专利名称：促进脊髓组织损伤愈合的海绵材料其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及促进伤口，特别是脊髓组织损伤伤口愈合的海绵材料，其制备方法及其在促进组织损伤特别是脊髓组织损伤中的应用。
当人或动物身体遭受各种外科手术或其他原因导致的物理损伤时，常常造成软组织和/或骨组织及神经组织的破坏和断裂及缺损，并可造成出血和感染的机会。正常情况下，伤口可以自然愈合并修复。伤口愈合和修复的过程包括封闭伤口以限制血液流失并阻止感染；然后去除受损的组织并通过细胞吞噬作用消灭病原微生物；继之周围组织中各种类型的细胞侵入伤口部位并形成肉芽和瘢痕；最后重建瘢痕组织并改变细胞群体，以导致伤口的完全愈合。在大多数情况下，自然愈合过程是很有效的。然而，由于组织发生学上的原因，某些组织，特别是脊髓和/或外周神经组织，则很难甚至不能自然修复和愈合。在这种情况下，进行医疗干预将是十分必要的。
脊髓伤伤(SCI)占全身损伤的大约0.3％。一般说来，在由于身体坠落、建筑物坍塌和车祸等偶然事故的伤损中，脊髓损伤占有很高的比率。另外，由于骨拆和对创伤病人的不正常搬运也常常是继发或加重脊髓损伤的重要原因。
继发性脊髓损伤是原发性损伤激发的一系列病理因素参预的脊髓组织进行性自毁性破坏过程。赵立等人[中华创伤杂志1989,104(2):118.]总结SCI继发性损伤的机制包括(1)局部缺血；(2)生理膜的改变；(3)NO分子的作用。
临床上，创伤、外科手术、器官移植以及其他一些严重疾病过程对内脏器官的损伤作用及其后果已愈来愈受到人们的重视，并竟相开展有关其发生机制与防治的研究。一般说来，内脏器官由于其解剖部位的特殊性，传统治疗方法主要是通过输血输液抗氧化等措施进行保守治疗，一方面阻断脏器的进一步损伤病理生理过程中的某一环节，同时也为受损脏器的自我修复创造一个良好的外部环境[Xiao bing F,Huiming T,Dewen W,et al.J-Trauma,1996,40(3):135.]。但总的来讲，这些措施对已受损的内脏器官并没有主动的促进修复作用，其结果只能是等待受损脏器靠自身的新陈代谢而自愈。这种被动的修复方式不仅延长治疗时间，而且也易于导致一系列不良并发症，同时还加重了患者的心理与经济负担，对治疗极其不利。
迄今对SCI的治疗方法很多，但由于以下几方面原因而难以达到足够的治疗效果(1)对损伤神经元的量和质的正确判断；(2)保护损伤后残存的神经元免于坏死；(3)促进神经再生。虽然目前已有多种方法促进神经再生，如大网膜移植、神经移植等，但总体效果远不能令人满意。
80年代以来，有关生长因子对创伤修复作用的研究，使人们对现代创伤修复概念的认识发生了根本改变。一是修复的内涵已从单纯的体表创面修复扩展到内脏以至全身。二是通过人工干预创面愈合的自然过程可以得到某种程度的“促成”或“加速”效果。在这一认识的指导下，有关生长因子对创伤修复作用的研究已成为近10年来组织修复的热点[Pantone JC,Clinical inschemic syndromes,St.Louis:Maby,1995；137.付小兵，《生长因子与创伤修复》人民军医出版社，1991；1-133]NTF包括诸如NGF家族、CNTF、GDNF、BDNF、IGF、FGF等家族。其中研究得最早而且最深入的是神经生长因子(NGF)。该因子主要来源于唾液腺、前列腺、蛇毒腺、及胎盘组织，脑内胆硷能神经元支配区域等部位也能分泌NGF样物质。以往的研究认为，NGF能促进感觉神经元与交感神经元的存活，但对运动神经元则没有营养作用，不能促进脊髓运动神经元的存活。后来也有实验证实它在体外能促进神经细胞突出的生长，并有人用实验证实它对周围运动神经无效，但一直不能说明它对脊髓损伤后运动神经元有无修复作用。其他例如CNTF的临床试验已告失败。而另一种NTF即成纤维细胞生长因子(FGF)，特别是碱性FGF即FGF-2则日益受到人们的重视。
