或HD细胞生长的方法，所述方法包括将识别NPC或HD细胞的、EBV特异性的CTLs移入第一个个体体内。
29.如权利要求28所述的方法，其中EBV特异性的CTLs通过暴露于EBV的CTL表位，体外刺激CTLs的方法从第一个个体得到。
30.如权利要求28所述的方法，其中EBV特异性的CTLs从第二个个体得到，第二个个体感染了EBV但没有患NPC或HD。
31.如权利要求26所述的方法，其中EBV特异性的CTLs是LMP1和/或LMP2特异性的CTLs。
32.一种降低个体患传染性单核细胞增多症或移植后淋巴组织增生症的方法，所述方法包括对个体施用有效量的(1)至少一个如权利要求1-3任意一项所述的CTL表位；(2)如权利要求4-10任意一项所述的亚单位疫苗；(3)如权利要求11-13任意一项所述的核酸序列；(4)如权利要求14-16任意一项所述的载体；或(5)如权利要求17所述的多肽。
全文摘要
本发明提供了来自EBV结构抗原的细胞毒性Epstein－Barr病毒(EBV)T细胞表位。优选的表位包括YLLEMLWRL(SEQ ID NO:1),YFLEILWGL(SEQ ID NO:32),YLLEILWRL(SEQ ID NO:33),YLQQNWWTL(SEQ ID NO:6),LLLALLFWL(SEQ ID NO:2),LLVDLLWLL(SEQ ID NO:3),LLLIALWNL(SEQ ID NO:4),WLLLFLAIL(SEQ ID NO:5),TLLVDLLWL(SEQ ID NO:7),LLWLLLFLA(SEQ ID NO:8),ILLIIALYL(SEQ ID NO:9),VLFIFGCLL(SEQ ID NO:10),RLGATIWQL(SEQ ID NO:11),ILYFIAFAL(SEQ ID NO:15),SLVIVTTFV(SEQ ID NO:17),LMIIPLINV(SEQ ID NO:20),TLFIGSHVV(SEQ ID NO:24),LIPETVPYI(SEQ ID NO:26),VLQWASLAV(SEQ ID NO:27),QLTPHTKAV(SEQ ID NO:29),本发明还提供了治疗或防止个体EBV感染的方法,涉及施用EBV细胞毒性T细胞的表位。
文档编号A61K48/00GK1269804SQ98806992
公开日2000年10月11日 申请日期1998年7月10日 优先权日1997年7月10日
发明者斯科特·伦顿·伯罗斯, 拉吉夫·康纳, 马丁纳·艾利森·谢里特 申请人:昆士兰医学研究所理事会, 联邦科学技术研究组织, 墨尔本大学, 沃尔特和伊丽莎豪医学研究所, Csl有限公司