1939年，Trowell等，首次发现了NTF中的新成员FGF,Gospodawiez于1974年从牛脑垂体中分离并纯化了该因子。根据等电点(PI)的不同，又可将其分为酸性与碱性FGF(FGF-1,FGF-2)。FGF-1的PI为5.6，分子量为16KD,FGF-2的PI为9.6，分子量为18KD。两者结构相关性为50％，但活性相差很大，FGF-2比FGF-1活性高100倍。另外，两者的组织分布也不尽相同。
1992年，和中明生使用FGF-2异源抗体，以免疫组化法证实FGF-2在成熟的神经系统中的分布是固定的，并以神经细胞含量最高，特别是运动神经核细胞群含有较多的FGF-2。
FGF-2的靶细胞非常广泛，它对来源于中胚层及神经外胚层的细胞如血管内皮细胞、平滑肌细胞、软骨细胞、成纤维细胞；内分泌细胞，如leydig’s细胞、粒层细胞、肾上腺皮层细胞、垂体泌乳素细胞促甲状腺素细胞；神经细胞如星形胶质细胞、少突胶质细胞；中枢神经系统(CNS)神经元、视网膜与外周神经节的细胞等，均具有促有丝分裂活性(Doniach T.,Cell,1995,83:1067)。Hassen等人(ActaNeuropathol.Berl.,1994,87(4):405)的研究也表明，FGF-2存在于腰段脊髓神经元、神经胶质细胞、坐骨神经的雪旺氏细胞，朗飞氏结等处。这些细胞表面都有相应的受体、FGF-2对分子量为145KD的受体显示有更高的亲和性，并与FGF-1竞争同一受体。在损伤、低氧血、激素(TSH)、TGF-β等作用下，可增加靶细胞表面高亲和力受体数目，使FGF-2从相对低亲力受体转移至高亲和力受体，发挥其促进细胞分裂与再生效应。
FGF-2已被证明具有神经营养作用，可促进神经元的再生与存活，保护受损的神经元(Nakata N,et al.,Brain Res.,1993,605:354)。体外实验亦证明FGF-2能促进神经元存活与生长,且其效应与剂量相关(Morrison RS,et al.,PNAS,1996，88:7537)。究其机制已有实验证明bFGF在动物体内可改变一些神经递质的合成,拮抗兴奋性氨基酸(excitorary amino acids,EAA)对神经元的毒害作用，阻止EAA介导的Ca++内流作用，从而可阻断恶性循环，保护受损神经元(Mattson MP,et al.,J.Nourosci.,1993,13:4575)。
FGF又是一种趋化因子，对内皮细胞，成纤维细胞，星型胶质细胞均有趋化作用，提示FGF-2在局部缺血性损伤的修复方面具有广泛的临床应用价值，特别是对抑制SCI后继发性损伤具有重要意义。另外，FGF-2能抑制疤痕疙瘩与正常成纤维细胞的胶质合成，并刺激胶原酶的表达(Edwards DR et al.,MEBD J.1987,6:1899)，若在SCI中亦有此种作用，则可大大促进再生的神经纤维通过损伤区、防止永久性疤痕及瘫痪的发生。
FGF是与神经系统发育密切相关的重要诱导因子，FGF-2对神经细胞兼有促形态发生与促有丝分裂作用，故具有提高神经元的成活率，诱导轴突向外生长等功能，是维持前脑基底部胆碱能神经元正常生存的因素之一(Hoffman R.,Biochem.Pharmacol.,1993,45(11):2348)。
已有实验证明，SCI后FGF-2受体表达增加。Richard-Baffour等人(J.Neurosurg.,1995,83:105)采用钳夹大鼠胸1脊髓(T1)制成动物模型，并于皮下植入给药泵，对患处局部滴加FGF-2，分别于术后1、2、3、4周进行大鼠后肢联合行为评分及病理学观察，结果显示FGF-2与甲基强的松龙(MP)具有剂量依赖性协同作用。
综上所述，局部投用FGF特别是FGF-2在治疗SCI中具有很重要的潜在价值。然而，尽管FGF等具有组织损伤修复和伤口愈合促进活性的蛋白质物质可适用治疗各种组织创伤，特别是SCI，但如果不借助适当的局部投药载体，使这些治疗药物以有效剂量长时间持续地释放到损伤部位，则很难发挥其有效治疗作用。
本发明提供一种促进脊髓损伤修复的海绵材料，其特征在于该材料由胶原蛋白或胶原蛋白与甲壳素的混合物组成，并含有治疗有效量的选自成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、神经生长因子和结缔组织生长因子的一种或多种生长因子。
根据本发明的一个优选实施方案，其中优选的生长因子是成纤维细胞生长因子-2和神经生长因子。
本发明还提供生产如上文限定的海绵材料的方法，该方法包括将新鲜制备的治疗组织创伤有效量的生长因子的水溶液混入粘度约为100,000cps的胶原蛋白或胶原蛋白与甲壳素的混合物基质中，按适当体积分散于适当的容器内进行冷冻干燥，以得到所说的海绵材料。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的胶原蛋白与甲壳素混合物基质中，两种成分的比例为10∶1至1∶10。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说生长因子是成纤维细胞生长因子-2和神经生长因子。
本发明进一步提供如上文限定的海绵材料作为治疗脊髓损伤及相关物理损伤的药用敷料的应用。
本发明提供一种用于促进脊髓损伤修复的海绵状伤口覆盖材料，其特征在于该材料由胶原蛋白基质组成，并含有选自成纤维细胞生长因子、表面生长因子、神经生长因子、结缔组织生长因子的一种或多种生长因子。
根据本发明的一优选实施方案，其中所说的生长因子最好是成纤维细胞生长因子-2和神经生长因子。
用于制备本发明促进脊髓和其他组织损伤修复的组织修复海绵中，所使用的胶原蛋白可以选自Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅹ型等特殊类型的胶原蛋白。本发明优选的是从牛肌腱中提取的，或从人胎盘组织中提取的胶原蛋白，但特别优选的是从人胎盘中提取的人胶原蛋白。对于某些对异源蛋白质有排斥反应的高敏感个体，最好使用人胶原蛋白。胶原蛋白可促进伤口出血部位的血小板聚集，进而加速凝血过程，发挥凝血促进功能。另外，胶原蛋白还具有成纤维细胞生长促进活性，因而也具有伤口愈合促进作用。再者，已经发现，从哺乳动物和人软骨组织中提取的Ⅱ型软骨胶原蛋白具有诱导血管生成活性[参见WO97/44059]，因此可在本发明的总胶原蛋白及基质中加入适当比例的Ⅱ型软骨胶原蛋白，以利于伤口或创面局部的血管生成和血液供应。
在本发明的用于促进伤口愈合和组织修复的胶原蛋白海绵中还可加入除FGF-2以外的其他生长因子，这些因子包括但不只限于表皮生长因子(EGF)、结缔组织生长因子(CTGF)和神经生长因子(NGF)。有关这些生长因子的生物学活性，已有大量的基础研究和临床应用研究的报导。这些生长因子的加入量一般约为每平方厘米10ug至10mg，实际加入量将依据创伤的严重程度，病人的年龄和体质，以及所说的生长因子的活性维持时间而定。
为了制备本发明的促进伤口组织修复和愈合的海绵，首先按常规方法制备有一定粘度，例如粘度约为50.000至150,000cps的胶原蛋白凝胶，然后按适当比例加入上述生长因子并在机械搅拌下混合均匀。将所说的混有生长因子溶液的胶原蛋白凝胶均匀地铺敷在浅盘内(厚度约为5-12mm)，然后进行常规冻冷干燥处理或在大约60℃下风干处理，直到其中含水量低于20％。可根据使用目的、伤口部位及损伤面积的不同，在无菌条件下将冻干处理的海绵切成适当大小，并无菌封装于透明或半透明的聚氨酯或铝铂包装材料内。包装后，用10-30KGy的β或γ射线(如钴60)照射，以对所得产品进行整体灭菌处理。
下列实施例旨在进一步举例说明本发明的促进脊髓组织损伤愈合的海绵的制备方法和治疗脊髓损伤的临床适用性。这些实施例不以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。
实施例1含生长因子海绵的制备将新鲜牛肌腱(1kg)用组织粉碎机切碎，然后于室温下制成组织匀浆。按每克牛肌腱组织匀浆10单位的量，加入胃蛋白酶混匀，于37℃保温4小时，然后常规方法过滤除菌。收集过滤除菌后的经蛋白酶消化的匀浆并加入适当量的重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh FGF-2)(由暨南大学生物工程研究所提供)和神经生长因子(NGF)(由军事医学科学院提供)，并充分混合均匀。
将所得到的含FGF-2和NGF的牛肌腱组织匀浆(粘度约100,000cps)倒入无菌浅盘内，按常规方法冻冷干燥约20小时，得到冻干的海绵状材料。根据使用目的将所得海绵切割成3×3×10mm大小。所得海绵材料每片含FGF-2约为10单位，含NGF约为50单位(≤0.5ug)。
无菌条件下，用聚氨酯膜密封包装后，用大约25kGy的β射线照射约15秒钟，然后于4℃下储存备用。
实施例2含FGF-2和NGF的胶原蛋白海绵的脊髓损伤修复作用将体重约为170-200g的小白鼠随机分成4组，每组10只动物。用7％水合氯醛经腹腔注射(0.5mg/100g体重)对动物进行全身麻醉。麻醉后，固定动物，以T10棘突为中心切开背部皮肤，暴露并确认T10椎板。显微物下剪开并完整取出T10两侧椎板。然后用显微手术剪剪开T10脊髓右侧硬膜，并向两侧牵拉硬膜以保证待植入的海绵与脊髓有较大的接触面积。然后沿着脊髓后正中静脉右缘将细尖手术刀片刺入抵达骨组织，将刀片划向右侧以横向切断右半侧脊髓，并将按实施例1所述方法制备的海绵贴合在脊髓切口表面上。最后无菌缝合伤口。
四组动物中，第Ⅰ组为半切T10部位脊髓并贴敷胶原蛋白海绵(每片含有6ugFGF-2和50单位NGF)组，第Ⅱ组为半切T10部位脊髓，但未贴敷胶原蛋白海绵组，第Ⅲ组为半切T10部位脊髓，但只贴敷不含FGF-2和NGF的空胶原蛋白海绵组；第Ⅳ组为只切除椎板，但未切断脊髓的假手术组。
手术成功的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组动物术后均表现右后肢保留痛觉反射，但运动时右后肢拖于身后，即几乎完全丧失了运动功能。
手术后第1至4周，每周按刘建华等人(bFGF对大鼠脊髓前菌运动神经元的保护作用，暨南大学学报，998；19(4):1)所述方法对动物进行CBS功能评价。评价包括置脚反射以外的所有六项指标。结果可见，手术后第一周，第Ⅰ组与Ⅱ和Ⅲ组间无明显差异(P+0.004和0.000)；第二周时，第Ⅰ与第Ⅱ和Ⅲ组差异性十分显著(P=0.434和0.572)。
动物行为观察结果显示，动物右后肢可见有明显的运动能力改善。因此，本实验的结果可以初步证明，使用本发明的含有FGF-和NGF的胶原蛋白海绵贴敷脊髓损伤伤口，可有效地在伤口局部缓慢释放并由组织吸收这些因子，从而达到有效地保护运动神经元，促进脊髓创伤局部细胞和纤维的再生与延伸，以恢复受损的神经功能的目的。
权利要求
1.一种促进脊髓损伤修复的海绵材料，其特征在于该材料由胶原蛋白或胶原蛋白与甲壳素的混合物组成，并含有治疗有效量的选自成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、神经生长因子和结缔组织生长因子的一种或多种生长因子。
2.根据权利要求1的海绵，其中所说的生长因子是成纤维细胞生长因子-2和神经生长因子。
3.生产权利要求1的海绵材料的方法，该方法包括将新鲜制备的治疗组织创伤有效量的生长因子的水溶液混入粘度约为100,000 cps的胶原蛋白或胶原蛋白与甲壳素的混合物基质中，按适当体积分散于适当的容器内进行冷冻干燥，以得到所说的海绵材料。
4.根据权利要求3的方法，其中所说的胶原蛋白与甲壳素混合物基质中，两种成分的比例为10∶1至1∶10。
5.根据本权利要求3的方法，其中所说生长因子是成纤维细胞生长因子-2和神经生长因子。
6.如权利要求1的海绵材料作为治疗脊髓损伤及相关物理损伤的药用敷料的应用。
全文摘要
本发明涉及含有一种或多种生长因子的,特别是含有成纤维细胞生长因子和神经生长因子的,具有促进伤口,特别是脊髓组织损伤伤口愈合活性的海绵材料,其制备方法及其在促进组织损伤特别是脊髓组织损伤中的应用。
文档编号A61K47/42GK1228339SQ9910058
公开日1999年9月15日 申请日期1999年2月4日 优先权日1999年2月4日
发明者李校坤, 洪岸, 付小兵, 林剑 申请人:李校坤